大理白族自治州2018 年HIV/AIDS 病毒基因型和抗病毒治療前耐藥研究

金曉媚 ，何杰艷 ，施吉昌 ，邢 輝 ，王 洪 ，張 桔 ，董莉娟 ，黃麗花 ，陳 敏 ，陳志娟 ，陳會超

（1）云南省疾病預防控制中心性病艾滋病防制所，云南 昆明 650022;2）昆明醫科大學公共衛生學院，云南 昆明 650500;3）大理白族自治州疾病預防控制中心艾滋病性病防治科，云南 大理 671000;4）中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心病毒及免疫研究室，北京 102206）

隨著我國艾滋病抗病毒治療（antiretroviral therapy，ART）有效開展和覆蓋面的增加，顯著降低了我國HIV/AIDS 的死亡率[1]，但長期、大范圍的ART 導致了HIV-1 耐藥株的出現和流行。耐藥株的產生是導致抗病毒治療失敗的一個關鍵因素，耐藥株的傳播導致原發性耐藥的發生，給臨床治療中選擇藥物的過程帶來巨大的考驗，因此需要將ART 前基線耐藥是否會對ART 效果產生影響納入考慮范圍內。2014 年世界衛生組織提出了治療前耐藥監測的指南[2]，在以往耐藥傳播和耐藥發生監測的基礎上，重點關注治療前的耐藥水平，該監測中包括首次治療的人群和停藥再治療的人群，可以綜合反映一個地區耐藥傳播和耐藥發生的累計效應對治療效果的潛在影響，也被用來作為是否需要采取公共衛生應對措施的一個指標，如更換不含NNRTI 類藥物的一線治療方案。到2017 年底大理州存活 HIV/AIDS 共7 386人，其中6 203 人已接受抗病治療。目前還沒有學者對大理州進行過較為全面的治療前耐藥調查。此研究旨在調查大理州長期進行ART 后，起始ART 的人群中病毒基因型和耐藥株的流行水平，為該地區提供科學依據，以便于更好地控制HIV-1 耐藥毒株傳播。

1 對象與方法

1.1 研究對象

采用橫斷面調查方法，招募大理州2018 年1～8 月，年齡≥18 歲，起始抗病毒治療的HIV/AIDS，包括首次治療和停藥后又重新接受治療的HIV/AIDS 患者。在取得書面知情同意后，進行流行病學信息的收集，包括被調查者的年齡、性別、婚姻狀況、教育水平、感染途徑、既往抗病毒治療歷史以及CD4+T 淋巴細胞計數。采集EDTA 抗凝全血樣本，將其分離并存儲在-80 ℃的條件下。本研究經云南省生物醫學倫理審查委員會批準。

1.2 實驗室檢測

按照標準操作程序，使用凱杰生物技術（上海）有限公司的QIAsymphony SP，全自動核酸提取儀，從每個血漿樣本中提取HIV-1 病毒RNA，樣本體積為140 μL，采用in-house 方法，通過巢式PCR 對HIV-1 pol 區基因序列進行擴增，對應HXB2 的位置為2253-3553，引物序列和PCR 反應程序詳見以前的文獻[1]。在中國CDC 性病艾滋病預防控制中心病毒免疫研究室完成了HIV-1 RNA 提取和pol 基因區擴增。使用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產物條帶進行觀察，后將陽性樣品送至北京賽諾基因組研究中心有限公司純化和測序。測序引物見已發表的文獻[3]。

1.3 亞型鑒定和耐藥分析

成功獲取了序列后筆者采用Gene Codes 公司的Sequencher 5.1 軟件進行了序列拼接，多序列比對和序列整理使用的是Bioedit 軟件。為獲得HIV-1 的亞型或重組型，筆者使用了Mega 6.0 軟件來構建Neighbor-Joining（NJ）系統進化樹，接著利用Bootstrap 值大于70%的標準來鑒定HIV-1的亞型或重組型。重組分析采用了HIV 數據庫提供的RIP 3.0 分析工具進行深入研究。（http://www.hiv.lanl.gov）。并且借助斯坦福大學（http://hivdb.stanford.edu）的HIVdb 數據庫對所得序列進行耐藥位點和耐藥程度的判斷，耐藥程度分為敏感、潛在耐藥、低度耐藥、中度耐藥和高度耐藥。具體判定為耐藥的條件是在2014 年WHO 治療前耐藥監測指南[2]推薦的12 種監測藥物中，至少有1 種以上的藥物顯示出低度以上的耐藥性。

1.4 統計學處理

運用SPSS 21.0 軟件進行統計學分析。采用例數、比例或構成比（%）描述計數資料，人口學特征和HIV-1 基因型分布的比較采用χ2檢驗。雙側檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象人口學特征

2018 年1～8 月在大理州收集初始抗病毒治療的HIV/AIDS 患者122 例，采集血液樣品用于HIV-1 pol 區基因擴增，測序后得到滿足耐藥分析的pol 區基因序列樣品共114 份。

