苗藥三兩銀非生物堿成分的分離鑒定

黃穎雪 簡 潔 徐貴萍 吳繼春

貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025

野扇花(SarcococcaruscifoliaStapf.)隸屬于黃楊科野扇花屬[1]，為貴州苗族民間習用草藥，全株入藥，民間稱為三兩銀、胃友，收錄于2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》，具有行氣活血、祛風止痛等功效，用于治療胃脘疼痛、風寒濕痹、跌撲損傷等[2]。南亞地區(qū)各國民間也用該屬植物治療腹瀉、瘧疾、風濕和肌肉疼痛等疾病[3]。對野扇花屬植物的化學成分和活性研究始于上世紀60年代，主要集中于其中的生物堿類成分，從中發(fā)現(xiàn)一百余個孕甾烷型生物堿[3-5]，但是對非生物堿類成分的研究較少。本課題組在野扇花生物堿的分離過程中，發(fā)現(xiàn)總生物堿浸膏中存在非生物堿。對非生物堿的分離得到6個化合物，包括1個長鏈烯烴和5個三萜，報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Bruker Avance Neo-400 MHz核磁共振波譜儀(TMS為內(nèi)標，德國Bruker公司)；Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；WFH-308B型三色紫外分析儀(上海精科實業(yè)有限公司)；超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；數(shù)顯熱風槍(德力西電氣)。

1.2 材料 柱層析硅膠(200～300目，青島海洋化工有限公司)；柱層析堿性氧化鋁(200～300目，國藥集團)；氨基硅膠(40～75 μm，日本Fuji公司)；GF254薄層硅膠板(青島海洋化工有限公司)。其它試劑分析純。

三兩銀藥材2015年7月采于貴州省貴陽市觀山湖區(qū)，由貴州中醫(yī)藥大學江洪副教授鑒定為野扇花(SarcococcaruscifoliaStapf.)枝干。標本存放于貴州省苗醫(yī)藥重點實驗室(標本號201507001)。

2 提取與分離

干燥的野扇花枝干10 kg，粉碎，浸泡于25 L甲醇中，超聲提取5次，每次30 min。提取液減壓濃縮得浸膏。浸膏加0.5 mol/L H2SO4溶液調(diào)pH至2。酸水液(2.0 L)用等體積乙酸乙酯萃取5次，除去溶脂性非生物堿，然后加飽和Na2CO3溶液調(diào)pH至9。堿水液(2.7 L)加等體積二氯甲烷萃取3次，得總生物堿105 g。總生物堿經(jīng)堿性氧化鋁柱層析分離，石油醚∶乙酸乙酯 (100∶0→0∶100)梯度洗脫，分為Fr.A～Fr.Q共16部分。Fr.A經(jīng)硅膠柱層析分離，石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺 (20∶1∶1)洗脫，得到化合物1 (76 mg)。Fr.B經(jīng)氨基硅膠柱層析，石油醚∶乙酸乙酯 (100∶0→0∶100)梯度洗脫，分為Fr.B-1～Fr.B-6。Fr.B-1和Fr.B-5分別經(jīng)硅膠柱層析，石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺 (20∶1∶1)洗脫，得到化合物2 (40 mg)、3 (11 mg)。Fr.C經(jīng)氨基硅膠柱層析，石油醚∶乙酸乙酯 (100∶0→0∶100)梯度洗脫，分為Fr.C-1～Fr.C-7。Fr.C-6再經(jīng)硅膠柱層析，石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺 (20∶1∶1)洗脫，得到化合物4 (40 mg)、5 (16 mg)。Fr.I經(jīng)氨基硅膠柱層析，石油醚∶乙酸乙酯 (100∶0→0∶100)梯度洗脫，分為Fr.I-1～Fr.I-13。Fr.I-5再經(jīng)硅膠柱層析，石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺 (10∶1∶1)洗脫，最后重結(jié)晶(乙酸乙酯)得到化合物6 (190 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色油狀，易溶于石油醚，分子式C32H64。薄層層析后10%硫酸-乙醇顯色劑加熱顯紅色。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.83 (1H，ddt，J=17.0，10.2，6.7 Hz，H-2)，5.08～4.90 (2H，m，H-1)，2.06～1.94 (2H，m，H-3)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：139.2 (C-2)，114.1 (C-1)，33.9 (C-3)，32.0 (C-30)，29.8～29.1 (C-4～C-29)，22.8 (C-31)，14.2 (C-32).以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道一致，故鑒定化合物1為dotriacont-1-ene。

