苦豆子凝膠薄層色譜鑒別研究

郭鴻雁 李 軍

寧夏職業技術學院，寧夏中藥材開發與利用工程技術研究中心，寧夏 銀川 750021

為完善該制劑質量標準中鑒別項的內容，參考2020年《中國藥典》中藥及制劑鑒別的薄層色譜法[9]與相關文獻[10-13]，本研究優化了供試品制備方法、展開劑、點樣量等色譜條件，完成了專屬性和不同溫濕度、不同薄層板的耐用性等方法學驗證，建立了苦豆子凝膠劑的薄層色譜鑒別法，為制定該凝膠劑的質量標準提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 XP205電子分析天平(梅特勒-托利多公司)；DHG-9070A恒溫干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；明澈-D 24超純水系統(美國默克密理博有限公司)；200 mm×200 mm薄層色譜雙槽展開缸(上海信儀儀器廠)。

1.2 材料 硅膠G薄層板(青島海洋化工有限司，批號：20210418)、高效硅膠HSG板(煙臺江友硅膠開發有限公司，批號：20211013)、硅膠G薄層板(青島海勝精細硅膠化工有限公司，批號：20210814)，二氯甲烷、甲醇、氨水、乙酸乙酯、冰醋酸、碘化鉀、堿式硝酸鉍鉀等試劑均為分析純，純化水為自制。槐定堿(中國食品藥品檢定研究院，批號110784-201706)和苦參堿(中國食品藥品檢定研究院，批號110805-202010)?；倍▔A1.111 mg/mL、苦參堿1.540 mg/mL。中試三批苦豆子凝膠(批號2022092701、2022112501、2022112502)為委托銀川鳳儀堂生物工程有限公司制備，不加苦豆子總堿的空白凝膠陰性對照為寧夏中藥材開發與利用工程技術研究中心自制。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

2.1.1 制劑及原料供試品的制備 分別取三批苦豆子凝膠三支，分別稱取0.2 g加甲醇25 mL溶解過濾，收集濾液，備用；稱取0.1 g苦豆子總堿加甲醇50 mL溶解過濾，收集濾液，備用。

2.1.2 對照品溶液制備 分別精密稱取槐定堿和苦參堿對照品加甲醇定容至10 mL，制備1.111 mg/mL的槐定堿和1.540 mg/mL苦參堿。

2.1.3 陰性對照溶液制備 取自制的不含苦豆子總堿空白凝膠劑，按2.1.1項下制制備陰性對照溶液。

2.1.4 碘化鉍鉀試液制備 取堿式硝酸鉍鉀 0.85 g，加冰醋酸10 mL與水40 mL溶解后，加4%碘化鉀溶液5 mL，加冰醋酸20 mL，用水稀釋至100 mL，搖勻，備用。

不同臨床分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期）患者的復發和轉移率分別為44.0%、68.8%、100.0%和100.0%（圖2B）；統計分析結果顯示（表3），臨床分期為Ⅲ和Ⅳ期患者術后復發和轉移的發生率為100.0%，明顯高于Ⅰ和Ⅱ期患者的53.7%，差異有統計學意義（P＝0.003）。Ⅰ和Ⅱ期患者復發和轉移的發生率為44.0%與68.8%，差異無統計學意義（P＝0.064）。

2.2 試驗方法 參照薄層色譜法(通則0502)試驗[9]，吸取供試品溶液2～3 μL、對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷∶甲醇∶氨水(50∶6∶1)為展開劑，飽和30 min，展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點。

2.3 薄層色譜條件的優化

2.3.1 展開劑的選擇 吸取苦豆子凝膠和苦豆子總堿供試品、槐定堿和苦參堿對照品溶液各2 μL分別點于3個同一硅膠G薄層板上，分別以A[二氯甲烷∶甲醇∶氨水(50∶6∶1)]，B[乙酸乙酯∶乙醇∶氨水(50∶1∶0.5)]，C[三氯甲烷∶甲醇∶石油醚∶氨水(50∶5∶1∶1)]為展開劑，按2.2項下方法考察其對薄層色譜的影響。結果顯示，A與C作為展開劑，凝膠和苦豆子總堿供試品與對照品色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且斑點清晰，分離度好，效果最佳。B展開效果欠佳。由于三氯甲烷的毒性較大，考慮安全環保。故選用A[二氯甲烷∶甲醇∶氨水(50∶6∶1)]作為展開劑。結果如圖1。

