假節桿菌PL-410產軟骨素裂解酶制備條件優化

肖夢圓　李平蘭　武瑞赟

摘 要：為確定獲得軟骨素裂解酶產生菌的分類地位及提高菌株產酶水平，通過形態學和16S rRNA基因序列分析鑒定菌株PL-410，并采用單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗和Box-Behnken響應面試驗優化菌株PL-410的產酶條件。結果表明，菌株PL-410為假節桿菌屬（Pseudarthrobacter sp.），命名為假節桿菌PL-410；優化的最佳培養基為牛軟骨硫酸軟骨素添加量7.5 g/L、胰蛋白胨添加量2.5 g/L、NaCl添加量5 g/L、KH2PO4添加量

0.3 g/L、培養基初始pH 6.53，最佳發酵條件為接種量2.98%、搖瓶裝液量8%、搖床轉速160 r/min、發酵溫度24 ℃、發酵時間27.63 h，在此條件下軟骨素裂解酶的活力（2 531.765 U/L）比優化前（85.229 U/L）提高28.7 倍，可更有效地降解牛軟骨硫酸軟骨素。

關鍵詞：假節桿菌；軟骨素裂解酶；產酶條件優化

Optimization of Fermentation Conditions for Chondroitinase Production by Pseudarthrobacter sp. PL-410

XIAO Mengyuan1， LI Pinglan1， WU Ruiyun1，2，*

（1. College of Food Science and Nutritional Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083， China;

2. Integrated Laboratory of Processing Technology for Chinese Meat and Dish Products， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Food Science and Technology， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract： In order to determine its taxonomic status and to improve its enzyme production level， the chondroitinase-producing strain PL-410 was identified based on morphology and 16S rRNA gene sequence analysis， and the fermentation conditions for chondroitinase production by this strain were optimized by single factor experiments， Plackett-Burman design， the steepest ascent method and Box-Behnken design combined with response surface methodology. The results showed that the strain PL-410 was identified as Pseudarthrobacter sp. The optimal medium was composed of chondroitin sulfate from bovine cartilage 7.5 g/L， tryptone 2.5 g/L， NaCl 5 g/L， KH2PO4 0.3 g/L， and initial pH 6.53. The optimal fermentation conditions were as follows： inoculum volume 2.98%， medium volume in shaking flasks 8%， shaker rotation speed 160 r/min，

fermentation temperature 24 ℃， and fermentation time 27.63 h. The chondroitinase activity under these conditions was

2 531.765 U/L， which was 29.7 times higher than that before optimization （85.229 U/L）.

Keywords： Pseudarthrobacter sp.; chondroitinase; optimization of enzyme production conditions

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230714-070

中圖分類號：TS201.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2023）09-0021-09

引文格式：

肖夢圓， 李平蘭， 武瑞赟， 等. 假節桿菌PL-410產軟骨素裂解酶制備條件優化[J]. 肉類研究， 2023， 37（9）： 21-29. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230714-070.? ? http：//www.rlyj.net.cn

XIAO Mengyuan， LI Pinglan， WU Ruiyun， et al. Optimization of fermentation conditions for chondroitinase production by Pseudarthrobacter sp. PL-410[J]. Meat Research， 2023， 37（9）： 21-29. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230714-070.? ? http：//www.rlyj.net.cn

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是一類以

D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖胺通過β-1，3糖苷鍵連接為基本二糖單位的線性多糖，二糖單位之間通過β-1，4糖苷鍵連接，分子質量為50～100 kDa[1]。CS廣泛存在于哺乳動物中，在骨骼、軟骨、皮膚、肌腱、臍帶和血管中含量豐富[2]。CS通常與核心蛋白共價連接，形成不同生理功能的蛋白聚糖[3]，還可以通過與各種關鍵元素（如生長因子、細胞因子、趨化因子、黏附因子和脂蛋白）相互作用調節生命過程[4]。因此，CS具有多種生物活性，包括抗氧化、抗動脈粥狀硬化、抗血栓、抗炎、抗腫瘤、調節免疫等[5-7]。但由于其分子質量大、表觀黏度高、水溶性低，難以通過腸黏膜、胃黏膜等生理黏膜，導致其生物利用率較低，限制其生物活性的發揮[8]。低分子質量CS（低于10 kDa）具有黏度低、水溶性高、易吸收等優點，生物利用率提高，可有效發揮其生物活性[9]。

