藤黃健骨膠囊通過SIRT1/NF-κB/NLRP3信號通路調節絕經后骨質疏松大鼠破骨細胞分化*

安方玉， 顏春魯， 孫柏， 汪春梅， 柳穎， 王霞霞， 馬海珍， 張蕊， 陳振東

（甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000）

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis， PMOP）是一種骨折發生率極高的常見骨病［1-2］。圍絕經期的女性由于卵巢功能下降使雌激素分泌急劇下降，而雌激素分泌急劇下降導致骨吸收加速和骨形成減少可能是誘發PMOP發生的關鍵病機［3-4］。

研究表明，沉默信息調節因子1（silent information regulator 1， SIRT1）能夠參與機體的骨代謝、自噬、細胞凋亡和衰老等生物學過程［5-6］。另有研究表明SIRT1具有類雌激素的作用，在多種骨系細胞（破骨細胞、成骨細胞和骨細胞等）中均有表達［7］，抑制SIRT1表達可以促進核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand， RANKL）誘導的骨髓巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages，BMM）向破骨細胞分化［8］，而破骨細胞祖細胞中的SIRT1還能夠通過抑制核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）活性來抑制其自身分化［9］。其他研究進一步發現，SIRT1對破骨細胞生成的抑制是通過NF-κB通路和氧化應激相互作用而介導的，這些途徑最終激活活化T細胞核因子胞漿1型（nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1）以誘導破骨細胞生成和破骨細胞融合。還有研究證明，NF-κB抑制劑顯著降低核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor protein 3， NLRP3）炎癥小體表達水平，緩解骨吸收［10］。上述研究提示SIRT1/NF-κB/NLRP3介導的破骨細胞分化可能是治療PMOP潛在靶點。

藤黃健骨膠囊［Tenghuang-Jiangu capsule， TJC；熟地黃、鹿銜草、骨碎補（燙）、肉蓯蓉、淫羊藿、雞血藤和萊菔子］具有補腎活血之功效。臨床研究發現，TJC通過提高PMOP患者的骨密度和抑制骨轉換來改善患者的中醫臨床癥狀積分，達到治療PMOP的目的，且臨床療效明顯［11-12］。也有研究報道，TJC可提高血鈣水平，還可降低血液黏稠度，抑制血小板聚集，從而提高骨密度，也可能通過降低破骨細胞的活性、功能抑制骨吸收、促進成骨細胞形成來治療骨質疏松癥、膝骨關節炎及腰椎間盤突出等疾病［13-15］。上述文獻結果證明TJC對PMOP有明確療效。基于此，我們提出如下假設：TJC可能通過抑制SIRT1/NF-κB/NLRP3信號通路來抑制PMOP的炎癥反應，進而來抑制破骨細胞分化，從而發揮對PMOP的潛在療效。因此，本研究通過建立PMOP大鼠模型，旨在探討TJC對PMOP大鼠SIRT1/NF-κB/NLRP3信號通路關鍵蛋白表達的影響及可能的分子機制。

材料和方法

1 動物

70只SPF級SD雌性大鼠，體質量（180±20） g，購自甘肅中醫藥大學科研實驗動物中心，許可證號為SCXK（甘）2020-0001。飼養于甘肅中醫藥大學動物實驗中心SPF級實驗室，實驗過程中所有動物均自由飲水、攝食。

2 主要試劑

戊酸雌二醇（estradiol valerate， ESV）片購自拜耳醫藥保健有限公司；TJC購自甘肅省西峰制藥有限公司；SIRT1抑制劑EX-527購自MedChemExpress；SIRT1兔單克隆抗體購自Abcam；NF-κB p65兔單克隆抗體購自GeneTex；NLRP3兔單克隆抗體和GAPDH兔單克隆抗體購自Immunoway；NFATc1兔單克隆抗體購自Abclonal；ECL化學發光顯色試劑盒購自YEASEN；白細胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）ELISA試劑盒、IL-18 ELISA試劑盒和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α） ELISA試劑盒購自FEIYA。

