芯片式數(shù)字PCR 檢測(cè)禽流感病毒方法的性能驗(yàn)證

嚴(yán)謹(jǐn) 姜欣余 閻琪 陳小鳳

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，利用脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）聚合酶擴(kuò)增DNA 片段。自20 世紀(jì)80 年代初發(fā)明以來，PCR 已成為檢測(cè)微生物不可或缺的工具。數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是傳統(tǒng)PCR的改進(jìn)型生物技術(shù)，可以擴(kuò)增和直接定量DNA。1992 年，Sykes 提出了dPCR 的概念，它通過泊松分布和稀釋模板來量化DNA 分子到單分子水平［1］。Volgelstein 和Kinzler 在1999 年首次將dPCR 應(yīng)用于研究中，通過一系列四個(gè)96 孔板，對(duì)結(jié)直腸癌患者樣品進(jìn)行物理分區(qū)，以檢測(cè)ras 癌基因中的突變［2］。近年來，隨著微流控技術(shù)日臻成熟，基于微流控技術(shù)的數(shù)字PCR（chip-based digital PCR）技術(shù)得到了快速發(fā)展，在基因突變檢測(cè)、拷貝數(shù)變異檢測(cè)、病毒微生物檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)以及二代測(cè)序等方面均得到廣泛的應(yīng)用。

禽流感病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)是實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技 術(shù)（Quantitative real-time PCR，qPCR）［3］，qPCR 方法的優(yōu)點(diǎn)是高通量和較高靈敏度，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果易受樣品抑制劑影響，導(dǎo)致擴(kuò)增效率低，在低濃度樣品中精確度較低，且主觀性強(qiáng)，量化取決于標(biāo)準(zhǔn)曲線［4-5］。作為新興PCR 平臺(tái)的dPCR，具有更高的抑制劑耐受性，且它是終點(diǎn)法測(cè)量，較少依賴于PCR 擴(kuò)增效率［6-7］。其原理是將一個(gè)PCR 混合物分離成許多獨(dú)立的納升級(jí)亞反應(yīng)，單個(gè)分區(qū)有少量或沒有目標(biāo)序列。PCR 完成后，確定每個(gè)樣本的陽(yáng)性和陰性分區(qū)的比例，并通過泊松統(tǒng)計(jì)來計(jì)算核酸絕對(duì)拷貝數(shù)［8］。由于分區(qū)被計(jì)數(shù)為正數(shù)或負(fù)數(shù)的二進(jìn)制性質(zhì)，使量化更加簡(jiǎn)單。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源

甲型流感標(biāo)準(zhǔn)品是由本單位儲(chǔ)藏，濃度為1×107copies/mL 的質(zhì)粒，并保存于-80℃超低溫冰箱；根據(jù)重慶市禽流感監(jiān)測(cè)方案，于2022 年1 月采集的人和加新農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)禽流感外環(huán)境標(biāo)本31 份。

1.1.2 試劑與儀器

主要試劑與儀器：甲型流感病毒檢測(cè)試劑盒（PCR 熒光探針法）、甲型流感病毒試劑盒（數(shù)字PCR 法）（均購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）；核酸提取試劑盒（購(gòu)自中元公司）；dPCR 系統(tǒng)（購(gòu)自新加坡JN MEDSYS 公司）；核酸提取儀（購(gòu)自碩世公司）；生物安全柜、PCR 擴(kuò)增儀（均購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司）；振蕩器（購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司）；移液器（購(gòu)自瑞士METTLER TOLEDO 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集、病毒基因組提取

禽流感標(biāo)本從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)攤販的案板、籠具及刀具表面和禽類排泄物中涂抹采集到病毒采樣管中，取200 μL 采樣液用病毒核酸提取試劑盒抽提禽流感病毒基因組RNA。

1.2.2 反應(yīng)體系配制、微反應(yīng)制備

Clarity dPCR 系統(tǒng)應(yīng)用了一種獨(dú)特的管內(nèi)芯片格式，通過使用自動(dòng)裝載器同時(shí)裝載和劃分8 個(gè)反應(yīng)混合物，可以高效快速地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨后用密封增強(qiáng)劑和密封流體將反應(yīng)混合物密封在隔板中。接著，對(duì)反應(yīng)進(jìn)行熱循環(huán)。熱循環(huán)后，管條被轉(zhuǎn)移到Clarity 閱讀器中，以檢測(cè)隔板中的熒光信號(hào)。最后，通過Clarity 軟件分析陽(yáng)性與陰性分區(qū)的比例，并使用泊松統(tǒng)計(jì)來計(jì)算每個(gè)樣本的拷貝數(shù)濃度。體系配制，微反應(yīng)制備，結(jié)果讀取均按說明書操作。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立并比較兩種方法的線性范圍和吻合度

