IL-33通過調節NF-κB信號通路促進肝癌細胞增殖和遷移

趙盈 田明

目前認為炎癥是癌癥的標志,在腫瘤發生的不同階段起著決定性作用,IL-33是IL-1細胞因子家族的成員,壞死細胞的被動釋放是細胞外IL-33出現的主要機制[1]。IL-33可能充當細胞受損或機械損傷后在細胞外釋放的警報信號,以提醒免疫系統細胞或組織受損[2]。研究顯示,IL-33通過促進固有淋巴樣2型細胞(ILC2)的活化和增殖及誘導Th2細胞的產生等機制加劇肝臟的纖維化,可導致腫瘤細胞增殖和炎性介質的產生,包括IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等釋放[3,4]。NF-κB蛋白復合物被認為是炎癥反應的主要調節劑,其長期或失控的激活是炎性疾病的標志,并且可以通過激活炎癥和增殖等相關基因來促進腫瘤發生[5]。本研究探討IL-33是否通過NF-κB信號通路介導肝癌細胞分泌驗證因子,從而影響肝癌細胞增殖和遷移。

材料與方法

一、主要試劑與器材

LO2、MHCC97H、LM3、HepG2、SMCC7721、Hep3B細胞株購自上海ATCC細胞庫,RPMI1640、DMEM、胰蛋白酶及胎牛血清購自美國Gibco公司,細胞培養瓶、板和皿均購自美國Corning公司,人重組IL-33購自美國PeproTech公司,NF-κB、p-NF-κB、IκB、p-IκB抗體及二抗購自美國Santa Cruze公司,IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18ELISA試劑盒購自美國R&D有限公司,EdU細胞增殖試劑盒購自上海碧云天生物有限公司,CCK8試劑盒購自日本Dongjun有限公司,反轉錄和擴增試劑盒購自日本TakaRa公司。熒光定量PCR(RT-PCR)引物由上海生工有限公司合成。多功能酶標儀購自德國Berthold Technologies公司,垂直電泳儀購自BioRad公司,PCR儀購自美國ABI公司。

二、細胞培養

將幾種細胞系分別培養于37 ℃、體積分數為0.05的CO2細胞培養箱內,培養液為含10%胎牛血清的RPMI1640及DMEM培養基,0.25%胰蛋白酶消化傳代,倒置光學顯微鏡下觀察細胞生長狀態。

三、CCK8 法測定HepG2 細胞活力

取對數生長期HepG2 細胞,制備單細胞懸液,以5×104個/mL細胞接種于96 孔培養板中,培養24 h 后加入IL-33(10 ng/mL),培養24 h及48 h后,每孔加入10 μL的CCK8溶液,4 h后終止培養,酶標儀讀取450 nm下的吸光度(A)值,根據公式計算細胞活力。細胞活力*(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(未加藥)-A(空白)]×100。實驗重復3次。

四、EdU實驗觀察HepG2 細胞增殖

取對數生長期HepG2細胞,制備單細胞懸液,以5×104個/mL 的細胞接種于96孔培養板中,培養24 h后加入IL-33(10 ng/mL),培養24 h后,按照EdU試劑盒說明書進行檢測,每組設置5個復孔。

五、RT-PCR檢測不同肝癌細胞中IL-33的表達

收集IL-33處理24 h組與對照組的HepG2 細胞,按試劑盒說明書提取總mRNA,再根據試劑盒說明書進行逆轉錄和擴增。GAPDH 上游引物:5′-GTTCGACAGTCAGCCGCATC-3′,下游引物:5′-GGAATTTGCCATGGGTGGA-3′;IL-33上游引物:5′-TTATGAAGCTCCGCTCTGGC-3′,下游引物:5′-CCAAAGGCAAAGCACTCCAC-3′,結果以2-ΔΔCT表示。

六、蛋白質印跡檢測IL-33對HepG2 細胞NF-κB信號通路的影響

收集IL-33處理24 h組與對照組的HepG2 細胞提取蛋白,經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,按照恒流電流350 mA轉移至PVDF 膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后,加1∶1 000稀釋的NF-κB、p-NF-κB、IκB、p-IκB一抗4℃孵育過夜,封閉液漂洗后加入1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育2 h,漂洗后ECL檢測,曝光、顯影。采用圖像分析系統檢測各條帶的吸光度,以目的條帶與內參吸光度的比值作為相對表達量。實驗重復3次。

七、Transwell小室和劃痕實驗檢測IL-33對HepG2 細胞遷移的影響

培養HepG2細胞,長至50%～60%,IL-33處理繼續培養24 h;用胰酶消化細胞,將混懸有細胞的培養基種入上小室內,下小室加入含10%血清的培養基,繼續在孵育箱中培養24 h。吸去每個小室內培養液,加4%多聚甲醛固定10 min(液體覆蓋底部)。每個小室加入雙蒸水洗滌2 min,換新鮮雙蒸水再次洗滌2 min。按5×結晶紫染色液∶稀釋液=1∶4配制結晶紫溶液,吸去洗滌液,加入結晶紫染色10 min(可根據染色結果和要求調整時間),蒸餾水洗滌充分(不要擦去小室底部細胞),顯微鏡下觀察細胞遷移情況、拍照。

