十味板藍根顆粒質量標準研究探討

魯 毅 劉 梅 段 靖 賈 琳 賈奕揚 李燕思

中國人民解放軍東部戰區空軍醫院藥劑科，南京 210002

十味板藍根顆粒為東部戰區空軍醫院自制制劑，2003年經南京軍區聯勤部衛生部批準為非標準制劑，2017年再次取得軍隊醫療機構制劑批準文號：總制字(2017)F516007。該制劑由板藍根、大青葉、金銀花、連翹等十味中藥材組成，其功能主治為疏風、發汗解表、清熱解毒利咽[1]；用于感冒引起的發熱、惡寒、頭痛、流涕、咽痛等癥[2]，其制劑可能與其抗病毒活性緊密相關[3]。為了提高該制劑的質量標準，本文采用薄層色譜法對(R，S)-告依春、大青葉、黃芩、防風進行定性鑒別，按顆粒制劑通則進行檢查，采用高效液相色譜法測定對(R，S)-告依春進行含量測定，完善了十味板藍根顆粒的質量標準，對保證其質量具有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀(安捷倫公司)、UV-1700紫外分光光度計(日本島津公司)、CPA225D型電子分析天平(德國賽多利斯公司)、超聲波清洗器、硅膠G薄層板(青島海洋化工廠分廠)

1.2 試藥 十味板藍根顆粒(規格：15 g/袋，東部戰區空軍醫院，批號190331、190401、190402)，(R，S)-告依春對照品(批號111753-201204)、靛玉紅對照品(批號110117-200204)、黃芩苷對照品(批號110715-201318)、防風對照品(批號120947-201409)、除陰性對照品由東部戰區空軍醫院自制外，其余對照品均購自中國生物制品研究所。甲醇為色譜純，其它試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 十味板藍根顆粒(R，S)-告伊春鑒別 取十味板藍根顆粒1 g，研細，加80%甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，制備供試品溶液[4]；同法制備去板藍根的陰性對照品溶液；另取(R，S)-告伊春對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，制備對照品溶液。參照《中國藥典》2020版薄層色譜法(第四部通則0502)[4]59試驗，吸取供試品溶液10 μL、對照品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(1∶1)作為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(254 nm)下檢視。供試品譜圖與對照藥品譜圖在相應位置上顯相同顏色的斑點。如圖1所示。

2.1.2 十味板藍根顆粒黃芩苷鑒別 取十味板藍根顆粒20 g，加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)的混合溶液50 mL，加熱回流30min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇15 mL使溶解，取上清液作為供試品溶液；同法制備黃芩對照藥材溶液和去黃芩苷的陰性對照品溶液；另取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，制備黃芩苷對照品溶液，參照《中國藥典》2020版薄層色譜法(第四部通則0502)[4]59，吸取上述供試品溶液，對照藥材溶液各4 μL及上述對照品溶液2，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開劑，預飽和30 min，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液顯色。供試品譜圖與對照藥材譜圖在相應的位置上，顯相同顏色的斑點；在與對照品譜圖相應的位置上，顯3個相同的暗色斑點。如圖2所示。

1：黃芩苷對照品；2：黃芩對照藥材；3：供試品(190401)；4：陰性對照

2.1.3 十味板藍根顆粒防風鑒別 取十味板藍根顆粒20 g，研細后加丙酮50 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，制備供試品溶液；同法制備去防風的陰性對照品溶液；另取防風對照藥材1 g，加丙酮20 mL，同法制成防風對照藥材溶液；參照《中國藥典》2020版薄層色譜法(第四部通則0502)[4]59試驗，吸取供試品溶液20 μL、對照藥材10 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(4∶1)為展開劑，展開兩次，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品譜圖與對照藥材譜圖相應的位置上，顯相同顏色的斑點。如圖3所示。

1.防風對照藥材；2.供試品(190401)；3.陰性對照

2.2 檢查

2.2.1 粒度的測定 除另有規定外，照粒度測定法，雙篩分法[4]146測定，3批次十味板蘭根顆粒檢查不能通過一號篩與可以通過五號篩的總和不超過15%，均符合規定。

2.2.2 水分的測定 照水分測定法，照《中國藥典》2020版四部通則0832(烘干法)[4]114-115測定：3批次十味板蘭根顆粒水分檢查結果均不超過8%，符合規定。

2.2.3 溶化性的測定 取供試品10 g，加熱水200 mL，攪拌5 min，立即觀察，3批次十味板蘭根顆粒全部溶化，有輕微渾濁，符合規定。

2.2.4 裝量差異的測定 照《中國藥典》2020版四部通則0104顆粒劑項下“裝量差異”檢查法[4]6-7測定。取每批次十味板藍根供試品10袋，共30袋。分別稱定每袋內容物的重量，與標示裝量相比較，裝量差異限度在標示裝量的±5%以內，超出裝量差異限度的不得多于2袋，并不得有1袋超出限度1倍[4]，3批次十味板蘭根顆粒檢查結果均符合規定。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：InertSustain C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：甲醇-0.02%磷酸溶液(5∶95，V/V)；檢測波長：245 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；在該條件下，理論塔板數按(R，S)-告依春峰計算應不低于5000。