獲得pol 區基因序列的114 份樣品中，111 例（97.4%）為初始治療，3 例（2.6%）為停藥后重新入組治療，無既往預防服藥和母嬰阻斷的病例。男女性別比例為1.6∶1；平均年齡43 歲（19～78 歲）；漢族占74.6%（85/114），其他民族占25.4%（29/114）。婚姻狀況，未婚者占21.9%（25/114），已婚者占70.2%（80/114），離異/喪偶者占7.9%（9/114）。異性性傳播是主要傳播途徑，占81.6%（93/114），同性性傳播占9.6%（11/114），注射吸毒傳播占8.8%（10/114），見表1。艾滋病患者在所有研究對象中占到33.3%（38/114）。

表1 2018 年大理州初始抗病毒治療的HIV/AIDS 人口學特征基本情況Tab.1 Demographic characteristics of the subjects

2.2 HIV-1 基因型分布特征

研究對象中存在7 種HIV-1 的基因型，按照從高到低的順序排列，構成比如下：CRF08_BC（59.6%，68/114）、CRF07_BC（25.4%，29/114）、CRF01_AE（7.0%，8/114）、URFs（4.4%，5/114）、CRF85_BC（1.8%，2/114）、C 亞型（0.9%，1/114）、CRF55_01B（0.9%，1/114）。在URFs 中，主要為BC 重組，占60%（3/5），其他包括CRF01_AE/B（20%，1/5）和CRF01_AE/BC（20%，1/5）。

HIV-1 基因型在性別、民族、婚姻狀況和CD4+T 淋巴細胞計數的分布上差異無統計學意義（P＞ 0.05），而在年齡和感染途徑的分布，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。CRF08_BC 在注射吸毒傳播和異性性傳播中均有分布，在同性性傳播中未檢測到，分布差異有統計學意義（χ2=15.495，P≤ 0.001；χ2=11.667，P=0.001）；CRF01_AE 則主要分布在性傳播人群中，且同性性傳播人群中比例較異性性傳播人群中高，差異有統計學意義（χ2=8.991，P=0.003）。在年齡分布中，CRF08_BC 主要分布在31 歲以上年齡組中，在 ≤ 30 歲年齡組中比例較低，差異有統計學意義（χ2=4.970，P=0.026）；而CRF01_AE 主要分布于 ≤ 30 歲年齡組，同31 歲以上年齡組中分布相比差異有統計學意義（χ2=23.270，P≤ 0.001）。

表2 2018 年大理州初始抗病毒治療的HIV/AIDS 中HIV-1 基因型分布情況[n（%）]Tab.2 Demographic characteristics and genotype distribution of the subjects [n（%）]

2.3 治療前HIV-1 耐藥情況

在獲得基因序列的114 例樣品中，25 例（21.9%，25/114）攜帶耐藥突變位點，其中1 例（0.9%，1/114）攜帶核苷類反轉錄酶抑制劑（NRTIs）的耐藥位點，耐藥位點為M41L，針對齊多夫定（AZT）和司他夫定（D4T）低度耐藥；22 例（19.3%，22/114）攜帶非核苷類反轉錄酶抑制劑（NNRTIs）的耐藥位點，但只有1 例出現低度以上耐藥，所攜耐藥位點K103N，V108I，H221Y 對依非韋倫（EFV）和奈韋拉平（NVP）高度耐藥；2 例（1.8%，2/114）攜帶蛋白酶抑制劑（PI）的耐藥位點，均為耐藥敏感。比例較高的突變位點E138A（9.6%，11/114）和V179D/E（9.6%，11/114）均為輔助耐藥突變位點，獨立存在不引起耐藥，按照WHO 治療前耐藥監測的耐藥判斷標準，HIV-1 耐藥率為1.8%（2/114），其 中NRTIs 耐藥率為0.9%（1/114），NNRTIs 耐藥率為0.9%（1/114），見表3。

表3 大理州HIV/AIDS 抗病毒治療前HIV-1 耐藥位點與耐藥程度 [n（%）]Tab.3 HIV-1 resistance sites and degree of resistance before antiretroviral therapy [n（%）]

3 討論

本研究結果顯示大理州HIV/AIDS 中HIV-1基因型主要以CRF08_BC 為主，其次是CRF07_BC 和CRF01_AE，這和既往監測數據一致[4-7]，表明大理州自HIV-1 流行以來，CRF08_BC 仍然是當地最主要的HIV-1 流行株。但近年來，大理州也發現了少量的獨特型重組形式（unique recombinant forms，URFs）和其它流行重組形式（circulating recombinant forms，CRFs）。本次調查發現了5 例URFs（4.4%，5/114）和2 例CRFs（1.8%，2/114），其中URFs 中以BC 重組常見。

