潰結核心方對潰瘍性結腸炎小鼠NF-κB/HIF-1α通路的影響*

黃 李 彭云花 陳 天 陸 宏 楊 巍

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 201203）

潰瘍性結腸炎（UC）是炎癥性腸?。↖BD）的一個亞型［1］，臨床表現以消化系統表現為主，包括腹瀉、黏液膿血便、腹痛腹脹等。近年來的研究發現新興工業國家中UC發病率迅速增加，其年百分比變化增長約14.9%［2-4］。STAUFFER JK 等［5］研究表明，內源性信號產物可誘導大量炎癥介質產生，進而引發腸道免疫炎癥反應，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-6（IL-6）等促炎細胞因子的大量激活，不僅阻礙腸道上皮屏障功能的修復，還會影響腸道菌群的平衡和代謝，加重UC。NF-κB/HIF-1α 信號通路是指在缺氧條件下，缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和核轉錄因子-κB（NF-κB）相互作用，調節相關聯的基因表達，并參與細胞的增殖、遷移、血管生成和炎癥反應等。NF-κB 和HIF-1α 分別是炎癥和缺氧疾病的關鍵轉錄因子，炎癥主要激活NF-κB，而缺氧則與HIF-1α 信號通路密切相關［6］。當機體缺氧后，HIF-1α 活化，并刺激NF-κB P65 磷酸化上調，級聯反應下促使了炎癥因子的表達［7］。同條件下HIF-1α還被發現可介導NF-κB的活化，并通過TLR4依賴的方式促進LPS刺激巨噬細胞中NF-κB 調節細胞因子的表達，包含TNF-α、IL-1β等。潰結核心方（UCCF）是上海市名中醫楊巍教授治療UC 的核心基礎方，主要由2 個藥組組成：清熱燥濕之黃芩、黃連、木香；健脾益氣之黃芪、白術、茯苓。前期網絡藥理學研究已推測UCCF可能通過NF-κB/HIF-1α 信號通路對UC 發揮抗炎作用，為進一步驗證這一理論，本實驗采用小鼠進行動物實驗，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

48 只SPF 級C57BL/6J 雄性小鼠，周齡9～12 周，體質量（21±1）g，生產許可證編號：Q2714。環境恒溫恒濕，光照符合規定，予普通飼料喂養，自由飲水。所有動物的喂養、操作、處死取材等均嚴格遵循上海中醫藥大學動物研究委員會倫理相關規定，實驗方案經由上海中醫藥大學動物倫理委員會審核批準（倫理編號：PZSHUTCM220124014）。

1.2 試劑與儀器

UCCF 顆粒劑組成：黃芩15 g，黃連6 g，黃芪10 g，白術10 g，茯苓10 g，木香10 g。均購于上海中醫藥大學附屬曙光醫院中藥房。美沙拉嗪腸溶片（葵花藥業集團，國藥準字H19980148），規格：0.25 g/片。葡聚糖硫酸鈉（DSS）購于美國MP Biomedicals 公司。便隱血（FOB）檢測試劑購于艾博生物醫藥有限公司，批號為2022110119；TNF-α 試劑盒購于Origene 公司，批號為20100929080；IL-1β 試劑盒購于武漢賽維爾公司，批號為GB11113；NF-κB 兔多克隆抗體、HIF-1α 兔多克隆抗體均購于Origene 公司，批號分別為W001、W112。UC7 超薄石蠟切片機（蘇州賽恩斯儀器有限公司）；MS-PB 磁力攪拌器、KZ-Ⅱ高速組織研磨儀、BV-2 垂直電泳儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；D3024R臺式高速冷凍離心機（大龍興創實驗儀器公司）；Alpha-EaseFC灰度分析軟件（Alpha Innotech公司）；7300實時熒光定量PCR 系統（美國ABI 公司）；Adobe PhotoShop圖像分析軟件（美國Adobe 公司）；ME203E/02 電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］。

