重癥齲患兒唾液TRPA1、NLRP3 的表達水平及臨床意義

李姣 郭戰坤 魏鵬 李雪莉 李燕

齲齒是兒童常見的口腔疾病，表現為牙體組織進行性破壞并產生齲洞。齲齒的發生和進展是多因素共同作用的結果，不及時干預會導致侵蝕范圍擴大、多個牙齒多個牙面同時受累，最終形成重癥齲。重癥齲嚴重影響患兒的學習和生活，也增加遠期牙齦炎、牙髓炎等疾病的發生風險［1-2］。因此，深入研究重癥齲的相關生物學因素，對早期識別疾病發生風險、及時進行干預具有重要意義。相關的基礎研究結果顯示，瞬時電位受體離子通道（transient receptor potential，TRP）家族中的TRPA1 以及Nod樣受體（Nod like receptor，NLR）家族中的NLRP3參與齲齒的進展［3-4］。為深入認識TRPA1、NLRP3在重癥齲中的作用，本研究對重癥齲患兒唾液TRPA1、NLRP3 的表達水平及臨床意義進行分析。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2021 年1 月至2022 年6 月期間在保定市婦幼保健院接受治療的142 例齲齒患兒作為研究對象，納入標準：①符合齲齒診斷標準［5］；②年齡3～7 歲；③未接受過齲齒相關治療；④留取唾液標本；⑤臨床資料完整。排除標準：①合并全身性疾病或先天性疾病；②佩戴牙齒矯正器的兒童；③不能配合本研究。根據齲齒嚴重程度［5］將142 例齲齒患兒分為重癥組（n=46）和非重癥組（n=96）。另取同期體檢的70 名無齲齒健康兒童作為對照組（n=70）。三組間一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。本研究獲得醫院倫理委員會批準，取得受試兒童監護人知情同意。

表1 三組一般資料比較（）Table 1 Comparison of general information among the three groups（）

表1 三組一般資料比較（）Table 1 Comparison of general information among the three groups（）

1.2 齲齒嚴重程度評價標準

評價口腔中發生齲病的牙數或者牙面數，計算齲失補指數（decayed-mising-filled teeth，DMFT）［5］=齲壞牙+失牙數+因齲填 充牙齒，DMFT=0 為無齲 齒、DMFT＜4 為非重 癥齲齒、DMFT≥4 為重癥齲齒。

1.3 唾液樣本收集及檢測

收集唾液前所有受試者進行漱口、清潔口腔，而后將唾液約100 μL 收集于干燥無菌的試管內，常溫下按照速度3 500 r/min、半徑10 cm 離心20 min，取上清液用于TRPA1 和NLRP3 檢測。采用放射免疫法檢測TRPA1 和NLRP3 的蛋白表達水平，所有實驗均由同一名人員按照放射免疫法試劑盒（型號F00014、F00042，上海西唐生物科技公司）說明書完成。

1.4 齲齒患兒臨床資料收集

根據齲齒患兒的病歷信息收集以下資料：年齡、性別、吃甜食頻率、開始刷牙時間、每天刷牙次數、使用含氟牙膏、家長監督刷牙，吃甜食頻率分為＜2 次/天和≥2 次/天，開始刷牙年齡分為＜3 歲和≥3 歲，每天刷牙頻率分為＜2 次和≥2 次，使用含氟牙膏和家長監督刷牙均分為否或是。

1.5 統計學處理

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學處理，計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析、兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以n（%）表示，組間比較采用卡方檢驗；采用Pearson 檢驗進行相關性分析；采用受試者工作特性曲線（ROC）分析唾液TRPA1、NLRP3 對重癥齲的診斷價值；采用多因素logistic 逐步回歸分析重癥齲的影響因素。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組唾液TRPA1、NLRP3 表達水平比較

三組唾液TRPA1、NLRP3 表達水平比較為：重癥組＞非重癥組＞對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 三組唾液TRPA1、NLRP3 表達水平比較［（），pg/mL］Table 2 Comparison of TRPA1 and NLRP3 expression levels in saliva of subjects among the three groups［（），pg/mL］

表2 三組唾液TRPA1、NLRP3 表達水平比較［（），pg/mL］Table 2 Comparison of TRPA1 and NLRP3 expression levels in saliva of subjects among the three groups［（），pg/mL］

注：與對照組比較，aP＜0.05；與非重癥組比較，bP＜0.05。

2.2 齲齒患兒唾液TRPA1、NLRP3 表達水平與DMFT 的相關性

重癥組齲齒患兒唾液TRPA1、NLRP3 的表達水平與DMFT 呈正相關（r=0.351、0.384，P＜0.05）；非重癥組齲齒患兒唾液TRPA1、NLRP3 的表達水平與DMFT 無明顯相關性（P＞0.05）。

2.3 唾液TRPA1、NLRP3 表達水平對重癥齲的診斷價值

以齲齒患兒是否重癥作為狀態變量繪制ROC曲線，唾液TRPA1、NLRP3 表達水平診斷重癥齲的曲線下面積分別為0.850、0.864，兩項指標診斷重癥齲的截斷值分別為1.41 pg/mL、2.54 pg/mL，靈敏度分別為76.09%、89.13%，特異度分別為83.33%、82.29%。見表3、圖1。