化合物2：無色油狀，易溶于石油醚，分子式C46H82O3。薄層層析后10%硫酸-乙醇顯色劑加熱顯紫紅色。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.11 (1H，t，J= 7.0 Hz，H-24)，4.48 (1H，dd，J=10.5，5.8 Hz，H-3)，2.28 (2H，t，J=7.5 Hz，H-1′)，1.69，1.62，1.14，0.96，0.88，0.87，0.85，0.85，(each 3H，s，H-18，19，21，26～30)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：173.7 (C-1′)，131.5 (C-25)，124.7 (C-24)，80.6 (C-3)，75.4 (C-20)，56.0 (C-5)，50.7 (C-9)，50.3 (C-14)，49.8 (C-17)，42.3 (C-13)，40.6 (C-22)，40.4 (C-8)，38.7 (C-4)，37.9 (C-1)，37.1 (C-10)，35.2 (C-7)，34.9 (C-2′)，31.9 (C-14′)，31.2 (C-15)，29.7 (C-4′)，29.7 (C-5′)，29.7 (C-6′)，29.7 (C-7′)，29.6 (C-8′)，29.6 (C-13′)，29.5 (C-9′)，29.4 (C-10′)，29.3 (C-11′)，29.2 (C-12′)，24.8 (C-3′)，28.0 (C-28)，27.5 (C-16)，25.7 (C-26)，25.4 (C-12)，25.2 (C-21)，23.7 (C-2)，22.7 (C-23)，22.6 (C-11)，21.6 (C-15′)，18.2 (C-6)，17.7 (C-27)，16.6 (C-18)，16.4 (C-30)，16.3 (C-19)，15.5 (C-29)，14.1 (C-16′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道一致，故鑒定化合物2為達瑪烯二醇3-O-棕櫚酸酯。

化合物3：無色油狀，易溶于石油醚，分子式C46H82O4。薄層層析后10%硫酸-乙醇顯色劑加熱顯紫紅色。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：4.47 (1H，dd，J= 10.6，5.7 Hz，H-3)，3.72 (1H，t，J=7.2 Hz，H-24)，2.28 (2H，t，J=7.5 Hz，H-2′)，1.48 (3H，m，H-16′)，1.20 (3H，s，H-27)，1.12 (3H，s，H-21)，1.11 (3H，s，H-26)，0.95(3H，s，H-18)，0.87(3H，s，H-28)，0.86 (3H，s，H-30)，0.84 (6H，s，H-19，29)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：173.7 (C-1′)，86.4 (C-20)，86.3 (C-24)，80.6 (C-3)，70.2 (C-25)，56.0 (C-5)，50.7 (C-9)，50.0 (C-14)，49.6 (C-17)，43.0 (C-13)，40.4 (C-8)，38.7 (C-1)，37.9 (C-4)，37.1 (C-10)，35.7 (C-7)，34.9 (C-22)，34.9 (C-2′)，31.9 (C-14′)，31.5 (C-15)，29.7 (C-4′)，29.7 (C-5′)，29.7 (C-6′)，29.7 (C-7′)，29.6 (C-13′)，29.6 (C-8′)，29.5 (C-9′)，29.4 (C-10′)，29.3 (C-11′)，29.2 (C-12′)，28.0 (C-29)，27.8 (C-27)，27.0 (C-26)，27.3 (C-12)，26.4 (C-23)，25.7 (C-16)，25.2 (C-3′)，24.0 (C-21)，23.8 (C-2)，22.7 (C-11)，21.6 (C-15′)，18.2 (C-6)，16.6 (C-30)，16.4 (C-19)，16.3 (C-28)，15.5 (C-18)，14.1 (C-16′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道一致，故鑒定化合物3為20，25-epoxydammarane-3β，24α-diol-3-O-palmitate。

化合物4：白色針晶(乙酸乙酯)，分子式C30H50O。薄層層析后10%硫酸-乙醇顯色劑加熱顯紫紅色。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：4.69 (1H，d，J=2.5 Hz，H-29a)，4.56 (1H，dd，J= 2.6，1.4 Hz，H-29b)，3.17 (1H，d，J=5.0 Hz，H-3)，2.38 (1H，td，J=11.0，5.8 Hz，H-19)，1.68，1.03，0.97，0.83，0.79，0.76(each 3H，s，H-23～28，30)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：150.9 (C-20)，109.4 (C-29)，79.0 (C-3)，55.3 (C-5)，50.4 (C-9)，48.3 (C-19)，48.0 (C-18)，43.0 (C-17)，42.8 (C-14)，40.8 (C-8)，40.0 (C-22)，38.9 (C-4)，38.7 (C-1)，38.1 (C-13)，37.2 (C-10)，35.6 (C-16)，34.3 (C-7)，29.9 (C-21)，28.1 (C-23)，27.5 (C-2)，27.4 (C-15)，25.1 (C-12)，20.9 (C-11)，19.3 (C-30)，18.3 (C-6)，18.0 (C-28)，16.1 (C-25)，16.0 (C-26)，15.4 (C-24)，14.6 (C-27)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道一致，故鑒定化合物4為羽扇豆醇。