1.3 分組與造模

48 只小鼠適應性喂養1 周之后隨機分為正常組、模型組、美沙拉嗪組及UCCF 低、中、高劑量組，每組8只。正常組小鼠每天飲用蒸餾水，其余各組均喂養4%DSS，自由飲水。通過DSS干預4 d，小鼠腸道炎癥始現（大便不成形、隱血陽性、肛門糊狀等），連續干預6 d即可構建急性UC模型［8］。

1.4 給藥方法

在小鼠的飼養期間，其可以自由飲水，并注意清潔墊料，保持干燥。給藥濃度計算方法參照《中藥藥理研究方法學》［10］，按照實驗動物與人體質量計算給藥劑量，將人每天劑量折算成小鼠等效劑量作為中劑量，高劑量即為2 倍，低劑量為1/2 倍，等效劑量為1.40 g/kg，小鼠灌胃量按照0.2 mL/10 g 計算，UCCF低、中、高劑量分別為0.8、1.6、3.2 g/（kg·d），藥物使用前研磨至粉末狀，加入蒸餾水充分溶解配制混懸液，于4℃冰箱冷藏，使用時提前水浴鍋復溫。美沙拉嗪組（陽性對照藥）：成人UC 急性期美沙拉嗪腸溶片的用藥劑量為4 g/d，換算成小鼠劑量為0.52 g/（kg·d）。從4% DSS 喂養第5 天開始予以藥物干預，UCCF 低、中、高劑量組灌胃給予相應濃度的UCCF（2.5 g/kg），美沙拉嗪組小鼠給予美沙拉嗪腸溶片溶液（0.011 g/kg）灌胃，正常組和模型組予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃，連續7 d。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 一般情況及DAI評分 實驗期間每日觀察小鼠的一般狀況（體質量、糞便黏稠度并進行糞便隱血檢測）。各組小鼠DAI 評分按照表1 的評分標準，計算公式為DAI 評分為3 項合計總分/3。DAI 值達到0.5 分及以上時，即可判定小鼠結腸炎造模成功［11］。

表1 DAI評分表

1.5.2 結腸長度及結腸病理學評分 第12 日前禁食12 h，然后稱重、處死。剖取結腸、清洗后參照結腸病理學評分標準進行評分。0分為正常組織；1分為表面上皮損傷；2 分為局限于黏膜的灶性潰瘍；3 分為灶性透壁性炎癥和潰瘍；4分為廣泛透壁性潰瘍和炎癥，病變之間存在正常黏膜；5分為廣泛的片狀透壁性潰瘍和炎癥。

1.5.3 結腸組織病理學檢測 取4%多聚甲醛固定的結腸組織，采用石蠟包埋、切片及HE 染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.5.4 免疫組織化學檢測 分別進行抗原修復、內源性過氧化酶阻斷和封閉，然后先后進行一抗孵育、二抗孵育，放大信號后進行DAB 染色，細胞核染色，隨后鹽酸分化、返藍、封片和拍片，采用Image J 圖像分析系統對棕黃色顆粒（陽性表達）進行半定量分析。

1.5.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應（Real-time PCR）檢測結腸組織TNF-α、IL-1β、NF-κB、HIF-1α mRNA的表達 稱取20 mg 凍存的結腸組織經液氮研磨，加入RNA裂解液進行總RNA提取，然后進行變性、冷卻，再加入反轉錄液于PCR反應儀退火、延伸、失活。PCR擴增條件：95 ℃，30 s（循環1次）預變性，PCR反應條件為95 ℃，5 s，60 ℃，34 min 循環40 次，溶解曲線反應條件：95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s，循環1 次。以β-actin 為內參，采用ΔΔCT 值方法，ΔCT=目的基因CT值-β-actin CT 值，ΔΔCT=ΔCT 實驗組-ΔCT 對照組，目的基因相對表達倍數=2-ΔΔCT。該引物序列由武漢賽維爾生物科技有限公司設計，見表2。