3 主要方法

3.1 實驗動物分組及給藥 選取60只SPF級SD雌性大鼠，適應性飼養1周，隨機分為假手術組（sham組）、模型組［卵巢切除術（ovariectomy， OVX）組］、SIRT1抑制劑組（EX-527+OVX組）、陽性藥物對照組（ESV+OVX組）、高劑量（0.36 g/kg）TJC（high-dose TJC， TJC-H）組、中劑量（0.18 g/kg）TJC（mediumdose TJC， TJC-M）組和低劑量（0.09 g/kg）TJC（lowdose TJC， TJC-L）組，每組10只。大鼠麻醉后，采取俯臥位，備皮后消毒手術區皮膚；沿背部后正中線作縱形切口長約1.0~1.5 cm，在乳白色的脂肪團中找到卵巢，結扎子宮角后摘除卵巢，然后傷口逐層縫合，同樣方式切除對側卵巢，而sham組大鼠只切卵巢附近白色脂肪組織，注意術后保溫［16］。造模8周后，ESV+OVX組給予ESV片（0.09 mg/kg）灌胃治療，TJC-H+OVX組、TJC-M+OVX組和TJC-L+OVX組給予TJC（0.36、0.18和0.09 g/kg）灌胃治療，sham組和OVX組給予等體積蒸餾水，EX-527+OVX組給予等體積蒸餾水并腹腔注射1 mg/kg EX-527［17］，每日1次，連續8周［18］。給藥結束后進行股動脈取血，離心血清，處死大鼠，進行標本采集，部分股骨組織用4%多聚甲醛固定液固定，部分股骨組織于-80 ℃冰箱凍存、備用。

3.2 實驗大鼠一般狀態及體重的觀察 觀察并記錄各組大鼠的飲水進食、活動情況、精神狀態、毛色變化等一般情況，定期稱重并記錄大鼠體重。

3.3 ELISA法檢測血清中炎癥因子的含量 將采集的股動脈血靜置2 h后再置于冰箱4 ℃過夜，1 500~2 000 r/min離心5 min，取上清測定血清IL-1β、IL-18和TNF-α水平變化。根據IL-1β、IL-18和TNF-α大鼠ELISA檢測試劑盒說明書，首先分別設置空白孔（不加樣品和酶標記試劑）、標準孔（標準品50 μL）和樣品孔（樣品10 μL+樣品稀釋劑40 μL），37 ℃恒溫箱中恒溫孵育30 min并洗滌，然后每孔加入50 μL酶標試劑，37 ℃恒溫箱中再次恒溫孵育30 min并洗滌并洗滌，每孔均加入顯色劑A（50 μL）和顯色劑B（50 μL），37 ℃恒溫箱內避光孵育10 min后加入終止液（50 μL），450 nm波長處檢測各孔的吸光度（A值）。依據標準品繪制出標準曲線，再根據標準曲線和A值算出IL-1β、IL-18和TNF-α的含量。

3.4 雙重免疫熒光觀察破骨細胞中SIRT1、NF-κB p65和NLRP3蛋白表達 TRAP為破骨細胞特異性標志物，故采用雙重免疫熒光雙染的方法分別檢測各組大鼠股骨組織中TRAP蛋白分別與SIRT1、NF-κB p65和NLRP3蛋白共表達的情況，來反映破骨細胞中SIRT1、NF-κB、NLRP3蛋白的表達，具體操作方法如下：3%的H2O2避光10 min，PBS-Triton洗3次，每次3 min；100 mmol甘氨酸中和15 min，PBS-Triton洗3次，每次3 min；滴加封閉液，室溫封閉1 h；棄去封閉液后，在切片組織上同時滴加TRAP抗體（1∶100）和SIRT1（1∶100）/NF-κB p65（1∶500）/NLRP3（1∶200）抗體后4 ℃孵育過夜；用PBS-Triton洗3次，每次3 min，在切片組織上滴加Ⅱ抗，室溫避光孵育l h，再用PBS-Triton洗3次，每次3 min；然后用DAPI染核3 min，再用PBS-Triton洗3次，每次3 min；最后用抗熒光淬滅劑封片；熒光倒置掃描顯微鏡觀察并拍照，ImageJ分析數據。TRAP呈綠色，SIRT1/NF-κB p65/NLRP3呈紅色，DAPI細胞核呈藍色，雙染的共定位陽性細胞經疊加后呈黃色。