1 2 3 41 2 3 41 2 3 41.槐定堿；2.苦豆子總堿供試品；3.苦豆子凝膠供試品；4.苦參堿圖1 不同展開劑考察結果圖

2.3.2 供試品制備方法的考察 分別按照以下4種方法制備供試品溶液，按2.2項下方法考察其對薄層色譜的影響。①稱取苦豆子凝膠0.2 g，加入純化水超聲溶解，定容至25 mL，濾過，得供試品溶液1。②稱取苦豆子凝膠0.2 g，5滴10%CaCl2，搖勻后加入純化水超聲溶解，定容至25 mL，濾過，得供試品溶液2。③稱取苦豆子凝膠0.2 g，加入甲醇超聲溶解，定容至25 mL，濾過，得供試品溶液3。④稱取苦豆子凝膠0.2 g，加入5滴10%CaCl2，搖勻后加入甲醇超聲溶解，定容至25 mL，濾過，得供試品溶液4。結果表明∶ 4種方法制備的供試品溶液主斑點與對照品溶液斑點的顏色、位置相同，均有較好的分離度。故供試品溶液制備方法選擇簡單、易操作的第3種。如圖2所示。

1 2 3 4 41 2 5 61.槐定堿；2.苦參堿；3.供試品1；4.供試品2；5.供試品3；6.供試品4圖2 不同供試品制備方法的考察結果圖

2.3.3 不同點樣量的選擇 選用硅膠G薄層板，取樣品溶液1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、6 μL分別點樣，按2.2項下方法考察其對薄層色譜的影響。結果顯示：對照品溶液和供試品溶液點樣量在1～6 μL范圍內，均能分離，各斑點清晰，其中1～3 μL分離度較好，考慮不同制劑含量差異，故選擇點樣量為2～3 μL。結果如圖3所示。

1 2 3 4 5 61.對照品(下是槐定堿、上是苦參堿)；2～6分別為1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、6 μL圖3 不同點樣量的考察結果圖

2.4 苦豆子凝膠薄層色譜鑒別的方法學驗證

2.4.1 專屬性考察 分別吸取2批次的苦豆子凝膠供試品溶液、苦豆子總堿溶液、陰性對照溶液、混合對照品溶液各3 μL分別點與同一硅膠G薄層板上，按2.2項下方法考察其對薄層色譜的影響。供試品、苦豆子總堿與對照品色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且斑點清晰，分離度好。而陰性樣品溶液無干擾。說明該薄層色譜鑒別方法專屬性強。結果如圖4所示。

1 2 3 4 51.混合對照品(上為苦參堿、下為槐定堿)；2.苦豆子凝膠(批號22092701)；3.苦豆子凝膠(批號22112501)；4.苦豆子總堿；5.陰性對照溶液圖4 苦豆子凝膠薄層色譜鑒別的專屬性考察結果圖

2.4.2 薄層色譜方法耐用性考察

2.4.2.1 不同廠家硅膠G薄層板的考察 分別在3個不同生產廠家硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司、煙臺江友硅膠開發有限公司、青島勝海精細硅膠化工有限公司)點樣3個批次供試品及槐定堿和苦參堿對照品，按2.2項下方法考察其對薄層色譜的影響。結果在3個不同品牌的硅膠G薄層預制板上，樣品色譜中在與槐定堿、苦參堿對照品色譜相應位置上，顯相同斑點，且斑點清晰，分離度良好。表明不同廠家生產硅膠G薄層板對薄層色譜鑒別方法無明顯影響。結果如圖5所示。