表2 引物序列

1.5.6 蛋白免疫印跡（Western blotting）法檢測結腸組織NF-κB、HIF-1α蛋白表達情況 稱取各組蛋白組織100 mg，加入裂解液，而后高速低溫研磨，對其組織上清液進行蛋白濃度測量。加熱蛋白使其變性后上機，先后電泳、轉膜、封閉，TBST 洗膜3 次后加入相應1∶3 000 的二抗，室溫孵育50 min 后重復洗膜3 次，最后發光顯色。使用灰度分析軟件AlphaEaseFC 和圖片處理軟件Adobe PhotoShop 分別對條帶灰值進行數據分析和圖像整理。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 各組小鼠體質量及DAI評分比較

見表3。正常組小鼠一般狀況良好。模型組小鼠在造模的第4 天起出現腹瀉，便中帶血，部分小鼠肛門呈糊狀，喜臥懶動、毛發雜亂黯淡。各用藥組小鼠腹瀉、血便情況明顯減輕，精神狀態可，毛發潤澤度改善。給藥前后，與正常組相比，模型組小鼠體質量均明顯降低，DAI 評分均明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組相比，取材前的美沙拉嗪組和UCCF 中、高劑量組小鼠體質量都有明顯上升，各用藥組DAI 評分均明顯降低；取材前末次體質量顯示，正常組、美沙拉嗪組和UCCF 高劑量組體質量均較給藥前有增高（P＜0.05 或P＜0.01）。

表3 各組小鼠體質量及DAI評分比較（±s）

表3 各組小鼠體質量及DAI評分比較（±s）

注：與正常組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。下同。

體質量（g）組別正常組模型組美沙拉嗪組UCCF低劑量組UCCF中劑量組UCCF高劑量組n8 8 8 8 8 8造模前21.26±0.56 21.15±1.01 21.25±0.67 20.88±0.91 21.10±0.95 20.75±1.15給藥前22.08±1.21 20.23±0.52*20.30±0.56*20.34±0.55*20.21±0.46*20.03±0.54*給藥后22.23±0.43 18.85±0.52**19.63±0.37**19.30±0.68**19.78±1.28**19.89±0.49**末次體質量22.95±0.43 18.79±0.45**20.53±0.39*△△19.63±0.33**19.74±0.33**△20.36±0.72*△△末次DAI評分（分）0.08±0.14 2.42±0.46*0.42±0.36*△1.59±0.36*△1.13±0.41*△△0.29±0.31△△

2.2 各組小鼠結腸長度及病理組織學評分比較

見表4。結腸長度方差分析結果顯示，各組結腸長度差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步比較，與正常組相比，模型組及UCCF 低、中劑量組的結腸長度顯著縮短（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，UCCF 中、高劑量組和美沙拉嗪組的結腸長度顯著延長（P＜0.01）；病理組織學評分方面，與正常組相比，模型組、美沙拉嗪組和UCCF 低、中、高劑量組小鼠結腸組織評分均顯著升高，具有統計學差異（P＜0.01或P＜0.001）；相比于模型組，UCCF 高劑量組和美沙拉嗪組結腸組織評分差異有統計學意義（P＜0.01）。

表4 各組小鼠結腸長度及病理組織學評分比較（±s）

表4 各組小鼠結腸長度及病理組織學評分比較（±s）

組 別正常組模型組美沙拉嗪組UCCF低劑量組UCCF中劑量組UCCF高劑量組n8 8 8 8 8 8結腸長度（cm）10.15±1.01 8.45±0.52**9.49±0.62△△8.75±0.41**8.83±1.02**9.69±0.67△△病理組織學評分（分）0.13±0.33 3.13±0.93***1.88±0.60**△△2.38±0.99**2.25±1.09**1.88±0.33**△△

2.3 各組小鼠結腸組織病理學變化

見圖1。正常組小鼠的結腸黏膜未發現明顯病理變化；模型組小鼠出現了輕中度的結腸炎癥損傷，炎癥主要集聚于黏膜層和黏膜下層，模型組小鼠結腸正常隱窩結構被破壞，腺體扭曲，杯狀細胞減少，排列紊亂；美沙拉嗪干預后的小鼠結直腸炎癥損傷程度較模型組明顯減少，大部分炎癥局限于黏膜層，杯狀細胞排列有序；UCCF 低劑量組、中劑量組結腸上皮已經修復，但腺體有輕度扭曲，炎癥集中于黏膜；UCCF 高劑量組結腸上皮部分已經修復，腺體恢復狀態良好，隱窩結構排列有序，未發現有淋巴細胞浸潤的現象。