培養HepG2細胞于六孔板內,長至50%～60%,用槍頭垂直于小孔劃一道線,光學顯微鏡下觀察0 h時劃痕情況,顯微鏡下拍照。IL-33處理繼續培養觀察24 h后劃痕情況,顯微鏡下拍照。

八、統計學分析

結 果

一、不同肝癌細胞中IL-33 mRNA相對表達情況

IL-33 mRNA相對表達情況分別為LO2(1.01±0.01)、MHCC97H(1.08±0.05)、LM3(1.76±0.21)、HepG2(3.88±0.35)、SMCC7721(2.24±0.43)和Hep3B(2.13±0.30),差異有統計學意義(F=19.621,P=0.001)。

二、HepG2細胞中NF-κB、p-NF-κB、IKB、p-IKB的蛋白相對表達情況

IL-33處理24 h組中NF-κB磷酸化蛋白及IKB磷酸化蛋白相對表達水平均高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 HepG2細胞中NF-κB、p-NF-κB、IKB、p-IKB的蛋白相對表達情況(±s)

三、HepG2細胞中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18因子情況對比

IL-33處理24 h組中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18因子水平高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 HepG2細胞中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18表達情況對比(±s)

四、HepG2細胞增殖及活力情況對比

IL-33處理24 h組細胞增殖為(1.41±0.08)、24 h細胞活力為(135.69±6.88)%、48 h細胞活力為(176.34±25.69)%,均高于對照組的(0.86±0.04)、(98.65±1.05)%、(119.89±10.86)%,差異有統計學意義(t=13.750、9.218、3.506,P=0.017)。

五、HepG2細胞侵襲和遷移情況對比

Transwell小室和劃痕實驗結果發現,IL-33處理24 h組細胞侵襲數量(256.38±10.11)個、遷移相對距離(0.74±0.05),高于對照組的(185.63±23.54)個、(0.45±0.12),差異有統計學意義(t=4.783,P=0.005;t=3.864,P=0.012)。

討 論

腫瘤微環境浸潤的炎性免疫細胞為腫瘤細胞提供了有利的炎性微環境,促進腫瘤細胞的血管生成、轉移侵襲[6-8]。IL-33是IL-1細胞因子家族的成員,是IL-1受體家族的抑制致瘤性2(ST2)受體的唯一配體[9]。IL-33合成后,胞質IL-33易位至細胞核,與染色質結合,IL-33的N末端結構域包含一個核定位序列和一個染色質結合結構域,是其核易位的關鍵[10]。IL-33 通過其ST2激活PLD/SPHK-NF-κB 和MAPK-ERK/P38/JNK 等信號通路誘導了多種炎癥性疾病的病理過程,引發TH2型免疫應答,刺激TH2型細胞因子的分泌,參與了過敏性疾病、組織損傷修復、炎癥及腫瘤等多種疾病生理過程。NF-κB是存在于細胞內的一種重要核轉錄因子,具有調節炎癥、胚胎發育、組織損傷和修復等生物行為相關基因表達的功能。研究表明,NF-κB是一大家族,由NF-κB 1 (P50及其前體P105)、NF-κB 2(P52及其前體P100)、P65(Rel A)、Rel B和c-Rel組成[6]。正常情況下,NF-κB在細胞內是以非活性的三聚體狀態存在,三聚體由NF-κB兩成員單體、抑制因子IKB(分為IKB和IKBβ兩個亞單體)結合而成。在細胞因子、內毒素或活性氧簇等因素刺激下,IKK(IKB激酶)就會磷酸化IKB的絲氨酸殘基(特殊位點上),后者被泛素化并被26S的蛋白酶體降解[11]。IKB一旦被降解,不再受限制的NF-κB就獲得活性移位至細胞核內,結合到相應的DNA序列,進而啟動靶基因的轉錄。而NF-κB信號傳導的激活,將進一步增強局部炎癥的發生[12]。

IL-33已被證明是急慢性肝衰竭、肝硬化以及慢性乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染的誘導因子[13]。但是,尚不清楚釋放的IL-33在HCC發展中的功能。研究中IL-33 mRNA在幾種肝癌細胞中均高表達(LM3、HepG2、SMCC7721和Hep3B),使用外源性IL-33細胞因子處理肝癌細胞HepG2,發現IL-33誘導HepG2細胞中NF-κB信號傳導的激活,促進HepG2細胞中炎癥因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18)釋放,促進肝癌細胞增殖和遷移。

綜上所述,IL-33可以促進肝癌細胞的增殖和遷移,同時影響細胞的炎癥水平并激活NF-κB 信號通路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。