流感質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（以下簡(jiǎn)稱為標(biāo)準(zhǔn)品）建立qPCR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，選取濃度為1×107copies/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10 倍稀釋，稀釋至1.00×103copies/mL，每個(gè)稀釋度分別重復(fù)做三次檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋成3.05×102copies/mL～1.00×107copies/mL 16 個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別重復(fù)做三次檢測(cè)。觀察用兩種方法檢測(cè)上述16 個(gè)稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果的線性范圍以及和預(yù)期結(jié)果的相關(guān)性，并用線性回歸比較兩種方法的吻合程度。

1.2.4 精密度試驗(yàn)

分析方法的精密度取決于同一樣品在特定條件下多次測(cè)定獲得的一系列測(cè)量結(jié)果的接近程度，通過分析標(biāo)準(zhǔn)品在不同稀釋度下的變異系數(shù)（Coefficient of Variance，CV），測(cè)試使用相同的設(shè)備，通過計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品在各稀釋水平下被測(cè)濃度的變異系數(shù)（CV）來評(píng)價(jià)衡量精密度，用百分比表示。CV 值越低，精密度越高。

1.2.5 靈敏度試驗(yàn)

通過將標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次稀釋到2.00×103，1.00×103，8.00×102，6.00×102，5.00×102，3.00×102，2.50×102，1.25×102，測(cè)定分析靈敏度，定義為檢測(cè)下限（Limit of Detection，LOD）。每個(gè)稀釋度進(jìn)行20 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并使用概率回歸分析結(jié)果。LOD 定義為檢測(cè)概率為95%的反應(yīng)中目標(biāo)DNA 的濃度，并通過插值概率曲線確定。

1.2.6 dPCR 和qPCR 在檢測(cè)環(huán)境樣本中的比較

用兩種方法分別檢測(cè)31 份農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)環(huán)境標(biāo)本，分別得到熒光定量PCR 和數(shù)字PCR 的檢測(cè)結(jié)果。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26 統(tǒng)計(jì)軟件和Graphpad prism8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用Bland-Altman 分析評(píng)價(jià)dPCR 與qPCR 的一致性。采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)評(píng)估兩種方法陽(yáng)性率的差異。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法的線性范圍及線性回歸分析

dPCR在3.05×102copies/mL～1.00×107copies/mL測(cè)量范圍內(nèi)，測(cè)量值和預(yù)測(cè)值具有良好的線性關(guān)系。兩者在線性范圍內(nèi)斜率之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.996，P=0.321）。見圖1。

圖1 核酸標(biāo)準(zhǔn)品與dPCR 和qPCR 定量結(jié)果的線性關(guān)系Fig. 1 Linear relationship of dPCR and qPCR for plasmid DNAs

2.2 兩種方法的批內(nèi)精密度

相同條件下，隨著濃度降低，dPCR 和qPCR 的CV 值越高，精密度下降，在15 個(gè)都能檢測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度中，dPCR 有12 個(gè)稀釋度的CV 值低于qPCR，特別是在標(biāo)準(zhǔn)品濃度小于1×104copies/mL，dPCR 的CV 值遠(yuǎn)低于qPCR。見圖2。

圖2 dPCR 和qPCR 在各稀釋水平下的變異系數(shù)Fig. 2 Coefficient of Variation at each dilution level by dPCR and qPCR

2.3 兩種方法的檢測(cè)下限（LOD）

標(biāo)準(zhǔn)品的連續(xù)稀釋的概率回歸分析，估算dPCR的LOD 為410（95%CI：344～570）copies/mL，qPCR的LOD 為845（95%CI：749～1 004）copies/mL，相比之下，dPCR 檢測(cè)具有更低的檢測(cè)下限。見圖3。

圖3 概率分析曲線計(jì)算dPCR 和qPCR 的最低檢出限Fig. 3 Probit analysis sigmoid curve reporting the LoD of dPCR and qPCR

2.4 兩種方法檢測(cè)禽流感環(huán)境標(biāo)本結(jié)果比較

針對(duì)31 份禽流感環(huán)境標(biāo)本的核酸檢測(cè)，結(jié)果表明dPCR 的檢出率（96.8%）高于qPCR 檢出率（80.6%），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Kappa=0.244，P=0.063）。采 用Bland-Altman 分析評(píng) 價(jià)dPCR 與qPCR 的一致性，經(jīng)分析兩種定量檢測(cè)方法的偏倚值為1.265 139，兩種方法95%一致性界限為1.265 139±1.96×4.689 898。見圖4。

圖4 dPCR 和qPCR 定量檢測(cè)禽流感病毒的Bland-Altman分析圖Fig. 4 The Bland-Altman analysis of quantitative Avian influenza virus by dPCR and qPCR