圖1 各組小鼠結腸組織病理學變化（HE染色，200倍）

2.4 各組小鼠結腸組織TNF-α、IL-1β表達水平比較

見表5、圖2。與正常組相比較，模型組小鼠結腸組織中TNF-α、IL-1β 的mRNA 表達水平有顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），美沙拉嗪組和UCCF 中、高劑量組結腸組織中TNF-α、IL-1β 的mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。正常組小鼠結腸組織中的TNF-α、IL-1β 蛋白存在較少的陽性表達，且主要分布于結腸黏膜上；與之對比的模型組小鼠結腸組織中TNF-α、IL-1β 蛋白的表達明顯增多（P＜0.05）；與模型組相比，UCCF 高劑量組和美沙拉嗪組小鼠結腸黏膜中TNF-α、IL-1β蛋白的表達明顯下降（P＜0.05），這與qRT-PCR結果一致。

圖2 各組小鼠結腸組織TNF-α、IL-1β的表達（DAB染色，400倍）

表5 各組小鼠結腸組織TNF-α、IL-1β mRNA表達水平比較（±s）

表5 各組小鼠結腸組織TNF-α、IL-1β mRNA表達水平比較（±s）

組 別正常組模型組美沙拉嗪組UCCF低劑量組UCCF中劑量組UCCF高劑量組n8 8 8 8 8 8 TNF-α mRNA 18.42±0.73 30.12±0.82*19.94±0.87△24.23±0.49 23.80±0.77 21.80±0.55△IL-1β mRNA 11.14±0.50 43.55±0.90**24.33±0.95△37.60±1.0 36.30±0.90△21.90±0.90△

2.5 各組小鼠結腸組織NF-κB、HIF-1αmRNA和蛋白表達水平比較

見表6、圖3。與正常組比較，模型組小鼠HIF-1α、NF-κB 的mRNA 表達和蛋白表達明顯上升，給藥后美沙拉嗪組及UCCF低劑量、中劑量、高劑量組HIF-1α、NF-κB 的mRNA 表達及蛋白表達發生逆轉，表達降低，其中美沙拉嗪組及UCCF 高劑量組中HIF-1α、NF-κB 的mRNA 表達和蛋白表達顯著降低，與模型組比較有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。

圖3 各組小鼠結腸組織NF-κB、HIF-1α蛋白表達條帶

表6 各組小鼠結腸組織NF-κB、HIF-1α表達水平比較（±s）

表6 各組小鼠結腸組織NF-κB、HIF-1α表達水平比較（±s）

組別正常組模型組美沙拉嗪組UCCF低劑量組UCCF中劑量組UCCF高劑量組n8 8 8 8 8 8 NF-κB mRNA 1.18±0.12 3.29±0.38**1.31±0.21△△2.36±0.19*△1.68±0.17△1.22±0.17△△HIF-1α mRNA 0.83±0.16 2.57±0.34**1.21±0.25△△2.02±0.17*△1.42±0.14△1.15±0.19△△NF-κB/βactin 0.28±0.03 1.0±0.02**0.53±0.04△△0.86±0.05**0.82±0.05**0.51±0.04△△HIF-1α/βactin 0.16±0.02 1.12±0.03**0.38±0.02△△1.02±0.05**0.98±0.04**0.31±0.02△△