3.5 RT-qPCR檢測股骨組織中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA表達 往100 mg大鼠股骨組織中加入Trizol試劑以制備RNA，逆轉錄試劑盒合成cDNA，在7500型實時PCR系統上使用實時熒光定量試劑盒進行RT-qPCR。PCR擴增條件設置為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循環40次。根據各組Ct值，通過2-ΔΔCt計算各組mRNA相對表達量，重復3次。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

3.6 Western blot檢測股骨組織中各組NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的蛋白表達 往100 mg大鼠股骨組織加入蛋白裂解液提取其總蛋白，后用BCA法測濃度，繼之間上述蛋白樣品進行電泳、轉膜、封閉及加入Ⅰ抗（NF-κB p65、NLRP3和NFATc1抗體）搖床上孵育過夜，孵育條件設置為4 ℃；次日TBST洗膜后加入Ⅱ抗孵育，孵育條件設置為37 ℃ 1 h；TBST洗膜后按1∶1的比例在PVDF膜上滴加顯影液，用凝膠成像分析系統拍照。用ImageJ軟件進行處理與分析。

4 統計學處理

用GraphPad Prism 9軟件進行統計分析。數據以均數±標準差（mean±SD）表示。符合正態分布和方差齊性檢驗的數據選擇單因素方差分析；不符合正態檢驗條件的數據采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1 TJC對PMOP大鼠一般狀況和體重的影響

造模8周后（首次給藥前），sham組飲食飲水如常，活動如常，反應靈敏，毛色光亮；OVX、EX-527+OVX、ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJCL+OVX組大鼠進食飲水頻繁、活動頻率降低、反應欠靈敏（如抓取時）、墊料更換后浸濕速度增快。造模16周后（TJC干預8周后即末次給藥后），sham組飲食飲水如常，活動如常，反應靈敏，毛色光亮；OVX、EX-527+OVX、ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX組大鼠活動頻率明顯減少，其中OVX、EX-527+OVX和TJC-L+OVX組大鼠毛發欠光澤、部分大鼠頸部背側毛發出現脫落，ESV+OVX、TJC-H+OVX和TJC-M+OVX組大鼠反應較好，毛發無明顯脫落，進食量和飲水量飲水量稍有減少，尤以ESV+OVX組及TJC-H+OVX組大鼠上述一般狀況的改善程度最為明顯。

造模8周后（首次給藥前），與sham組相比，OVX、EX-527+OVX、ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJCM+OVX和TJC-L+OVX組大鼠體重均顯著增加（P<0.05）。造模16周后（TJC干預8周后即末次給藥后），與sham組相比，OVX和EX-527+OVX組大鼠體重顯著增加（P<0.05）；與OVX組相比，ESV+OVX和TJC-H+OVX組大鼠體重均顯著降低（P<0.05）；與EX-527+OVX組相比，ESV+OVX、TJC-H+OVX和TJC-M+OVX組大鼠體重均顯著降低（P<0.05）。見圖1。

Figure 1. Body weight changes of the rats in each group. Mean±SD. n=10. △P<0.05， △△P<0.01 vs sham group； *P<0.05， **P<0.01 vs OVX group； ▲P<0.05， ▲▲P<0.01 vs EX-527+OVX group.圖1 各組大鼠體重變化結果

2 TJC對PMOP大鼠炎癥因子含量的影響

與sham組相比，OVX和EX-527+OVX組大鼠血清IL-1β、IL-18和TNF-α含量顯著增加（P<0.01）；與OVX組相比，ESV+OVX和TJC-H+OVX組大鼠血清IL-1β含量顯著降低，ESV+OVX、TJC-H+OVX和TJCM+OVX組大鼠血清IL-18含量顯著降低，ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX組大鼠血清TNF-α含量顯著降低（P<0.05）；與EX-527+OVX組相比，ESV+OVX、TJC-H+OVX和TJC-M+OVX組大鼠血清IL-1β和IL-18含量顯著降低，ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX組大鼠血清TNF-α含量也顯著降低（P<0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清炎癥因子含量變化比較Table 2. Comparison of serum content of inflammatory factors in each group （Mean±SD. n=10）