3 討論

市場(chǎng)上現(xiàn)有的商業(yè)dPCR 平臺(tái)主要采用兩種方法：一種是QX100?/200?滴式dPCR 系統(tǒng)（Bio-RadLaboratories）和Naica?系統(tǒng)（StillaTechnologies）采用的基于水油乳化液滴技術(shù)的方法；另一種是BioMark?HD（Fluidigm）、QuantStudio?3D（Thermo-FisherScientific）、qiacity（QIAGEN）和Clarity?（JNMedsys）采用的基于芯片/納米板技術(shù)［9］的方法。然而，液滴式dPCR 在熱循環(huán)過程中可能會(huì)出現(xiàn)液滴合并的現(xiàn)象，導(dǎo)致樣品丟失［10-11］，因此低豐度樣品可能存在漏檢的情況。本實(shí)驗(yàn)采用JNMedsys公司推出的一種名為Clarity?的新型dPCR 系統(tǒng)，該系統(tǒng)結(jié)合了基于液滴和基于芯片系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，用一種新穎的管中芯片的方法來進(jìn)行樣品劃分。每個(gè)反應(yīng)混合在高密度芯片上被細(xì)分為10 000 個(gè)分區(qū)。這種基于芯片的分區(qū)設(shè)計(jì)提供了更好的穩(wěn)定性，且簡(jiǎn)化了液滴式PCR 相關(guān)的繁瑣工作流程，減少了檢測(cè)時(shí)間。需要指出的是，dPCR 作為一種新興技術(shù)，目前可用的系統(tǒng)代表了第一代或第二代平臺(tái)。研究人員正在開發(fā)新的平臺(tái)和方法，通過強(qiáng)化利用dPCR 的理論優(yōu)勢(shì)，來解決現(xiàn)有的局限性。例如，增加dPCR 可檢測(cè)的熒光通道數(shù)量［12］；開發(fā)基于分區(qū)體積的變化［13］來糾正目標(biāo)分子豐度的估計(jì)的算法。因此，隨著時(shí)間的推移，dPCR 有望得到不斷的改進(jìn)和增強(qiáng)，我們可以展望，比起現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)，未來的檢測(cè)平臺(tái)可能會(huì)表現(xiàn)出更多指標(biāo)上的優(yōu)勢(shì)。

禽流感病毒的定量分析能力可以提高對(duì)病毒生物學(xué)的認(rèn)識(shí)，而dPCR 提供了一個(gè)更加高效的平臺(tái)。在本研究中，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在3.05×102copies/mL～1.00×107copies/mL 是因?yàn)檫@一范圍覆蓋了儀器制造商推薦的輸入拷貝范圍。在這一濃度范圍內(nèi)，與dPCR 檢測(cè)值呈良好的線性關(guān)系，R2=0.996 9，dPCR 和qPCR 在線性范圍內(nèi)斜率之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；dPCR 在不同稀釋度的批內(nèi)精密度變異系數(shù)（CV）范圍為2.36%～22.78%，在低濃度下，dPCR 比qPCR 展現(xiàn)出更好的精密度；dPCR的估計(jì)檢測(cè)下限（LOD）為410（95%CI，344～570）copies/mL，qPCR 的估計(jì)LOD 為845（95%CI，749～1 004）copies/mL；用dPCR 和qPCR 檢測(cè)31 份農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)環(huán)境標(biāo)本，dPCR 的檢出率96.8%，qPCR 的檢出率80.6%，兩種方法的定量一致性較好。由于標(biāo)準(zhǔn)品的限制，未能精確的確定dPCR 的線性動(dòng)態(tài)范圍上限，但數(shù)據(jù)顯示Clarity Plus?dPCR 至少在1.00×102～1.00×107，6 個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度范圍內(nèi)展現(xiàn)了良好的線性關(guān)系。

研究表明增加dPCR 的分區(qū)數(shù)量或者稀釋目標(biāo)DNA 可以獲得較高的檢測(cè)范圍［14］。Clarity Plus?dPCR 系統(tǒng)在檢測(cè)禽流感病毒中展現(xiàn)出優(yōu)異的性能，并成功檢測(cè)出低豐度病毒RNA 樣本，具有較高檢測(cè)精確度。鑒于這些優(yōu)點(diǎn)，使用Clarity-Plus?dPCR 有可能在臨床應(yīng)用中作為一種有效的分子診斷工具，用于檢測(cè)低豐度的禽流感病毒標(biāo)本或通過絕對(duì)定量來監(jiān)測(cè)病人治療的有效性。此外，該技術(shù)還可用于其他病毒例如新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的環(huán)境監(jiān)測(cè)。在廢水等環(huán)境樣本中檢測(cè)SARS-CoV-2，可以為社區(qū)中的疾病傳播和暴發(fā)提供早期預(yù)警信號(hào)［15］。

綜上，與傳統(tǒng)qPCR相比，dPCR在性能方面的優(yōu)勢(shì)使其在病原檢測(cè)上顯示出巨大的潛力和應(yīng)用前景。