新加香薷飲有效部位揮發(fā)油中4種成分的含量測(cè)定

冉江玲 葉世蕓* 鑒志剛 李向東 劉宗緒

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002；2.貴州得軒堂護(hù)康藥業(yè)股份有限公司，貴州 貴陽 550008

新加香薷飲出自中國(guó)清代吳鞠通的《溫病條辨》[1]上篇，是由香薷、金銀花、厚樸、連翹、扁豆花5味中藥所組成的祛濕解表的經(jīng)典名方，具有祛濕平肝風(fēng)、化濕和中的功效，臨床應(yīng)用主要集中在夏季的暑濕型流感、高熱、中暑等疾病[2-6]。新加香薷飲已收錄于中國(guó)國(guó)家中醫(yī)藥管理局2018公布的《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》中。近幾年，國(guó)家對(duì)經(jīng)典名方十分重視，連續(xù)發(fā)布相關(guān)政策，對(duì)其質(zhì)量控制方面要求更加嚴(yán)格。目前關(guān)于新加香薷飲的品質(zhì)管理資料缺乏，且理論研究比較薄弱，建立控制新加香薷飲質(zhì)量的分析方法顯得尤為重要。含量測(cè)定和指紋圖譜是中醫(yī)藥質(zhì)量控制方面的常用重要技術(shù)手段[7]。課題組前期建立了新加香薷飲揮發(fā)油氣相色譜指紋圖譜，指認(rèn)了4個(gè)色譜峰，分別為君藥香薷中的麝香草酚、香荊芥酚和臣藥連翹中的α-蒎烯、β-蒎烯[8]，且均具有廣譜的抗菌作用[9-10]。香薷中麝香草酚、香荊芥酚為2020版我國(guó)藥典中，評(píng)價(jià)香薷品質(zhì)的指標(biāo)性成分[11]。參照2020版《中國(guó)藥典》并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，采用氣相色譜法對(duì)以上4種成分進(jìn)行含量測(cè)定，為新加香薷飲的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent7890氣相色譜儀及Agilent HP-5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm，0.5 μm)(美國(guó)安捷倫公司)；DZTW調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療 儀器有限公司)；電子天平(精度為十萬分之一，杭州友恒稱重設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑與試藥 α-蒎烯(批號(hào)：GZDD0228-201217，純度≥99.00%)、β-蒎烯(批號(hào)：C101512-201109，純度≥99.00%)、麝香草酚(批號(hào)：C100179-191125，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、香荊芥酚(批號(hào)：C102093-201028，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%)、水楊酸甲酯(批號(hào)：C1000285-1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%)均購自貴州迪大科技有限責(zé)任公司；乙酸乙酯(色譜純)；水為純水。16批新加香薷飲藥材(編號(hào)S1-S16)各藥材均購自其道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)，所有藥材由貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為正品。新加香薷飲5味藥材信息來源見表1。

表1 16批次新加香薷飲5味藥材來源信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 HP-5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm，0.5 μm)；FID檢測(cè)器；檢測(cè)器溫度 240 ℃；進(jìn)樣口溫度240 ℃；程序升溫，以40 ℃為起始溫度，保持2 min，以5 ℃/min升至70 ℃，以0.5 ℃/min升至74 ℃，以5 ℃/min升至110 ℃，以10 ℃/min升至140 ℃；載氣為高純度氮?dú)?>99.99%)；柱流量為2.0 mL/min；分流比為 20∶1；進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 通過對(duì)古代劑量換算方面研究的論文、相關(guān)中醫(yī)古籍及有關(guān)度量衡研究方面的專著進(jìn)行研究，明確了新加香薷飲中有關(guān)劑量單位“兩”“錢”的換算。明清時(shí)期，1兩約為37.3g，1錢為3.73g的折算方法。原方組成及用量記載為：“香薷(二錢)、銀花(三錢)、鮮扁豆花(三錢)、厚樸(二錢)、連翹(二錢)?！眲t轉(zhuǎn)換為現(xiàn)代換算為：香薷、厚樸、連翹各7.46 g，金銀花及扁豆花各11.19 g。分別稱量香薷、厚樸、連翹各7.46 g，金銀花及扁豆花各11.19 g，加水浸泡30 min，照2020年版《中國(guó)藥典》四部通則2204揮發(fā)油測(cè)定法甲法操作，于測(cè)定器上端加水使之充滿刻度部分，并溢流入燒瓶為止，再加乙酸乙酯5 mL，加熱回流2 h，分取乙酸乙酯液，用鋪有無水硫酸鈉的漏斗濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，即得。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 ①單一對(duì)照品儲(chǔ)備液：分別精密稱取α-蒎烯、β-蒎烯、麝香草酚、香荊芥酚對(duì)照品8.75 mg、91.60 mg、45.94 mg、6.69 mg，加入乙酸乙酯分別定容至 1 mL、10 mL、5 mL、1 mL容量瓶中，得到各成分濃度為8.75 mg/mL、9.16 mg/mL、9.19 mg/mL、6.69 mg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。②內(nèi)標(biāo)物溶液：精密稱取水楊酸甲酯對(duì)照品59.00 mg，加入乙酸乙酯定容至5 mL容量瓶中，得到濃度為11.80 mg/mL的內(nèi)標(biāo)物溶液。③混合對(duì)照品溶液：分別精密量取上述4種溶液各1 mL、3 mL、2 mL、1 mL，加乙酸乙酯定容至10 mL容量瓶中，得到各質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.88 mg/mL、2.75 mg/mL、1.84 mg/mL、0.67 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系、檢測(cè)限及定量限考察 分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL，加入0.2 mL內(nèi)標(biāo)溶液，加乙酸乙酯定容至2 mL容量瓶中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以待測(cè)組分與內(nèi)標(biāo)物濃度比為橫坐標(biāo)(X)，以待測(cè)組分與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別取“2.2.2”項(xiàng)下加入內(nèi)標(biāo)物的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加乙酸乙酯稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，并記錄峰面積。當(dāng)信噪比(S/N)為3時(shí)得檢測(cè)限，當(dāng)信噪比(S/N)為10時(shí)得定量限。結(jié)果見表2。各成分在對(duì)應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。氣相色譜圖如圖1所示。