3 TJC對PMOP大鼠破骨細胞SIRT1、NF-κB p65和NLRP3熒光表達強度的影響

與sham組相比，OVX和EX-527+OVX組大鼠破骨細胞中SIRT1表達熒光面積顯著降低，而NF-κB p65和NLRP3表達熒光面積顯著升高（P<0.01）；與OVX組相比，ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX組大鼠破骨細胞中SIRT1表達熒光面積顯著升高，而NF-κB p65和NLRP3表達熒光面積顯著降低（P<0.01）；與EX-527+OVX組相比，ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX組大鼠破骨細胞中SIRT1表達熒光面積顯著升高，而NF-κB p65和NLRP3表達熒光面積顯著降低（P<0.01），見圖2。

Figure 2. Immunofluorescence intensity changes of SIRT1， NF-κB p65 and NLRP3 in the osteoclast of each group. The scale bar=50 μm. Mean±SD. n=3. △△P<0.01 vs sham group； **P<0.01 vs OVX group； ▲▲P<0.01 vs EX-527+OVX group.圖2 各組大鼠破骨細胞中SIRT1、NF-κB p65和NLRP3免疫熒光強度變化

4 TJC對PMOP大鼠股骨組織NF-κB p65、NLRP3和NFATc1 mRNA表達的影響

與sham組相比，OVX和EX-527+OVX組股骨組織中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA表達水平顯著升高（P<0.01）；與OVX組相比，ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX組NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA表達水平顯著降低（P<0.01）；與EX-527組相比，ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX組NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA表達水平顯著降低（P<0.01），見圖3。

Figure 3. The mRNA expression of NF-κB p65， NLRP3 and NFATc1 in the femoral tissue of each group. Mean±SD. n=3. △△P<0.01 vs sham group； **P<0.01 vs OVX group； ▲▲P<0.01 vs EX-527+OVX group.圖3 各組大鼠股骨組織中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1 mRNA表達變化結果

5 TJC對PMOP大鼠股骨組織NF-κB p65、NLRP3和NFATc1蛋白表達的影響

與sham組相比，OVX組和EX-527+OVX組股骨組織中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1蛋白表達明顯升高（P<0.01）；與OVX組相比，ESV+OVX組和TJCH+OVX組NLRP3蛋白表達明顯降低，ESV+OVX組和TJC-H+OVX、TJC-M+OVX組NF-κB p65和NFATc1蛋白表達也均明顯降低（P<0.05）；與EX-527+OVX組相比，ESV+OVX組和TJC-H+OVX NLRP3蛋白表達明顯降低，ESV+OVX組和TJC-H+OVX、TJC-M+OVX組NF-κB p65和NFATc1蛋白表達也均明顯降低（P<0.05），見圖4。

Figure 4. The protein expression of NF-κB p65， NLRP3 and NFATc1 in the femoral tissue of each group. Mean±SD. n=3. △△P<0.01 vs sham group； *P<0.05， **P<0.01 vs OVX group； ▲P<0.05， ▲▲P<0.01 vs EX-527+OVX group.圖4 各組大鼠股骨組織中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1蛋白表達變化結果

討論

依據PMOP的主要病機“破骨細胞介導的骨吸收大于成骨細胞介導的骨形成”，目前臨床上治療PMOP的常用藥物為骨吸收抑制劑和骨形成促進劑。骨吸收抑制劑包括雌激素、雙膦酸鹽和地諾單抗等；骨形成促進劑有鈣劑、特立帕肽和阿巴帕肽等。這些西藥治療雖然能明顯緩解患者的疼痛，減輕臨床癥狀，但是存在一系列副作用。如雌激素長期服用會增加患者冠狀動脈疾病、子宮內膜癌、乳腺癌和中風等疾病的發病率［19-22］。雙磷酸鹽長期服用患者會出現髖骨骨折、下頜骨壞死、胃腸道反應、低鈣血癥等副作用［23-25］。此外，大劑量的攝入鈣可能導致便秘和腸脹氣，也可增加心肌梗死和腎結石的患病風險［26］；特立帕肽則是患者在停藥后療效會迅速喪失［27-28］。因此，尋找新的治療策略成為PMOP亟待解決的問題。據報道，某些補腎中藥復方可以通過抑制破骨細胞分化來防止PMOP引起的骨代謝紊亂［29］。TJC作為補腎壯骨的代表方藥，因在PMOP治療中的潛在作用而備受關注。