1 2 3 4 51 2 3 4 51 2 3 4 5A.青島海洋；B.煙臺江友；C.青島勝海；1.槐定堿；2.苦參堿；3.苦豆子凝膠(批號22092701)；4.苦豆子凝膠(批號22112501)；5.苦豆子凝膠(批號22112502)圖5 不同廠家硅膠G板薄層色譜圖

2.4.2.2 不同溫度的考察 在同一廠家薄層硅膠G板上點樣3個批次供試品及槐定堿和苦參堿對照品，在10 ℃、20 ℃、35 ℃ 3個不同溫度下，按2.2項下方法考察其對薄層色譜的影響。結果展開樣品色譜中在與槐定堿、苦參堿對照品色譜相應位置上顯相同顏色斑點，且斑點清晰，分離度好。表明不同溫度的對薄層鑒別無影響。結果如圖6所示。

1 2 3 4 51 2 3 4 51 2 3 4 51.槐定堿；2.苦參堿；3.苦豆子凝膠(批號22092701)；4.苦豆子凝膠(批號22112501)；5.苦豆子凝膠(批號22112502)圖6 不同溫度的薄層色譜圖

2.4.2.3 不同濕度的考察 在同一廠家薄層硅膠G板上點樣3個批次供試品及槐定堿和苦參堿對照品，在32%、58%、88% 3個不同濕度下，按2.2項下方法考察其對薄層色譜的影響。結果展開樣品色譜中在與槐定堿、苦參堿對照品色譜相應位置上顯相同顏色斑點。表明不同濕度對薄層色譜鑒別方法基本無影響。結果如圖7所示。

1 2 3 4 51 2 3 4 51 2 3 4 51.槐定堿；2.苦參堿；3.苦豆子凝膠(批號22092701)；4.苦豆子凝膠(批號22112501)；5.苦豆子凝膠(批號22112502)圖7 不同濕度的薄層色譜圖

3 討論

本研究建立苦豆子凝膠薄層鑒別方法，確定以槐定堿和苦參堿為對照品，以甲醇為溶劑制備供試品溶液，點樣量2～3 μL，以二氯甲烷∶甲醇∶氨水=50∶6∶1為展開劑，飽和30 min，展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液，日光下檢視。

苦豆子凝膠劑作為新開發的用于防治痤瘡的制劑，其主要有效成分為槐定堿和苦參堿，且兩者的含量最高，故薄層色譜鑒別選擇槐定堿和苦參堿為對照品[14]。薄層色譜鑒別是中藥制劑鑒別的主要方法之一，因其設備簡單、操作方便而被廣泛應用[15]，但易受供試品制備方法、點樣量，展開劑等相關條件影響[16-17]。因此，本研究優化了上述條件，確定了供試品制備用甲醇溶解，點樣量為2～3 μL。由于三氯甲烷毒性較大，考慮實驗人員的安全性和環保問題[18-19]，改用二氯甲烷，并進行了展開劑比例的優化調整，最終以二氯甲烷：甲醇：氨水(50∶6∶1)為展開劑，薄層色譜分離效果最好，且低毒安全，這也符合目前質量標準制定的基本要求[20]。作者在實驗過程中發現，點樣后薄層板再展開之前必須進行充分飽和，至少30 min，防止薄層色譜圖產生邊緣效應。可能的原因是充分飽和后，使展開缸中的展開劑氣、液、固三相比例適當，斑點分離度較好[21]。

為了考察方法的專屬性和耐用性，分別考察了陰性對照溶液、不同溫度、不同濕度、不同廠家生產的硅膠G板等對所建立的苦豆子凝膠薄層色譜鑒別方法的影響。結果顯示，陰性對照、不同溫濕度和不同廠家薄層板的3批苦豆子凝膠供試品的色譜圖均與對照品色譜圖相應位置上顯相同的顏色斑點，且斑點清晰，分離度好，效果佳，陰性無干擾。

本研究建立的苦豆子凝膠薄層色譜鑒別法操作簡便可行、專屬性強、重現性好，結果準確可靠，所用試劑安全環保，是控制苦豆子凝膠制備工藝、產品質量的快速檢測方法，為制定苦豆子凝膠劑的質量標準提供了重要依據。