64個藍莓品種的ISSR分析

張立杰 謝麗雪 張小艷 李韜 黃立新

摘要：為明確不同藍莓品種間的遺傳關系，利用ISSR標記對64個藍莓品種進行DNA指紋分析，構建藍莓品種的指紋圖譜數據庫。從60條ISSR引物中篩選出9條重復性穩定的多態性引物，共擴增出條帶161條，其中多態性條帶159條，平均多態百分率達98.8%，引物 UBC841 可將 64 個藍莓品種區分開。利用擴增結果進行聚類分析，在相似系數0.568的水平可將試材分為3個類群，并對其遺傳關系進行探討。

關鍵詞：藍莓；品種；ISSR；指紋圖譜；遺傳關系

中圖分類號：S682.31? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2095-5774（2023）01-0011-07

ISSR Analysis of 64 Blueberry Cultivars

Zhang Lijie1，Xie Lixue1，Zhang Xiaoyan1，Li Tao1*，Huang Lixin2

（1Fruit Research Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，Fujian 350013，China；

2 Shaowu Municipal Bureau of Agriculture and Rural Affairs，Nanping，Fujian 354000，China）

Abstract：In order to clarify genetic relationship of different cultivars of blueberry，the inter-simple sequence repeat（ISSR）method was applied to analyze the DNA fingerprinting of 64 blueberry cultivars，and a fingerprints database was constructed. Nine ISSR primers，with high polymorphisms and good repeatability，were selected from 60 ISSR primers. Total 161 DNA bands were amplified，159 of which were polymorphic ，the average polymorphism percentage was 98.8%. These varieties could be satisfactorily distinguished by a single ISSR primer UBC841. UPGMA algorithm showed that 64 cultivars could be clustered into 3 groups using a genetic similarity coefficient threshold of 0.568，and their genetic relationships was evaluated .

Key words：Blueberry；Cultivars；ISSR；DNA fingerprinting；Genetic relationships

藍莓，又名越橘、藍漿果，為杜鵑花科 （Ericaceae） 越橘屬 （Vaccinium） 植物。藍莓被喻為世界第三代水果，可果實鮮食、加工或作為高級化妝品原料。藍莓因其集約化、精細化栽培、符合現代果業要求且價格優勢明顯，成為中國新興果業的代表，各個省份都在大力發展。

福建省屬亞熱帶季風氣候，土壤多為酸性的紅壤、黃壤且有機質含量高，適合南高叢和兔眼藍莓的生長。福建為藍莓發展新區，早期種植多以民間引種試種為主，規模小，多點開花。據不完全統計，2016年，福建省藍莓栽培面積約800 hm2，投產不足300 hm2，主要分布在龍巖、寧德、福州等地。栽培品種多樣，包括‘奧尼爾‘夏普藍‘密斯提‘萊格西‘威爾‘海岸‘頂峰‘燦爛‘園藍‘粉藍‘精華‘杰兔‘烏達德等。隨著產業的發展和種植面積的增加，藍莓品種和苗木市場混雜的問題日益突出，部分北高叢藍莓品種如‘杜克‘南豐等也被引入，給相關藍莓種植戶造成極大損失。為此，開展藍莓品種的鑒定評價成為福建藍莓產業發展的迫切問題。

由DNA分子標記衍生的DNA指紋技術在鑒定品種真實性和純度等方面是很有效的，其中ISSR 標記是一種簡單序列重復區間擴增多態性分子標記，目前已廣泛應用于植物品種鑒定［1］、遺傳圖譜構建［2］及遺傳多樣性研究［3-4］等。該技術已運用于構建蘋果［5］、杏［6］、柑橘［7］、枇杷［8］、龍眼［9］、火龍果［10］、獼猴桃［11］等果樹的指紋圖譜。本研究應用ISSR分子標記對64個藍莓品種的遺傳關系進行分析，建立DNA指紋圖譜，為藍莓品種調查、鑒別及藍莓產業合理布局服務。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取64個藍莓品種（表1），其中南高叢品種12個，北高叢品種34個，半高叢品種3個，兔眼品種11個，矮叢3個品種來自浙江藍美農業有限公司，取其嫩葉作為研究試材。

1.2 藍莓葉片DNA提取

采用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒進行藍莓葉片DNA提取，采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定DNA的質量和濃度。最終將DNA稀釋至25 ng·μL-1，置于 -20 ℃ 冰箱備用。

1.3? 藍莓ISSR反應體系的建立

ISSR-PCR反應體系由 2.0μL DNA模板、2.5 μL 10×Ex Taq Buffer、2.5 μL dNTP、2.0 μL 10μmol·L-1引物、2.0μL? ? ? ? 25 mmol·L-1 MgCl2、0.3μL5 U·μL? ?-1 Taq DNA polymerae和13.7μL ddH2O組成，總體積為25μL。ISSR引物序列參考加拿大哥倫比亞大學UBC Primer Set#9（University of British Columbia Biotechnology，UBC），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