化合物5：白色針晶(乙酸乙酯)，分子式C30H50O。薄層層析后10%硫酸-乙醇顯色劑加熱顯紫紅色。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.18 (1H，t，J= 3.7 Hz，H-12)，3.20 (1H，dd，J= 5.1，3.1 Hz，H-3)，1.13，1.00，0.97，0.94，0.87，0.83，0.79，0.79 (each 3H，s，H-23～30)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：145.2 (C-13)，121.7 (C-12)，79.0 (C-3)，55.2 (C-5)，47.6 (C-9)，47.2 (C-18)，46.8 (C-19)，41.7 (C-14)，39.8 (C-8)，38.8 (C-1)，38.6 (C-4)，37.2 (C-22)，37.0 (C-10)，34.7 (C-21)，33.4 (C-29)，32.7 (C-7)，32.5 (C-17)，31.1 (C-20)，28.4 (C-28)，28.1 (C-23)，27.2 (C-2)，27.0 (C-16)，26.2 (C-15)，26.0 (C-27)，23.7 (C-30)，23.5 (C-11)，18.4 (C-6)，16.8 (C-26)，15.6 (C-24)，15.5 (C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道一致，故鑒定化合物5為β-香樹脂醇。

化合物6：白色羽狀結(jié)晶(乙酸乙酯)，分子式C30H50O2。薄層層析后10%硫酸-乙醇顯色劑加熱顯紫紅色。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.60 (2H，overlaped，H-23，24)，5.26 (1H，d，J=3.5 Hz，H-7)，3.24 (1H，dd，J=11.2，4.4 Hz，H-3)，1.96 (2H，m，H-6)，1.31，1.31，0.96，0.96，0.86，0.83，0.81，0.74 (each 3H，H-18，19，21，26～30)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：145.8 (C-8)，139.4 (C-24)，125.6 (C-23)，117.9 (C-7)，79.2 (C-3)，70.7 (C-25)，52.6 (C-17)，51.1 (C-14)，50.6 (C-5)，48.9 (C-9)，43.5 (C-13)，38.9 (C-4)，38.8 (C-22)，37.2 (C-1)，36.5 (C-20)，34.9 (C-10)，34.0 (C-15)，33.6 (C-12)，30.0 (C-26)，29.9 (C-27)，28.1 (C-16)，27.7 (C-2)，27.6 (C-28)，27.2 (C-30)，23.9 (C-6)，21.9 (C-18)，18.4 (C-21)，18.1 (C-11)，14.7 (C-29)，13.1 (C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道一致，故鑒定化合物6為(23E)-euph-7，23-dien-3β，25-diol。

4 結(jié)果與討論

通過氧化鋁、氨基硅膠和硅膠柱層析，從苗藥三兩銀總生物堿浸膏中分離得到6個脂溶性非生物堿，包括1個長鏈烯烴和5個三萜，分別鑒定為三十二碳-1-烯 (1)、達瑪烯二醇3-O-棕櫚酸酯(2)、20，25-epoxydammarane-3β，24α-diol-3-O-palmitate (3)、羽扇豆醇 (4)、β-香樹脂醇 (5)、(23E)-euph-7，23-dien-3β，25-diol (6)，均為首次從該屬植物中分離得到。其中，化合物2、3、6為達瑪烷型四環(huán)三萜。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，化合物2的母體達瑪烯二醇是合成達瑪烷型人參皂苷的關(guān)鍵中間體[11]，具有降血脂活性[12]；化合物3對粘性放線菌有弱的抗菌活性[8]；化合物6對糖尿病靶點α-葡萄糖苷酶具有體外抑制活性[13]。化合物4是一種廣泛存在于多種植物中的羽扇豆烷型五環(huán)三萜，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用[14]。化合物5是一種分布廣泛的齊墩果烷型五環(huán)三萜，具有抗炎、抗菌、抗病毒及降血糖、降血脂等活性[15]。野扇花中存在結(jié)構(gòu)多樣的三萜類成分，值得深入研究。

根據(jù)天然產(chǎn)物化學性能[16-17]，本實驗中的非生物堿應(yīng)該存在于從酸水液中萃取的乙酸乙酯部分，堿化后從堿水液中萃取的二氯甲烷部分不應(yīng)該有非生物堿。總生物堿中存在三萜等非生物堿的原因可能是用乙酸乙酯從酸水液中萃取非生物堿的時候萃取不完全，也可能是酸水液中存在的生物堿增加了非生物堿在酸水中的溶解度。非生物堿的存在增加了后續(xù)生物堿分離純化的難度，也降低了總生物堿活性實驗結(jié)果的可靠性。今后有必要繼續(xù)研究提高和檢測總生物堿純度的簡單方法。

實驗中，首先采用堿性氧化鋁為吸附填料、不含堿性試劑(如二乙胺)的溶液為洗脫劑，接著采用氨基硅膠為吸附填料、同樣用不含堿性試劑的溶液為洗脫劑，最后采用硅膠為吸附填料，用含有堿性試劑的溶液為洗脫劑，可以高效地分離純化脂溶性生物堿和非生物堿。