基于Nrf2-GPX4 通路介導鐵死亡研究卒中后認知功能障礙的中醫治療及療效

陳俊 楊杰 馮海松 濮捷 陳博

卒中后認知功能障礙是缺血性腦卒中后常見的后遺癥，表現為記憶力和理解力降低、交流困難，直接影響患者生活、也增加家庭和社會負擔［1］。中醫認為該病屬于“健忘”、“癡呆”、“郁證”等范疇，病機在于正氣虛弱、痰瘀互結、閉阻經絡，治療應以益氣活血、化瘀通絡為主［2］。補陽還五湯是益氣活血的代表方，出自清代的《醫林改錯》，臨床實踐中多用于氣虛血瘀證的治療［3］。有研究報道補陽還五湯用于腦卒中的治療能夠改善偏癱［4］，但對認知功能的影響及相關機制尚不明確。現代生物醫學研究認為核因子紅細胞2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）/谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase4，GPX4）通路是調控鐵死亡的重要信號通路之一，卒中后認知功能障礙的發生與Nrf2/GPX4通路異常有關［5］，補陽還五湯對腦損傷大鼠模型的治療作用與調控Nrf2/GPX4 通路有關［6］。為初步認識補陽還五湯治療卒中后認知功能障礙的療效及機制，本研究對補陽還五湯治療卒中后認知功能障礙的療效及其對Nrf2-GPX4 通路介導鐵死亡的影響展開分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020 年12 月至2022 年5 月期間湖北省中醫院（湖北中醫藥大學附屬醫院收治的卒中后認知功能障礙患者作為研究對象，入組標準：①符合《卒中后認知障礙管理專家共識（2017）》［7］中的診斷標準，病程≤6 月；②首次發生卒中；③意識清楚、無吞咽功能障礙。排除標準：①合并其他影響認知功能的疾病；②合并惡性腫瘤；③合并精神疾?。虎芎喜⒏文I功能不全；⑤對研究所用藥物過敏。共納入84 例患者，根據隨機數字表分為觀察組（n=42）和對照組（n=42）。兩組患者一般資料的比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。本研究經湖北省中醫院醫學倫理委員會批準，取得入組患者或家屬的知情同意。

表1 兩組患者一般資料的比較［（），n（%）］Table 1 Comparison of general data between the two groups［（），n（%）］

表1 兩組患者一般資料的比較［（），n（%）］Table 1 Comparison of general data between the two groups［（），n（%）］

1.2 治療方法

兩組患者進行抗血小板、降脂穩定斑塊、降壓、降糖等基礎治療，對照組加用奧拉西坦膠囊、800 mg/次 口服、3 次/d。觀察組加用奧拉西坦膠囊、800 mg/次 口服、3 次/d 及補陽還五湯 每日1劑、水煎取汁400 mL、分早晚2 次服用。補陽還五湯由醫院藥劑科制備，成分為黃芪30 g，當歸、赤芍、川芎各10 g，桃仁、紅花、地龍各5 g。兩組均以4 周為一個療程、連續治療3 個療程。

1.3 觀察指標

1.3.1 認知功能評分

治療前及治療后3 個療程，參照專家共識［7］、采用簡易精神狀態檢查量表（Mini-mental State Examination，MMSE）和蒙特利爾認知評估量表（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）評價認知功能。

1.3.2 中醫證候積分

治療前及治療后3 個療程，參照《中藥新藥臨床研究指導原則》［8］進行中醫證候積分的評價。

1.3.3 外周血Nrf2、GPX4 表達的檢測

治療前及治療后3 個療程，在血常規采血管內采集空腹外周靜脈血2 mL，由同一名人員采用北京天根生化科技公司生成的試劑盒進行檢測，均按照試劑盒說明書進行操作。采用全血RNA 分離試劑盒提取外周靜脈血的RNA，采用cDNA 第一鏈合成試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，采用熒光定量檢測試劑盒檢測Nrf2、GPX4 的mRNA 表達水平。

1.3.4 血清MDA、8-OHdG、TfR1 的檢測

治療前及治療后3 個療程，在生化采血管內采集空腹外周靜脈血5 mL，靜置30 min 等待自然凝血，在離心機中按照溫度4℃、半徑10 cm、轉速3 000 r/min 離心10 min，分離血清后由同一名人員采用酶聯免疫吸附法試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）進行丙二醛（MDA）、8-羥基脫氧尿苷酸（8-OHdG）、轉鐵蛋白受體1（TfR1）的檢測，均按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 統計學處理

采用SPSS 23.0 軟件進行統計學處理。計數資料用n（%）描述，行χ2檢驗；計量資料以（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗、組內采用配對樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者治療前后MoCA 評分、MMSE 評分的比較

治療前，兩組患者MoCA 評分、MMSE 評分比較的差異無統計學意義（P＜0.05）；治療后，兩組患者的MoCA 評分、MMSE 評分高于治療前且觀察組高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者治療前后MoCA 評分、MMSE 評分的比較（）Table 2 Comparison of MoCA score and MMSE score before and after treatment between the two groups（）

表2 兩組患者治療前后MoCA 評分、MMSE 評分的比較（）Table 2 Comparison of MoCA score and MMSE score before and after treatment between the two groups（）