反應程序：94℃預變性5 min，94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，重復35個循環；最后在72℃延伸10 min；4℃保存。PCR反應在Techne PCR儀上進行。電泳檢測采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠，電泳緩沖液為 1×TBE，150V電壓電泳4h，電泳結束后銀染拍照。

1.4? ISSR引物的篩選及擴增產物多態性的統計分析

用 60條隨機引物對任意一份DNA 樣品在上述的反應體系及擴增程序中進行擴增，以篩選引物，引物需符合如下條件：條帶清晰、空白中無或少假帶、對所有樣品均有質量好的條帶。根據電泳圖譜進行讀帶，電泳圖譜中的每一條帶記為一個分子標記。以清晰及能重復的條帶記為“1”其余的為“0”，數據處理完后運用NTSYS-PC 2.0軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1? 多態性ISSR引物的篩選

選擇適宜的引物是構建DNA指紋圖譜的關鍵因素之一。本研究從60條隨機引物中篩選出9條帶型好、多態性高、重復性好的引物。9條ISSR 引物對64個品種的擴增結果見表2，共擴增出條帶161條，其中多態性條帶159條，平均多態百分率達98.8% 。各引物擴增的條帶數在5～25條之間。

2.2? 64個藍莓品種指紋圖譜的構建

引物 UBC841 可以將 64份供試材料完全區分開來（圖1），構建了 64 個藍莓材料的 DNA 指紋圖譜（表3）。

2.3? 64個藍莓品種的聚類分析

基于ISSR的擴增結果，采用UPGMA法進行相似系數計算和聚類分析，建立了64個藍莓品種的聚類樹狀圖（圖2）。在相似系數0.568的水平，可分為3個品種群，第Ⅰ類聚集了13個品種，除‘瑞卡‘美登外，其余11個品種均為兔眼藍莓。第Ⅱ類聚集了46個品種，包含了絕大多數的高叢、矮叢藍莓，在相似系數0.58水平對該組進行亞分類，可分為4個亞組（表4），第1個亞組包含15個品種，其中‘比洛克西‘夏普蘭等6個品種為南高叢藍莓，‘錢德勒‘努益等8個品種為北高叢藍莓，‘芝尼為矮叢藍莓；第2個亞組包含20個品種，其中‘海岸‘密斯提等5個品種為南高叢藍莓，‘玫瑰藍‘康維爾等15個品種為北高叢藍莓；第3個亞組包含8個品種，除‘北極星‘北村‘北陸3個半高叢藍莓品種外，還包括‘魯貝爾‘埃利奧特等5個北高叢藍莓品種；第4個亞組包含3個品種，其中‘斯維克為矮叢藍莓，‘米德‘達柔為北高叢藍莓。第Ⅲ類聚集了5個品種，除‘庫帕為南高叢藍莓外，其余4個為北高叢藍莓。

3 討論

3.1? 64個藍莓品種的遺傳關系分析

多數藍莓品種間在外觀形狀上難以區分，DNA分子標記已成為在藍莓品種鑒定及親緣關系分析方面最有效的方法。在藍莓資源上，已采用SSR［12］、RAPD［13］、ISSR［14］和SRAP［15］等標記技術進行遺傳多樣性、親緣關系分析以及品種鑒定研究。

本研究聚類結果表明，兔眼藍莓、半高叢藍莓可單獨聚在一組，說明藍莓品種間的遺傳關系與栽培類型之間存在著一定的對應關系。崔建民［16］等對93個藍莓種質資源進行SSR分子標記分析也顯示在遺傳相似系數0.70處，北高叢藍莓、兔眼藍莓分別聚為一類；但是本研究中存在北高叢、南高叢及矮叢的品種混雜聚類，說明僅根據藍莓栽培類型來分類并不能準確反映其遺傳關系，這可能是因為現在栽培的大多數藍莓品種均是由幾個最原始的品種相互雜交而得到的［14］。

3.2? 藍莓DNA指紋圖譜的構建

目前，已建立多種果樹的指紋圖譜，包括蘋果、梨、李、桃、杏、柑橘、葡萄、柿、櫻桃、梅、油橄欖、阿月渾子、番荔枝、樹莓、番木瓜、棗等。藍莓指紋圖譜方面研究較少，僅見除鄭姍等［17］以ISSR標記構建17個品種的DNA指紋圖譜外，高雄梅［18］、 王亮［19］、徐國輝［20］等以EST-SSR開展了相關研究，為此，開展藍莓品種的DNA指紋圖譜鑒定有助于解決國內藍莓苗木混雜及亂命名現象。

本研究采用的ISSR標記不僅結合了RAPD、AFLP的大部分優點［21］，且多態性比RAPD、 AFLP、SSR豐富，多態性占總條數的98.8%。下一步研究擬將ISSR技術與SCAR標記技術相結合，增加多態性引物數量，開發特異的SCAR標記，構建更準確、穩定的藍莓DNA指紋圖譜，為藍莓品種鑒定等相關研究服務。

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（責任編輯：馮新）