大理州HIV-1 基因型在傳播途徑中的構成存在差異，表現為異性性傳播和注射吸毒傳播中以CRF08_BC 為主，同性性傳播中以CRF07_BC 和CRF01_AE 為主，這與云南省總體的流行特征一致[8-9]。URFs 在注射吸毒、同性性傳播和異性性傳播人群中分布差異無統計學意義，BC 重組仍主要存在于注射吸毒人群，表明該地區基因型重組變異僅在小范圍的人群中通過不同感染途徑產生。2 例CRFs 主要存在于異性性傳播人群中，包括最早在中國東部地區的MSM 中鑒定出來的CRF55_01B[10]和流行于四川省南部地區的CRF85_BC[11]，前者從2015 年起就在大理州有少量報道但并未形成大量流行，后者則是新鑒定出的流行重組型，其流行模式較獨特，主要流行于異型性傳播的50歲及以上人群，異性性傳播（尤其是商業性傳播）是驅動CRF85_BC 流行起來的重要因素[12]。而本次調查的2 例基因型為CRF85_BC 的HIV/AIDS年齡均在50 歲左右，并且都曾經有過商業性行為，提示應加強對當地50 歲及以上年齡高風險人群的安全性教育和HIV 流行病學監測。

為評估一線抗病毒治療方案中藥物的有效性，2014 年WHO 發布了治療前耐藥監測指南。治療前耐藥監測的對象包括初始治療和停藥后重新入組治療的HIV/AIDS。因此治療前耐藥既受耐藥傳播的影響，也受耐藥發生的影響[13]。根據推薦的方法，在一些中低收入國家開展的治療前耐藥監測顯示治療前耐藥流行率已經超過10%。其中治療前耐藥流行率增高主要是因為NNRTIs 耐藥的顯著上升。最近WHO 耐藥監測報告顯示在30 個國家中，21 個對NNRTIs 類藥物EFV 和NVP 的耐藥水平已經超過了10%[13]。根據治療前耐藥監測指南，一旦治療前NNRTIs 的耐藥率超過10%，就需要采取公共衛生干預措施，或者通過治療前耐藥檢測指導抗病毒治療方案的選擇。為應對NNRTIs 耐藥升高，2019 年WHO 更新了抗病毒治療指南，推薦使用含整合酶抑制劑DTG 聯合NRTI 的骨干藥物作為治療HIV/AIDS 的首選一線治療方案[14]。

本研究中97.4%的研究對象為初始治療，僅3 例為停藥后重新入組治療，無既往預防服藥和母嬰阻斷的病例。這3 例研究對象中均未檢測到耐藥突變位點。監測結果顯示，本地治療前耐藥總體上處于低流行水平，目前的抗病毒治療方案還是有效的，尚不需要啟動公共衛生的應對措施。另外從以往新近感染人群監測的結果來看，云南省耐藥傳播水平總體也處于低度水平[15]。

在檢測到的耐藥突變中，E138A 和V179D/E的比例較高，但這2 個突變均為輔助耐藥突變位點。E138A 是一個多態性的耐藥基因突變位點，在未治療患者中的流行率在1%～6%之間，還存在亞型間的差異，在A 亞型和C 亞型中E138A 的突變較高[16]。E138A 突變能夠降低利匹韋林（RPV）和依曲韋林（ETR）敏感性2 倍[17]，導致對RPV 和ETR 輕度耐藥，但這2 種藥物都不屬于WHO 治療前耐藥監測的藥物[14]，也不在我國免費抗病毒治療方案中的一線治療方案。本研究顯示E138A位點突變主要在CRF08_BC 中檢測到，與之前其他地區的研究一致[18-19]，考慮E138A 突變為CRF08_BC 病毒的多態性位點。V179D/E 單獨存在僅引起潛在耐藥，通常作為輔助耐藥突變調節其他NNRTIs耐藥突變的效應。

目前感染者在治療前都未進行基因型耐藥的檢測，因此攜帶耐藥基因的HIV/AIDS 在抗病毒治療中出現的耐藥性或藥物壓力選擇會導致更多耐藥突變的產生，進而造成傳播。因此需要進一步加強耐藥監測，及時評估我國免費抗病治療的效果，特別是應該關注NNRTIs 的耐藥。因為NNRTIs 的耐藥遺傳屏障低，容易引起多個獨立性的NNRTIs 耐藥位點產生，高度耐藥合并嚴重的交叉耐藥可以由單個或雙個主要突變引發[20]。作為我國HIV 抗病毒治療的一線藥物，NNRTIs的高耐藥率對ART 的治療有效性具有潛在的影響。

本研究存在一些局限性。首先筆者并未獲得所有納入本研究調查對象的HIV 基因序列，提取和擴增失敗可能是由于樣本儲存運輸條件受限導致病毒RNA 降解。其次研究調查周期較短及樣本數受限，導致可能無法完全準確地反映大理州2018 年HIV/AIDS 中病毒基因型的種類和HIV-1抗病毒治療前耐藥的流行水平。

綜上所述，大理州HIV/AIDS 中病毒基因型較復雜，與云南省主要HIV-1 基因型流行一致，治療前耐藥尚處于低度水平，但從全球的耐藥發展規律來看，仍需要加強HIV 耐藥監測工作，以維持治療前耐藥的低度流行水平及時掌握耐藥基因突變的數據，適時選擇和調整一線抗病毒治療方案，保證公共衛生抗病毒治療策略的有效維持。