圖1 ROC 曲線Fig. 1 ROC curve

表3 唾液TRPA1、NLRP3 表達水平診斷重癥齲的ROC 曲線分析Table 3 ROC curve analysis of TRPA1 and NLRP3 expression levels in saliva for diagnosis of severe caries

2.4 發生重癥齲的單因素分析

重癥組與非重癥組患兒的年齡、性別、開始刷牙年齡、使用含氟牙膏比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；重癥組患兒吃甜食頻率≥2 次/天的比例及唾液TRPA1、NLRP3 表達水平高于非重癥組，刷牙頻率≥2 次/天、家長監督刷牙比例低于非重癥組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 發生重癥齲的單因素分析［（），n（%）］Table 4 Univariate analysis of severe caries［（），n（%）］

表4 發生重癥齲的單因素分析［（），n（%）］Table 4 Univariate analysis of severe caries［（），n（%）］

2.5 發生重癥齲的多因素logistic 回歸分析

以重癥齲為因變量（非重癥齲=0、重癥齲=1），以2.4 單因素分析中有統計學意義的因素作為自變量，采用逐步發進行多因素logistic 回歸分析，吃甜食頻率≥2 次/天、唾液TRPA1 表達水平≥1.41 pg/mL、唾液NLRP3 表達水平≥2.54 pg/mL 是發生重癥齲的危險因素，刷牙頻率≥2 次/天、家長監督刷牙是發生重癥齲的保護因素（P＜0.05）。見表5。

表5 發生重癥齲的多因素logistic 回歸分析Table 5 Multivariate logistic regression analysis of severe caries

3 討論

兒童齲齒是影響兒童口腔健康的常見疾病，其是在多因素作用下出現乳牙牙體組織無機物脫礦、硬組織崩解并進行性破壞而產生齲洞。齲齒形成后如不能及時對導致齲齒形成的因素進行干預，會導致牙體組織破壞范圍擴大、多個牙齒及多個牙面同時受累，進而形成重癥齲。重癥齲的臨床危害大，不僅直接影響咀嚼功能、不利于恒牙和頜面發育，還會增加遠期牙齦炎、牙髓炎的發生風險，嚴重影響患兒身心健康［6-7］。目前，對齲齒特別是重癥齲分子生物學機制的認識不足極大地限制了疾病的早期識別及靶向治療。

乳牙牙體礦化程度低、硬組織薄、抗酸力弱是導致齲齒形成的內在因素，兒童喜食甜食、刷牙習慣不正確或效果不佳等是導致齲齒形成的外在因素，在兩方面因素共同作用下，致齲微生物大量繁殖、酸性代謝產物大量形成并最終導致牙體組織破壞，產生齲洞［8-9］。國內外重癥齲相關的臨床研究結果顯示：吃甜食頻率高、刷牙次數不足、家長口腔健康意識不足均會增加重癥齲的風險［10-12］。本研究中，吃甜食頻率≥2 次/天是發生重癥齲的危險因素，而刷牙頻率≥2 次/天、家長監督刷牙是發生重癥齲的保護因素，與既往重癥齲相關因素的研究結果［10-12］基本吻合。以上研究結果主要反映重癥齲發病的外在因素，未能從內在因素認識重癥齲的發病。

致齲微生物大量繁殖是導致齲齒形成的重要生物學因素，致齲微生物能夠作為上游生物學信號引起下游信號通路活化，進而導致炎癥反應、氧化應激反應激活以及免疫紊亂，最終造成牙體組織損害［13-14］。TRP 家族和NLR 家族在識別微生物、調控生物信號轉導中發揮重要作用。TRPA1 和TRPV1 是TRP 家族的重要成員，一項基礎研究［3］證實TRPA1 在齲齒形成中起促進作用、而TRPV1 不發揮作用；NLRP1、NLRP3、NLRC4 是NLR 家族的重要成員，一項基礎研究［15］證實NLRP1、NLRC4不參與齲齒形成，另一項基礎研究證實［4］NLRP3參與齲齒形成。本研究中，重癥齲和非重癥齲患兒唾液中TRPA1 和NLRP3 的表達水平均較對照組增加且重癥齲患兒中上述表達增加更顯著，與既往相關基礎研究的結果一致［4，15］，提示TRPA1和NLRP3 高表達與重癥齲的發病相關。

TRPA1 為鈣離子依賴性通道，微生物感染后炎癥介質和氧化應激產物的釋放能夠刺激TRPA1 表達，進而在牙組織、關節軟骨組織等損傷中起促進或加重作用［16］。NLRP3 為模式識別受體，識別微生物等病原模式分子后使下游炎癥小體活化，進而激活炎癥反應及細胞焦亡，進而在牙組織、心肌組織等損傷中起促進或加重作用［17］。本研究結果提示TRPA1 和NLRP3 高表達可能通過激活炎癥反應、氧化應激反應等方式導致重癥齲的進展。進一步通過ROC 曲線分析及影響因素分析可知：唾液中TRPA1 和NLRP3 的表達水平對重癥齲具有診斷價值，TRPA1 和NLRP3 高表達是發生重癥齲的危險因素。

綜上所述，重癥齲患兒唾液中TRPA1、NLRP3表達增加，重癥齲發病可能與TRPA1、NLRP3 表達增加介導的生物學效應相關，這可為今后臨床重癥齲新的防治靶點研發提供依據。