軟骨素裂解酶（chondroitinase，Chase）是一類可降解CS的裂解酶，通過β-消除機制作用于CS多糖鏈的β-1，4糖苷鍵，形成在232 nm波長處有吸收的C4＝C5雙鍵的不飽和寡糖和二糖[10]。Chase可用來制備高生物活性的低分子質量CS，酶解過程無污染，反應條件溫和，催化效率高，且獲得的低分子質量CS的分子質量

可控[11]。Chase也可用于構建寡糖文庫，研究CS的結構、二糖組成、確定來源及檢測含量[12]；此外，Chase本身具有廣泛的應用價值，如修復脊髓損傷[13]、減輕腰椎間盤突出[14]、治療瘢痕疙瘩[15]、抑制腫瘤發展[16]、治療弱視[17]等。因此，制備高純度、高活力的Chase具有廣闊的前景。微生物是Chase的來源，目前已篩選出多株產Chase的菌株，包括普通變形桿菌NCTC4636[18]、肝素黃桿菌ATCC13125[19]、多形擬桿菌ATCC29148[20]、弧菌FC509[21]、溫和氣單胞菌YH311[22]、黏質沙雷氏菌GT596[23]、節桿菌MAT3885[24]等。雖然產Chase菌株眾多，但由于低酶活力的瓶頸制約，不能滿足工業化生產需求。

本研究從土壤中篩選、分離、鑒定得到一株產Chase的假節桿菌（Pseudarthrobacter sp.），通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗和Box-Behnken響應面試驗對假節桿菌產Chase的發酵培養基和發酵條件進行優化，提高產酶水平，為Chase的工業生產和應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株PL-410分離自河邊潮濕土壤中；牛軟骨CS

曲阜圣嘉德生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、（NH4）2SO4、MgSO4（均為分析純） 西隴科學股份有限公司；可溶性淀粉、NaCl、KH2PO4、濃鹽酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；牛肉膏、胰蛋白胨 北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母浸粉

英國Oxoid公司；牛肉浸粉 安琪酵母股份有限公司；CS-A（高純，98%） 上海源葉生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris） 寶如億（北京）生物技術有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生物科技有限公司；戊二醛固定液（電鏡專用，2.5%） 北京索萊寶科技有限公司。

LB培養基（種子培養基）：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.2。

基礎發酵培養基：NaCl 5 g/L、KH2PO4 0.3 g/L、MgSO4 2 g/L、牛軟骨CS 5 g/L、酵母浸粉10 g/L，pH 7.0。

1.2 儀器與設備

XSZ-HS3生物顯微鏡 重慶光電儀器有限公司；ML54/02電子天平、FE28 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計

上海美譜達儀器有限公司；IMJ-85A高壓滅菌鍋 施都

凱儀器設備（上海）有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺

蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；DK-8B電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；3K15臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；MQD-S3R振蕩培養箱 上海旻泉儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定

1.3.1.1 形態學觀察

挑取菌株PL-410于LB培養基平板上劃線，30 ℃倒置培養72 h，觀察菌株的菌落形態，并進行革蘭氏染色。挑取菌株PL-410于LB液體培養基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養。取培養時間為12、48、72 h的菌液，離心后棄上清液，向菌體中加入戊二醛固定液，于4 ℃固定2 h，利用掃描電鏡觀察菌體的形態特征。

1.3.1.2 16S rRNA基因分析

挑取菌株PL-410于LB液體培養基中，30 ℃、

200 r/min振蕩培養18 h。吸取菌液，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書，提取菌株的基因組DNA，由北京諾賽基因組研究中心有限公司對菌株PL-410的16S rRNA基因進行測序。測序結果提交至NCBI Genbank數據庫，與數據庫中已知菌株的16S rRNA基因序列進行比對，并利用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹。

1.3.2 種子液培養

挑取假節桿菌PL-410單菌落，接種于種子培養基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養至OD600 nm為0.6左右（菌體數約為6×108 CFU/mL），制得種子液。

1.3.3 單因素試驗

在基礎發酵培養基的基礎上，分別考察碳源種類（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和牛軟骨CS）、碳源添加量（0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 g/L）、氮源種類（牛肉膏、胰蛋白胨、酵母浸粉和牛肉浸粉）、氮源添加量（5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、20.0 g/L）、MgSO4添加量（0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L）、培養基初始pH（pH 5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、接種量（0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%）、搖瓶裝液量（10%、20%、25%、30%、40%、50%）、發酵溫度（23、26、28、30、32 ℃）和發酵時間（0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h）對假節桿菌PL-410產Chase的影響。通過單因素試驗結果，選擇Plackett-Burman試驗的影響因素和水平。