2.3.2 溶液的配制 對照品溶液的制備：取(R，S)-告依春對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液。供試品溶液的制備：取十味板藍根顆粒約15 g，精密稱定，置圓底瓶中，精密加入甲醇溶液100 mL，稱定質量，回流提取1 h，放冷，稱重，用甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液。陰性對照溶液的制備：依據十味板藍根顆粒配方比例，制備缺板藍根藥材的陰性對照樣品，按“供試品溶液制備”項下操作，制成陰性對照溶液[6]。

2.3.3 專屬性試驗 按以上色譜條件分別取(R，S)-告依春對照品溶液、十味板藍根顆粒供試品溶液、缺板藍根陰性對照溶液10 μL進樣，陰性對照色譜中，在(R，S)-告依春相應的出峰時間處無干擾峰出現。如圖4所示。

A

2.3.4 線性關系考察 精密吸取已配制好的(R，S)-告依春對照品溶液1 mL、2 mL、4 mL、8 mL、10 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。精密稱取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.3.1項下規定色譜條件測定(R，S)-告依春峰面積，以對照品進樣量(X，μg)為橫坐標，對應的峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，計算得回歸方程為：Y=3590X-15.03(r=0.999，n=5)。結果表明，(R，S)-告依春質量在0.040～0.400 μg范圍內與其峰面積呈良好的線性關系。

2.3.5 精密度試驗 分別精密吸取5份(R，S)-告依春對照品溶液各10 μL，按2.3.1項下色譜條件測量峰面積，結果RSD為0.20%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩定性試驗 取十味板藍根顆粒(批號：190401)適量制備供試品溶液，在室溫條件下靜置，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h時，分別測定(R，S)-告依春含量。結果，(R，S)-告依春峰面積的RSD為1.20%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.3.7 重復性試驗 精密稱取取十味板藍根顆粒(批號：190401)6份，按2.3.2項方法制備供試品溶液，2.3.1項色譜條件進樣測定(R，S)-告伊春峰面積。結果，峰面積平均值為296.43027，RSD為0.60%(n=6)，表明以上方法重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取6份已知(R，S)-告依春含量的十味板藍根顆粒供試品(批號：190401；含量：0.791 mg)，每份均加入精密量取的(R，S)-告依春對照品0.979 mg，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下方法檢測峰面積，計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果 (n=6)

2.3.9 供試品含量測定 按2.3.2項下方法制備十味板藍根顆粒供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件，分別測定3批十味板藍根顆粒供試品(批號190331、190401、190402)的(R，S)-告依春平均含量，測得平均值為0.78 mg。見表2。

表2 供試品含量測定結果 (mg/袋)

3 討論

十味板藍根顆粒由十味中藥組成，成分復雜，其中板藍根味苦、寒，歸心、胃經；功效為清熱解毒，涼血利咽，為方中君藥[3]；近年來越來越多的研究[7-10]表明板藍根具有抗內毒素、免疫調節、抗菌消炎、耐缺氧及抗疲勞等藥理作用。(R，S)-告依春(C5H7NOS)作為板藍根中的主要抗病毒成分，2020年版《中國藥典》中采用HPLC法測定板藍根中(R，S)-告依春的含量對其進行質量控制[4]，國內外一些文獻[11-15]中也收載了類似的定性定量分析方法，故筆者選擇(R，S)-告伊春作為十味板藍根顆粒的質量控制含量測定指標。

本實驗建立了十味板藍根顆粒中(R，S)-告依春、黃芩、防風的薄層色譜鑒定方法，以及(R，S)-告依春的高效液相色譜定量測定方法。方法穩定、可靠、簡便、重復性好，對科學、有效評價十味板藍根顆粒的質量具有重要意義。

十味板藍根顆粒在劑型的質量控制上應符合藥典關于顆粒制劑的要求。本研究按照2020年版《中國藥典》(四部)附錄顆粒劑制劑通則的要求制訂檢查，項目包括粒度、水分、溶化性、裝量差異等。實驗結果表明，3批次十味板藍根顆粒的檢查結果均符合規定。

根據2020年版《中國藥典》(一部)分析方法驗證指導原則的要求[4]480-483，(R，S)-告伊春含量限(幅)度的制訂，根據3批次十味板藍根顆粒樣品的實際測定結果，按其平均值的±20%限度。本研究測定的(R，S)-告伊春含量平均值為0.78 mg/袋，下調20%為0.62 mg，而本次實驗3批次樣品的(R，S)-告伊春含量均高于該量，因此初步確定十味板藍根顆粒告伊春含量限度為0.62 mg/袋。

本實驗選用甲醇、70%甲醇、水作為提取溶劑進行比較，提取方法及含量測定方法相同，甲醇作為提取溶劑含量較高，雜質峰較少，因此選擇甲醇作為溶劑。提取方法采用超聲提取30 min，加熱回流30 min、60 min、90 min。研究中發現，加熱回流60 min、90 min時，提取較完全，因此本研究選用甲醇作為提取溶劑、加熱回流提取60 min。參考文獻[16]選用甲醇-水(7∶93)、流速 1 mL/min 作為流動相，分離效果較差，本研究降低甲醇比例，選擇甲醇-水(5∶95)作為流動相，(R，S)-告依春與其他組分可完全分離，達到較佳的結果。該法簡便快捷，測定結果穩定可靠，且重現性好，為十味板藍根顆粒質量控制提供了實驗依據。

本研究初步建立了十味板藍根顆粒的質量標準，檢查項目均符合相關要求，色譜特征明顯，含量測定方法操作方便，專屬性強，含量限度設定合理，可用于十味板藍根顆粒的質量控制。