血漿ctDNA 與彌漫大B 細胞淋巴瘤免疫亞型及預后相關性

劉京偉 許風霞 周倩

彌漫大B 細胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是最常見的非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin's lymphoma，NHL）亞型，約占NHL 的30%～40%［1-2］。DLBCL 具有明顯的異型性及侵襲性，近年來，隨著利妥昔單抗的廣泛應用，患者生存期有所提高，但仍有部分患者治療后復發(fā)，預后較差［3］。因此，識別高危患者，實施個體化治療成為DLBCL 研究熱點。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是循環(huán)游離DNA（circulating cell free DNA，cfDNA）的一部分，由腫瘤細胞直接分泌，具有精確分子監(jiān)測效能［4］。目前，ctDNA 已被證明可用于肝癌、非小細胞肺癌、胰腺癌、結腸癌等多種腫瘤診斷、預后評估和復發(fā)監(jiān)測，具有作為生物標志物的潛在作用［5-6］。本研究嘗試探討DLBCL 患者血漿ctDNA 表達與免疫亞型及預后的相關性。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年4 月至2021 年4 月山東省臨沂市中心醫(yī)院94 例DLBCL 患者為研究對象，均符合DLBCL 診斷標準［7］，并經(jīng)組織病理和免疫組化確診；均采用標準R-CHOP 方案免疫化學治療；患者及家屬知情同意。其中男58 例，女36 例，年齡平均（58.93±7.82）歲。本研究經(jīng)院倫理委員會批準。

1.2 方法

①臨床資料收集：記錄入組患者性別、年齡、B 癥狀、美國東部協(xié)作腫瘤組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）體能狀況（performance status，PS）評分、國際預后指數(shù)（International Prognostic Index，IPI）評分、有無大包塊、疾病分期、乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）水平、B細胞淋巴瘤-2（B cell lympho-ma/leukemia 2 gene，Bcl-2）/核內原癌基因（nuclear oncogene，MYC）雙表達、免疫亞型。②血漿ctDNA 檢測：化療前采集外周血10 mL，24 h 內離心，分離血漿。提取血漿游離DNA（德國Qiagen 公司QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit），進行質量評價（美國Thermo公司Invitrogen Qubit kit 試劑盒及熒光計）。捕獲免疫球蛋白重鏈（IgH）目標基因組區(qū)域（美國InvivoScribe 公 司LymphoTrack IGH assay kit），擴增。構建DNA 文庫，加入MiSeq Reagent Kit V2（美國Illumina 公司）試劑盤中，進行二代測序（Illumina 測序儀，美國Illumina 公司）。導出FASTQ 文件，分析數(shù)據(jù)（LymphoTrack 軟件）。克隆序列頻率＞5%為單克隆性重排序列［8］。③免疫亞型：采用免疫組化法檢測MUM-1（北京中杉金橋公司鼠抗人MUM-1 單克隆抗體）、Bcl-6（北京中杉金橋公司鼠抗人Bcl-6 單克隆抗體）、CD10（福州邁新生物技術有限公司鼠抗人CD10 單克隆抗體），Bcl-6、CD10 在細胞核表達，CD10 在細胞膜表達，CD10 陽性為生發(fā)中心B 細胞樣（Germinal center B-cell-lik，GCB）；Bcl-6、CD10 均陰性為非GCB；若CD10 陰性，Bcl-6 陽性，用MUM1 來分類，MUM1陰性為GCB，MUM1 陽性為非GCB［9］。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 22.0 處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用n（%）表示，χ2檢驗，等級資料采用Ridit 檢驗；預后影響因素采用COX 回歸分析；使用相對超危險度比（RERI）、歸因比（AP）、交互作用指數(shù)（SI）分析ctDNA、免疫亞型評估DLBCL 患者預后的交互作用。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DLBCL 患者血漿ctDNA 表達

94 例DLBCL 患者中，78 例ctDNA 檢測呈陽性，16例ctDNA 檢測呈陰性，陽性率達82.98%（78/94）。

2.2 DLBCL 患者血漿ctDNA 表達與病理特征的關系

IPI 評分高風險患者ctDNA 陽性表達率高于IPI 評分低風險患者，ⅡB～Ⅳ患者ctDNA 陽性表達率高于Ⅰ～ⅡA 患者，Bcl-2/MYC 雙表達患者ctDNA 陽性表達率高于無Bcl-2/MYC 雙表達患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 DLBCL 患者血漿ctDNA 表達與病理特征的關系［n（%）］Table 1 Relationship between plasma ctDNA expression and pathological features in DLBCL patients［n（%）］

2.3 DLBCL患者血漿ctDNA表達與免疫亞型的關系

94 例DLBCL 患者中，GCB 31 例，非GCB 63例。GCB 患者中ctDNA 陽性22 例，陽性表達率70.97%（22/31）；非GCB 患者中ctDNA 陽性56 例，陽性表達率88.89%（56/63）。非GCB 患者ctDNA陽性表達率高于GCB 患者，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.724，P=0.030）。免疫組化圖。見圖1。

2.4 DLBCL 患者預后單因素分析

治療后隨訪1 年，生存78 例，死亡16 例。單因素分析顯示，性別、年齡、B 癥狀、ECOG PS 評分、IPI 評分、有無大包塊與DLBCL 患者預后無關（P＞0.05），疾病分期、LDH 水平、Bcl-2/MYC 雙表達、免疫亞型、ctDNA 陽性率對DLBCL 患者預后有關（P＜0.05）。見表2。