1.3.4 Plackett-Burman試驗

根據上述單因素試驗結果，選取7 個因素，每個因素取高低兩個水平，利用Design-Expert 11.0軟件設計Plackett-Burman試驗，試驗次數選擇Run=12，以Chase活力為響應值。通過比較各因素的顯著性水平，篩選出對Chase活力影響比較顯著的3 個因素，具體設計的試驗因素和水平如表1所示。

1.3.5 最陡爬坡試驗

根據Plackett-Burman試驗分析的因素顯著性及效應值，設計最陡爬坡試驗的變化方向和步長。若不顯著（P＞0.05）因素的效應值為正，則該因素取高水平值，若效應值為負，則該因素取低水平值。具體試驗設計如表2所示。

根據最陡爬坡試驗結果，確定Box-Behnken響應面試驗的中心點與響應區間，利用Design-Expert 11.0軟件設計Box-Behnken響應面試驗，以Chase活力為響應值，進行17 組試驗，具體試驗設計如表3所示。模型對Chase活力進行二次多元回歸擬合，生成響應面曲線圖和等高線圖，獲得最佳發酵參數。并在最佳發酵參數下進行驗證，比較試驗值與模型預測值，驗證模型的可靠性。

1.3.7 Chase活力測定

發酵結束后，取發酵液1 mL，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，取上清液棄沉淀。參考Fu Jingyun等[25]的方法，測定發酵上清液中Chase活力。Chase活力單位的定義為：在37 ℃條件下，每分鐘降解CS產生1 μmol不飽和二糖所需的酶量。

1.4 數據處理

每組試驗設置3 個重復，計算平均值和標準差，利用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，并利用Origin 2019b軟件作圖。Plackett-Burman試驗和響應面試驗通過Design-Expert 11.0軟件設計和分析處理。

2 結果與分析

2.1 軟骨素裂解酶產生菌的分類鑒定

2.1.1 形態學觀察

如圖1a所示，菌株PL-410在LB固體培養基30 ℃培養72 h后，形成直徑1～2 mm的圓形菌落，菌落中心凸起，表面光滑，邊緣較規則，不透明，呈乳白色。如

圖1b所示，革蘭氏染色觀察菌株PL-410菌體呈現紫色，為革蘭氏陽性菌。如圖2所示，在LB液體培養基中，菌株PL-410在生長過程中的形狀會經歷一個“桿-球”形狀的變化。培養時間為12 h時，菌體長1.4～3.0 μm，呈細長、不規則的桿狀（圖2a）；培養時間為48 h時，菌體長0.5～1.5 μm，桿狀細胞縮短，菌體短小，近于橢圓形（圖2b）；培養時間為72 h時，菌體長0.5～1.0 μm，菌體細胞進一步縮短，近于球形（圖2c）。隨著培養時間的延長，菌株生長所需的營養物質愈發匱乏，同時累積大量代謝產物造成惡劣的生長環境。菌體由桿狀轉化為球狀，有助于其在惡劣環境中生存，因為球狀細胞呈休眠狀態，對逆境具有極強的耐受能力[26]。

2.1.2 16S rRNA基因序列分析和系統發育樹構建

使用NCBI網站的BLASTn對菌株PL-410的16S rRNA基因序列進行在線分析，比對結果顯示菌株PL-410與假節桿菌屬（Pseudarthrobacter sp.）的序列高度一致?；诰關L-410的16S rRNA基因序列及其同源性序列，利用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹，如圖3所示。綜合形態學和16S rRNA基因序列同源性分析，確定菌株PL-410屬于假節桿菌屬，命名為假節桿菌PL-410。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 培養基成分對假節桿菌PL-410產酶能力的影響

由圖4A可知，在葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉為碳源時，假節桿菌PL-410產Chase的水平較低，和不添加碳源（對照）組的產酶水平沒有顯著差異；當牛軟骨CS為碳源時，假節桿菌PL-410的產酶水平最高，達到85.229 U/L，

顯著高于其他組（P＜0.05）。這可能是因為Chase為一種誘導酶，只有當生長環境中有誘導物（CS）存在時才能生成，CS脅迫假節桿菌PL-410產生Chase，降解利用CS滿足自身的生長[27]。故以牛軟骨CS為碳源研究碳源添加量對假節桿菌PL-410產酶能力的影響。如圖4B所示，牛軟骨CS添加量由0 g/L增加到5.0 g/L時，菌株產酶水平逐漸升高，其中添加量為5.0 g/L時，產酶水平最高，為114.510 U/L。當牛軟骨CS添加量繼續增加時，菌株產酶水平緩慢下降。這可能是因為過多碳源導致菌株前期快速生長，累積大量毒性因子等代謝產物，造成惡劣的培養基環境，使Chase喪失部分酶活力，導致Chase活力降低。根據以上結果確定牛軟骨CS添加量為2.5～7.5 g/L為Plackett-Burman試驗的因素水平。