表2 4種成分線性關(guān)系、檢測(cè)限及定量限結(jié)果表

2.3.2 精密度 按“2.2.1”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各樣品峰的保留時(shí)間RSD≤0.03%，峰面積RSD≤0.54%，表明機(jī)器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性 按“2.2.1”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件下分別在0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)得各樣品峰的保留時(shí)間RSD≤0.03%，峰面積RSD≤0.85%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性 取同一批次(S16)新加香薷飲，按“2.2.1”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，平行6次，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得各樣品含量的RSD≤2.64%，平均含量為1.98%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取已知含量的新加香薷飲揮發(fā)油6份，每份0.2 mL，根據(jù)已知的各指標(biāo)性成分含量分別加入各對(duì)照品適量，加入0.2 mL內(nèi)標(biāo)物溶液后，按“2.2.1”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄各峰面積值，計(jì)算樣品中各成分含量及加樣回收率，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，α-蒎烯、β-蒎烯、麝香草酚、香荊芥酚的平均加樣回收率分別為96.22%、94.79%、96.96 %、99.35%，RSD均小于3%，說明該方法測(cè)得結(jié)果準(zhǔn)確性良好，測(cè)定結(jié)果可靠?；厥章?%)=(測(cè)得量-原有量)/加入對(duì)照品含量×100%。

表3 新加香薷飲GC加樣回收測(cè)定結(jié)果表

2.4 樣品含量測(cè)定 照表1組合，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備16批次新加香薷飲供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣并測(cè)定4種揮發(fā)性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見表4。

表4 新加香薷飲GC中11種成分含量的測(cè)定結(jié)果表 (mg/g)

由表4可知，4種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為：α-蒎烯0.11～0.28 mg/g，平均含量為(0.18±0.056)mg/g；β-蒎烯0.48～1.31 mg/g，平均含量為(0.89±0.309)mg/g；麝香草酚0.54～0.94 mg/g，平均含量為(0.76±0.154)mg/g；香荊芥酚0.04～0.38 mg/g，平均含量為(0.18±0.135)mg/g。

3 討論

3.1 新加香薷飲有效部位中揮發(fā)油的主要成分 新加香薷飲組方中多種藥材含有揮發(fā)性成分，其中連翹揮發(fā)油的主要成分α-蒎烯、β-蒎烯[12-14]，香薷揮發(fā)油主要的活性成分麝香草酚、香荊芥酚均具有廣譜的抗菌作用[15-16]。麝香草酚和香荊芥酚可作為香薷揮發(fā)油質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分，二者的含量對(duì)香薷揮發(fā)油的抑菌活性具有重要影響[17]。

3.2 新加香薷飲的質(zhì)量控制的研究 本研究所測(cè)定的4種成分α-蒎烯、β-蒎烯、麝香草酚、香荊芥酚分別為新加香薷飲中連翹和香薷的主要成分，目前對(duì)新加香薷飲的報(bào)道主要集中在臨床治療陰暑、暑濕型感冒等疾病[18-19]，藥理研究更多的是在對(duì)其成分提取的研究，對(duì)于如何建立正確的新加香薷飲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證藥材品質(zhì)這一問題，還需要進(jìn)一步更深入地研究。目前在質(zhì)量控制方面僅鑒志剛等[8]建立了新加香薷飲揮發(fā)油氣相色譜指紋圖譜研究和謝佳佳等[20]構(gòu)建的新加香薷飲的高效液相色譜指紋圖譜，可見對(duì)新加香薷飲質(zhì)量控制方面的相關(guān)研究較少，因此本研究采用氣相色譜法測(cè)定新加香薷飲揮發(fā)油中4種成分的含量測(cè)定方法，可以作為新加香薷飲的質(zhì)量控制基礎(chǔ)，也可為新加香薷飲在臨床上的研究提供一定的參考價(jià)值。

3.3 含量測(cè)定結(jié)果分析 根據(jù)“2.4”項(xiàng)下16批新加香薷飲有效部位揮發(fā)油中α-蒎烯、β-蒎烯、麝香草酚、香荊芥酚的含量測(cè)定數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)S3、S11、S14分別來自山西長(zhǎng)治和河南盧氏產(chǎn)區(qū)的連翹中的β-蒎烯成分含量較來自其他產(chǎn)地的低，且波動(dòng)范圍較大，說明藥材的質(zhì)量均一性不好，對(duì)臨床用藥的有效性有一定影響。本研究所建立的α-蒎烯、β-蒎烯、麝香草酚、香荊芥酚的含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單快捷、安全有效，有望在篩選優(yōu)質(zhì)藥材、確保臨床安全有效用藥方面發(fā)揮重要作用。

綜上所述，采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定新加香薷飲揮發(fā)油中α-蒎烯、β-蒎烯、麝香草酚、香荊芥酚4種成分的含量，并對(duì)含量測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)考察，測(cè)定的各成分在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系好，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均良好，且回收率較好，說明建立的含量測(cè)定方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確可行，可為新加香薷飲質(zhì)量控制提供參考，在未來中藥經(jīng)典名方揮發(fā)油質(zhì)量評(píng)價(jià)中也有望得到更廣泛的應(yīng)用。