表2 DLBCL 患者預后單因素分析［n（%）］Table 2 Univariate analysis of prognosis in DLBCL patients［n（%）］

2.5 DLBCL 患者預后多因素COX 回歸分析

以預后情況為因變量（賦值：生存=0，死亡=1），將表2 中差異有統(tǒng)計學意義的項作為自變量（賦值：疾病分期：Ⅰ～ⅡA=1，ⅡB～Ⅳ=2；LDH 水平：正常=1，升高=2；Bcl-2/MYC 雙表達：無=0，有=1；免疫亞型：GCB=1，非GCB=2；ctDNA：陰性=0，陽性=1），應用COX 回歸模型分析，結果顯示，免疫亞型為非GCB 型、ctDNA 陽性均為DLBCL患者死亡的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 DLBCL 患者預后多因素COX 回歸分析Table 3 COX regression analysis of multivariate prognostic factors in DLBCL patients

2.6 ctDNA、免疫亞型評估DLBCL 患者預后的交互作用

ctDNA 陽性為（+），陰性為（-），免疫亞型非GCB 型為（+），GCB 型為（-）。調整混雜因素后，ctDNA、免疫亞型對DLBCL 患者不良預后存在正向交互作用，二者均為（+）時不良預后是二者均為（-）時的49.500 倍，是其他未知因子（OR=1）的34.140 倍（RERI=34.140），協(xié)同效應為二者單獨存在產(chǎn)生效應之和的3.390 倍（SI=3.390），在二者共存的不良預后風險中有68.97%（AP=68.97%）是由兩者協(xié)同作用引起的。見表4。

表4 ctDNA、免疫亞型評估DLBCL 患者預后的交互作用Table 4 Interaction of ctDNA and immune subtypes in evaluating prognosis of DLBCL patients

3 討論

ctDNA 占總cfDNA＜1%，但易擴增，隨著二代測序（Next generation sequencing，NGS）技術的臨床應用，其檢測靈敏度顯著提高，已成為腫瘤研究領域熱點［10］。DLBCL 是B 淋巴細胞惡性克隆性增生所致，而B 淋巴細胞分化成熟過程中，其IgH受體基因片段過基因重排形成特異可變性（V）多樣性（D）連接（J）序列。基于此原理，IgH VDJ 序列檢測可對B 淋巴細胞克隆性評估提供指導，并可作為DLBCL 分子標記物。利用VDJ 通用引物將NGS 與VDJ 基因片段擴增相結合，在DLBCL 患者血漿中進行ctDNA 檢測，靈敏度可達到1×10-6［11］。本研究采用上述特異性的捕獲測序法進行IgH 受體基因VDJ 重排的ctDNA 檢測，陽性率達82.98%（78/94），與王佳萍等［12］研究一致。分析DLBCL 患者血漿ctDNA 表達與病理特征的關系，發(fā)現(xiàn)IPI 評分高風險患者ctDNA 陽性表達率高于IPI 評分低風險患者，ⅡB～Ⅳ患者ctDNA 陽性表達率高于Ⅰ～ⅡA 患者，Bcl-2/MYC 雙表達患者ctDNA 陽性表達率高于無Bcl-2/MYC 雙表達患者，提示ctDNA 可一定程度反映患者腫瘤負荷。而王佳萍等［12］研究卻顯示，DLBCL 患者血漿ctDNA 表達與IPI 評分、疾病分期無關。差異原因可能與選取樣本量及患者個體差異有關。上述結果表明，IgH VDJ 重排的ctDNA 檢測陽性率較高，有助于DLBCL 早期輔助診斷，且可一定程度反映腫瘤負荷。

腫瘤分子生物學能夠更準確地指導DLBCL治療和預后判斷。本研究結果提示DLBCL 患者血漿ctDNA 表達可能與免疫亞型存在一定相關性。非GCB 型DLBCL 特點在于，多始發(fā)于淋巴結外組織，易發(fā)生結外浸潤，B 癥狀者占73.3%，Ⅲ、Ⅳ期患者占80.0%；而GCB 型結外浸潤較少，多無B 癥狀，以Ⅰ、Ⅱ期多見［13］。因此，非GCB 型DLBCL 侵襲性高于GCB 型，這可能是ctDNA 高表達的重要因素。

COX 回歸模型分析結果提示DLBCL 患者免疫亞型、ctDNA 表達對預后具有一定預測價值，非GCB 型DLBCL 侵襲性更高，預后更差，與既往研究［14］一致。研究證實，IgH 基因重排可作為復發(fā)監(jiān)測的生物標志物，特異度在98%以上［15］；而在臨床提示復發(fā)前，存在IgH 基因重排者占比存在較大差 異［16］。Roschewski 等［17］對108 例DLBCL患者治療2 個周期時IgH 基因重排進行檢測，發(fā)現(xiàn)IgH 基因重排可提示早期復發(fā)，特異度為88%，靈敏度為47%。這些結果也提示ctDNA 可作為DLBCL 患者預后預測的生物標志物，支持本研究結論。另外，交互作用分析可知，ctDNA、免疫亞型對DLBCL 患者不良預后存在正向交互作用。因此，免疫亞型為非GCB 型的DLBCL 患者更應注重ctDNA 檢測，從而為早期干預提供指導。目前，ctDNA 檢測在DLBCL 中應用價值已被初步驗證，但檢測過程較復雜，尚無統(tǒng)一檢測標準及質控，且成本高，尚無法在臨床廣泛應用。

綜上可知，DLBCL 患者ctDNA 檢測陽性率較高，且與病理特征、免疫亞型及預后有關，有望成為病情進展及預后預測標志物。