由圖4C可知，胰蛋白胨和酵母浸粉更能促進假節桿菌PL-410產生Chase，其中當胰蛋白胨為氮源時，菌株的產酶水平最高，為191.111 U/L。故選擇胰蛋白胨為氮源，探究氮源添加量對假節桿菌PL-410產酶能力的影響。如圖4D所示，胰蛋白胨添加量為5.0～15.0 g/L時，菌株的產酶水平沒有顯著差異；當胰蛋白胨添加量高于15.0 g/L時，菌株的產酶能力下降，這可能是因為過多胰蛋白胨誘導菌株產生蛋白酶降解Chase。胰蛋白胨添加量為5.0 g/L時，菌株的產酶水平最高，為238.431 U/L，故確定胰蛋白胨添加量2.5～7.5 g/L為Plackett-Burman試驗的因素水平。

由圖4E可知，Mg2＋添加量對菌株產酶水平影響不顯著，可能是因為胰蛋白胨中存在的微量Mg2＋可以滿足假節桿菌PL-410生長代謝，無需額外添加Mg2＋。因此

Mg2＋添加量不作為Plackett-Burman試驗的影響因素，選擇不添加Mg2＋繼續后續實驗。由圖4F可知，隨著培養基初始pH值由酸性向堿性變化，菌株產酶水平先升高后下降，當培養基初始pH值為6.0時，菌株的產酶水平最高，為343.529 U/L。故選擇培養基初始pH 5.5～6.5為Plackett-Burman試驗的因素水平。

小寫字母不同，表示差異顯著（P＜0.05）。圖5同。

2.2.2 發酵條件對假節桿菌PL-410產酶能力的影響

由圖5A可知，隨著接種量的增加，菌株的產酶水平先升高后下降。造成此現象的原因可能是過低的接種量會延長培養時間，而過高的接種量導致溶氧不足，從而影響Chase的合成。當接種量為1%～10%時，菌株的產酶水平較高，組間沒有顯著差異，從縮小成本的角度出發，選擇接種量1%～3%為Plackett-Burman試驗的因素水平。

由圖5B可知，菌株產酶水平隨著裝液量的增加而降低。當裝液量為10%時，菌株產酶水平最高（352.157 U/L），因為假節桿菌PL-410為需氧菌，裝液量越少培養基溶氧越多，越有利于假節桿菌PL-410發酵產酶。故選擇搖瓶裝液量8%～12%為Plackett-Burman試驗的因素水平。

由圖5C可知，隨著發酵溫度的升高，菌株的產酶水平先升高后下降。當發酵溫度為26～28 ℃時，菌株產酶水平最高，故選擇發酵溫度24～28 ℃為Plackett-Burman試驗的因素水平。

由圖5D可知，菌株培養8 h后，開始產生Chase，隨后Chase產量迅速增加，在24 h達到最大值，Chase活力為1 660.588 U/L，表現出與菌株生長曲線相似的趨勢；24 h后Chase產量無明顯增加，因為24 h后培養基pH值從7.79逐漸升高到8.36，pH值升高改變了Chase活性中心構象，使Chase喪失部分活力。因此選擇發酵時間20～28 h為Plackett-Burman試驗的因素水平。

2.3 Plackett-Burman試驗結果

Plackett-Burman試驗是一種能夠從眾多影響因素中篩選出可信度大于95%主效應因素的試驗方法。如表4所示，利用Design-Expert 11.0軟件對Plackett-Burman試驗結果進行效應分析和方差分析，結果如表5所示。模型方差P＜0.05，說明數據模型對試驗結果有顯著影響，試驗結果具有可信度。牛軟骨CS添加量（A）、培養基初始pH（C）、接種量（D）和發酵時間（G）這4 個因素為正效應，應增加；胰蛋白胨添加量（B）、搖瓶裝液量（E）和發酵溫度（F）這3 個因素為負效應，應減少。其中培養基初始pH（C）、接種量（D）與發酵時間（G）貢獻率最高，P值均小于0.05，表明這3 個因素對假節桿菌PL-410產Chase的能力具有顯著影響，因此選擇這3 個因素進行最陡爬坡試驗確定響應面試驗的中心點。其余4 個因素則根據各自效應值進行取值，即選擇牛軟骨CS添加量7.5 g/L、胰蛋白胨添加量2.5 g/L、搖瓶裝液量8%、發酵溫度24 ℃。