2.2 兩組患者治療前后中醫證候積分的比較

治療前，兩組患者中醫證候積分比較的差異無統計學意義（P＜0.05）；治療后，兩組患者的中醫證候積分低于治療前且觀察組低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組患者治療前后中醫證候積分的比較（）Table 3 Comparison of TCM syndrome scores before and after treatment between the two groups（）

表3 兩組患者治療前后中醫證候積分的比較（）Table 3 Comparison of TCM syndrome scores before and after treatment between the two groups（）

2.3 兩組患者治療前后外周血Nrf2、GPX4 表達的比較

治療前，兩組患者外周血Nrf2、GPX4 mRNA表達水平比較的差異無統計學意義（P＜0.05）；治療后，兩組患者的外周血Nrf2、GPX4 mRNA 表達水平高于治療前且觀察組高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組患者治療前后外周血Nrf2、GPX4表達的比較（）Table 4 Comparison of Nrf2 and GPX4 expression in peripheral blood of patients before and after treatment between the two groups（）

表4 兩組患者治療前后外周血Nrf2、GPX4表達的比較（）Table 4 Comparison of Nrf2 and GPX4 expression in peripheral blood of patients before and after treatment between the two groups（）

2.4 兩組患者治療前后血清MDA、8-OHdG、TfR1含量的比較

治療前，兩組患者血清MDA、8-OHdG、TfR1 含量比較的差異無統計學意義（P＜0.05）；治療后，兩組患者的血清MDA、8-OHdG、TfR1 含量高于治療前且觀察組高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 兩組患者治療前后血清MDA、8-OHdG、TfR1 含量的比較（）Table 5 Comparison of serum MDA，8-OHdG and TfR1 contents before and after treatment between the two groups（）

表5 兩組患者治療前后血清MDA、8-OHdG、TfR1 含量的比較（）Table 5 Comparison of serum MDA，8-OHdG and TfR1 contents before and after treatment between the two groups（）

3 討論

缺血性腦卒中是臨床常見的腦血管疾病，腦組織缺血缺氧損害是疾病的基本特征，患者可出現運動功能、語言功能、認知功能等損害，不僅影響患者的日常生活，也極大地增加家庭和社會的負擔。近些年，卒中后認知功能障礙在腦卒中康復過程中的不利影響受到越來越多關注，針對性地改善認知功能具有重要的臨床意義［9-10］。

西醫治療卒中后認知功能障礙的手段包括抗血小板、調脂、抗氧化等基礎治療以及多奈哌齊、奧拉西坦等改善認知治療，但療效并不盡如人意。中醫療法在缺血性腦卒中及其后遺癥的治療中展現出獨到優勢，腦卒中屬于中醫理論的“中風”范疇，卒中后認知功能障礙屬于中醫理論的“健忘”、“郁證”范疇，多由氣虛血瘀引起［11］。補陽還五湯是治療缺血性腦卒中常用的中藥方，方中君藥黃芪能補氣通絡，臣藥當歸能活血祛瘀，配合赤芍、川芎、桃仁等藥物能夠針對氣虛血瘀發揮益氣活血的功效，進而改善缺血性腦卒中患者的肢體運動、語言等神經功能［12］。

本研究使用補陽還五湯對卒中后認知功能障礙進行治療，結果顯示：在西醫治療基礎上加用補陽還五湯治療后，患者的認知功能及中醫證候明顯改善，提示補陽還五湯對卒中后認知功能障礙患者的認知功能具有改善作用，可能的中醫機理是該湯劑發揮益氣活血通絡，使卒中后認知功能障礙患者的氣虛血瘀得到糾正、閉阻經絡得到改善，最終使認知功能優化、中醫證候減輕?，F代生物醫學對補陽還五湯中多味藥物的研究認為黃芪、赤芍、川芎、桃仁等藥物具有改善血流灌注、清除自由基、減輕炎癥反應等作用，與該湯劑益氣活血通絡的功效對應［13］。本研究將進一步探索補陽還五湯治療卒中后認知功能障礙的分子生物學機制。

卒中后認知功能障礙涉及的生物學環節復雜，包括炎癥反應、氧化應激反應、細胞凋亡、細胞自噬及新近發現的鐵死亡［14］。鐵死亡作為一種新型細胞死亡方式，以鐵超載和脂質過氧化為特征，與組織損傷過程中的炎癥反應、氧化應激反應、細胞凋亡等環節密切相關。有動物實驗證實，補陽還五湯對糖尿病小鼠的鐵死亡具有抑制作用；有網絡藥理學研究證實，補陽還五湯對缺血性腦卒中的鐵死亡具有抑制作用［15］。鐵死亡的生化特征是TfR1 表達增加以及氧化產物MDA、8-OHdG 釋放增加。相關臨床研究證實，血清MDA、8-OHdG 等標志物的含量增加與缺血性腦卒中后神經損害加重、認知功能障礙有關。本研究對上述指標的分析顯示：在西醫治療基礎上加用補陽還五湯治療后，患者血清中TfR1、MDA、8-OHdG 含量均降低，提示補陽還五湯用于卒中后認知功能障礙的治療能夠發揮抑制鐵死亡的作用。

綜上所述，補陽還五湯中醫治療改善卒中后認知功能障礙患者的認知功能及中醫證候，激活Nrf2-GPX4 通路、減輕鐵死亡是與之相關的分子機制。