已有大量研究表明，炎癥反應是促進破骨細胞生成參與骨質疏松癥的重要途徑［30-31］。PMOP患者由于雌激素缺乏會出現促炎細胞因子如IL-1、TNF-α和IL-6等分泌增多現象，使破骨細胞增殖和活性增強，進而打破了骨形成與骨吸收之間的動態平衡［32］。有研究已證明IL-1和TNF-α受體缺失型小鼠進行OVX，術后這類小鼠不會出現骨丟失現象［33］，說明這些炎癥因子和骨吸收密切相關。此外大量研究證明［34-36］，TNF、M-CSF、NFATc 1等因子可以調控破骨細胞的來源和分化，其中NFATc 1被認為是破骨分化的特異性調節器［37］。本研究發現OVX組大鼠血清中IL-1β、IL-18和TNF-α的分泌明顯增多，股骨組織中NFATc1的mRNA和蛋白表達顯著，說明在PMOP中炎癥反應促進了破骨細胞分化，這與上述研究結果相似。而TJC干預后IL-1β、IL-18和TNF-α的分泌顯著降低，股骨組織中NFATc1的mRNA和蛋白表達顯著降低，證明TJC通過抑制炎癥因子的分泌正反饋抑制PMOP破骨細胞NFATc1的表達，最終達到抑制PMOP破骨細胞分化的目的。但是TJC通過抑制炎癥因子的分泌正反饋抑制PMOP破骨細胞NFATc1的表達是通過什么樣的網絡信號來調控的，目前尚未具體闡明。

Gurt等［38］發現，SIRT1激活劑SRT2183能抑制破骨細胞分化成熟和功能，抑制了骨吸收過程。另有文獻發現，橙皮苷升高SIRT1的表達可顯著降低炎癥介質NF-κB以及TNF-α、IL-1β和IL-6細胞因子水平，明顯改善了骨丟失［39］。提示SIRT1可能是調控破骨細胞炎癥反應的關鍵靶點。NF-κB信號通路是經典炎癥信號通路，通過調控破骨細胞參與骨質疏松癥的重要發生過程［40］。研究發現，SIRT1可通過抑制NF-κB信號通路阻止BMM向破骨細胞分化，從而抑制骨質疏松癥的發生［9］。而NLRP3炎癥小體激活的起始步驟也主要依賴于NF-κB通路，NF-κB抑制劑顯著降低NLRP3炎癥小體表達水平，緩解骨吸收［8］。NF-κB/NLRP3信號通路的激活刺激促炎細胞因子的產生［41］，因此，NF-κB、NLRP3炎癥小體作為炎癥的上游信號，可介導炎癥反應的發生［42］。本實驗發現在OVX組大鼠股骨組織中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA和蛋白表達顯著上升，而TJC干預后NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA和蛋白表達顯著降低；說明在OVX大鼠中激活NF-κB/NLRP3信號通路促進了NFATc1的生成，加速了破骨細胞的分化，而TJC逆轉了這一現象。本實驗也觀察到OVX組大鼠破骨細胞中SIRT1熒光表達面積顯著降低，而NF-κB p65和NLRP3的熒光表達面積顯著升高；TJC干預后破骨細胞中SIRT1熒光表達面積顯著上升，而NF-κB p65和NLRP3的熒光表達面積顯著降低。這表明OVX大鼠可通過SIRT1/NF-κB/NLRP3信號通路介導炎癥反應促進IL-1β、IL-18和TNF-α等炎癥因子的釋放，進一步促進破骨分化標志分子NFATc1的表達，從而促進OVX大鼠破骨細胞的分化。

綜上所述，TJC通過調控SIRT1/NF-κB/NLRP3信號通路炎癥因子的分泌來正反饋抑制破骨細胞分化標志分子NFATc1的表達，抑制PMOP破骨細胞的分化，從而糾正其骨代謝紊亂，為TJC防治PMOP的作用機制研究提供了實驗證據。但目前研究仍然存在一些不足，本研究僅通過體內實驗層面闡明了TJC抑制破骨細胞分化可能與SIRT1/NF-κB/NLRP3信號通路抑制有關，但在本研究中未使用SIRT1/NF-κB/NLRP3信號通路的相關抑制劑如SIRT1抑制劑，也未使用基因干擾技術并結合體外實驗對TJC抑制破骨細胞分化的作用機制進行深入探討。