3 討 論

UC是一種炎癥性腸病，其主要癥狀是結腸黏膜的潰瘍和出血，較符合中醫學“痢疾”“泄瀉”的疾病特點。中醫學認為，本病發病的誘因復雜，病程長，病情易反復，但總以濕熱蘊腸、氣滯血瘀為其基本病機。UCCF方中，君藥黃芩、黃連苦寒以清熱燥濕。關于黃芩，《神農本草經》有云“主諸熱黃疸，腸澼泄痢”。黃連生用苦寒性強，長于清熱瀉火解毒，亦可用于多種濕熱證，其清熱燥濕之功甚于黃芩，尤擅清中焦之濕熱。兩藥相須為用，使邪有出路，邪去則正安。臣藥黃芪、白術甘溫以健脾益氣，乃補虛之經典藥對。其中黃芪歸脾肺經，具有補氣升陽、利水消腫之效，可用于脾胃氣虛證，白術長于補脾益氣，燥濕利水，可用于脾胃氣虛證及脾虛濕停之水腫、痰飲，是治療痰飲、水腫之良藥。另佐以茯苓利水滲濕，健脾寧心，木香升降諸氣，使邪有出路。全方君臣分明，各有所主，具有清熱燥濕、健脾利水之功。臨證時常根據病情緩急、病機主次、脾虛、濕熱等癥狀調整君臣劑量以達其效。

目前UC 的發病機制尚未明確，一般認為其與遺傳、環境、患者結直腸微生物生態系統及腸道內異常的固有免疫、適應性免疫相關。國內外多年基礎研究表明，NF-κB 家族在健康組織中起到控制組織穩態、協調細胞生長和分化、應對外部刺激反應等作用，ATREYA I 等［12-14］在相關研究中已證實了腸上皮細胞中NF-κB 活性的高度對調控正常腸道穩態至關重要，其活動失調與許多腸道疾病狀態有關，如IBD 等。HIF-1 是一種能夠適應缺氧環境的調節因子，它由HIF-1β 亞基和HIF-1α 亞基組成。ALBOGAMI SM等［15］在研究中表明HIF-1α 對氧敏感，在低氧條件下易活化，調控下游靶基因的激活和轉錄，啟動一系列細胞對缺氧刺激的應激反應。炎癥組織的常見特征是血管功能障礙和免疫細胞浸潤導致的耗氧量增加，因此，腸道炎癥與黏膜缺氧高度有關。BAILEY CM 等［16］研究表明，在炎癥中，HIF-1α能調控免疫細胞存活，調節促炎因子TNF-α、IL-1β 等的表達。此外，TAYLOR M等［17］發現，NF-κB和HIF-1α是參與黏膜反應調節的2個主要核因子，HIF-1α在抑制炎癥發生和固有宿主防御反應中起重要作用。CLAMBEY ET［18］研究表明HIF-1α 依賴的FoxP3 誘導在黏膜炎癥性缺氧期間能夠調節Tregs 細胞豐度和功能，特定條件下HIF-1α 可通過調節特定的信號通路，包括NF-κB、Akt 和mTOR等，促進FoxP3 的表達，有效調節T 細胞功能，對降低炎癥表達、恢復內環境穩定有重要作用，并且保持免疫系統中的免疫耐受性，這可能是本次研究中UCCF 調節HIF-1α 進而參與抑制炎癥反應的重要機制。本實驗結果表明，模型組小鼠的DAI評分、結腸黏膜組織評分顯著升高，結腸組織中促炎細胞因子TNF-1α、IL-1β 和NF-κB、HIF-1α mRNA 和蛋白表達水平明顯升高，結腸長度下降，鏡下可見小鼠黏膜上皮細胞出現諸多炎癥細胞浸潤導致的病理變化，表明NF-κB/HIF-1α 信號通路調節的炎癥反應參與了UC 疾病進程。采用UCCF 治療后，各劑量組小鼠DAI 評分、結腸黏膜組織評分以及結腸組織中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、NF-κB、HIF-1α 的mRNA 和蛋白表達均明顯降低，這證實了UCCF 可通過NF-κB/HIF-1α 信號通路調節炎癥反應。UCCF 方中的黃芪被證實可抑制炎癥因子表達，其內含的皂苷及類黃酮對阻斷氧化應激反應也有重要作用。此外，UCCF 治療后黏膜病理損傷明顯改善，表明UCCF 對UC 有較好的治療作用，可通過調節NF-κB/HIF-1α信號通路減輕炎癥反應。

綜上所述，UCCF 能夠通過調節NF-κB/HIF-1α 信號通路，達到控制UC的目的。未來的研究可繼續深入至細胞層面，對相關作用機制進行更加深入的研究。