2.4 最陡爬坡試驗結果

如圖6所示，隨著培養基初始pH值的升高、接種量的增加和發酵時間的延長，Chase活力呈現先上升后下降的趨勢。Chase活力在3號試驗點出現最大值，此時培養基初始pH值為6.5、接種量為3%、發酵時間為28 h，Chase活力為2 301.373 U/L。最終確定該點為下一步

2.5 Box-Behnken響應面試驗結果

Box-Behnken響應面試驗結果如表6所示。利用Design-Expert 11.0軟件對試驗結果進行方差分析，（表7），回歸模型顯著（P=0.000 3），失擬項不顯著（P=0.110 4），表明回歸模型對試驗結果具有極顯著影響，且未知因素對結果影響較小，模型選擇恰當；回歸模型決定系數R2=0.963 2，表明模型的預測值與實測值之間具有較高相關性，擬合程度較好[28]；回歸模型的信噪比為12.957 4，大于4，表明模型可信度高，模型可用。

利用回歸模型對表6的試驗結果進行擬合，得到假節桿菌PL-410的Chase活力對培養基初始pH值（A）、接種量（B）和發酵時間（C）的多元二次回歸方程：

Y=－56 745.89＋10 508.56A＋798.56B＋1 727.35C＋549.68AB＋133.44AC－14.29BC－1 212.99A2－669.24B2－46.26C2。

根據多元二次回歸方程，繪制響應面試驗的三維曲面圖和等高線圖。由圖7可知，培養基初始pH值、接種量和發酵時間之間交互作用響應面較為陡峭，等高線橢圓程度較為明顯，表明二者間交互作用對Chase活力的影響顯著（P＜0.05）。等高線圖呈圓形表明兩因素間交互作用不顯著，呈橢圓形表明兩因素間交互作用顯著，越“扁”交互作用越顯著[29]。由圖可以看出，培養基初始pH值和接種量間的等高線圖相比之下更“扁”，表明這兩者的交互作用對菌株產酶能力影響更顯著。

利用Design-Expert 11.0軟件分析計算，預測出最優參數分別為培養基初始pH 6.53、接種量2.98%、發酵時間27.63 h，此時預測假節桿菌PL-410的Chase活力為2 598.77 U/L。在上述最優參數下進行驗證試驗，實際測得Chase活力為（2 531.765±52.373）U/L，與預測值擬合度達97.4%，表明優化模型可靠。優化后假節桿菌PL-410的Chase活力（2 531.765 U/L）比優化前（85.229 U/L）

提高28.7 倍，說明本試驗優化的培養基和發酵條件顯著提高了Chase的產量。

劉萬順等[30]從土壤中篩選的少動鞘氨醇單胞菌產Chase活力最高為1 200 U/L（發酵周期36 h）；蘇昕等[31]利用溫和氣單胞菌YH311產Chase活力最高為920 U/L（發酵周期36 h）；陶科等[32]從土壤中篩選的彭氏變形桿菌產Chase活力最高為322 U/L（發酵周期10 h）。相比之下，本研究篩選的假節桿菌PL-410具有酶活力較高、發酵周期較短的優勢。

3 結 論

本研究分離鑒定了一株具有產Chase的假節桿菌屬PL-410，并對產Chase條件進行優化，最終得到優化最佳培養條件為：最佳發酵培養基為牛軟骨CS添加量7.5 g/L、

胰蛋白胨添加量2.5 g/L、NaCl添加量5 g/L、KH2PO4添加量0.3 g/L、培養基初始pH 6.53，最佳發酵條件為接種量2.98%、搖瓶裝液量8%、搖床轉速160 r/min、發酵溫度24 ℃、發酵時間27.63 h。在此條件下Chase活力比優化前提高28.7 倍，優化效果顯著，具有良好的開發應用前景。實驗結果為假節桿菌PL-410工業化應用及Chase在工業、醫藥的應用提供良好的技術基礎和支撐。但目前的研究處于初級階段，要實現工業化大規模生產，還需進一步發酵工藝研究，酶的分離純化工藝、酶學特性及酶的重組表達等也有待進一步研究。

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收稿日期：2023-07-14

基金項目：現代農業產業技術體系北京市漁業創新團隊項目（BAIC07-2023-13）

第一作者簡介：肖夢圓（1996—）（ORCID： 0000-0002-5641-8049），女，碩士研究生，研究方向為應用微生物。

E-mail： 15216605538@163.com

*通信作者簡介：武瑞赟（1990—）（ORCID： 0000-0003-1030-4561），女，助理研究員，博士，研究方向為功能性益生元的理論與應用。E-mail： wuruiyun814@163.com