HPLC法測定抗骨髓炎片中綠原酸和秦皮乙素的含量

唐佳齊 何 艷 王 慶 黃 琴 楊 霞 張 輝

湘南學院藥學院，湖南 郴州 423000

抗骨髓炎片收載在《中國藥典》2020年版一部中，由金銀花、蒲公英、紫花地丁、半枝蓮、白頭翁和白花蛇舌草組成的中藥復方制劑，具有清熱解毒、散瘀消腫之功效，用于熱毒血瘀所致附骨疽及骨髓炎等癥[1]。抗骨髓炎片現行質量標準僅測定綠原酸的含量作為質控指標，相關文獻也僅有薄層掃描測定綠原酸[2]或HPLC測定白頭翁皂苷B4[3]的含量，質控指標單一，難以有效控制制劑質量。方中金銀花清熱解毒、消炎退腫，蒲公英解熱涼血，兩者主要活性成分為綠原酸[4-5]；紫花地丁清熱解毒，治癰疽疔腫，其主要活性成分為秦皮乙素[6]。為此，為了更加全面地控制該制劑的質量，本實驗采用HPLC法測定抗骨髓炎片中綠原酸和秦皮乙素的含量，此法結果準確，重現性好，為有效控制該制劑的質量提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，XSE-205電子天平(梅特勒-托利多公司，感量：0.01 mg)，DZKW-D電熱恒溫水浴鍋(北京市永明醫療儀器有限公司)，KQ-500DE超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 綠原酸對照品(批號：110753-201817，含量：96.8%)、秦皮乙素對照品(批號：110741-201708，含量：99.9%)均購自中國食品藥品鑒定研究院。抗骨髓炎片(萊陽市江波制藥有限責任公司，批號：2111253、2203022、2203052)，甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑、試藥均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為Thermo Hypersil Gold-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈- 0.1%磷酸(9∶91)，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長327 nm，進樣量10 μL。按上述色譜條件進樣分析，綠原酸、秦皮乙素與其他色譜峰分離較好(分離度>1.5)，且陰性樣品無干擾(如圖1)。

A.混合對照品；B.供試品；C.缺金銀花、蒲公英陰性樣品；D.缺紫花地丁；1.綠原酸；2.秦皮乙素

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品綠原酸、秦皮乙素7.47 mg、6.28 mg，各置20 mL量瓶中，用70%甲醇溶液定容至刻度。分別精密量取 4 mL、1 mL 置10 mL量瓶中，得混合對照品儲備溶液(綠原酸144.6 μg·mL-1、秦皮乙素31.37 μg·mL-1)。

2.3 供試品溶液的制備 取抗骨髓炎片20片，除去糖衣，研細，精密稱取0.8 g，置錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲(功率500 W，頻率40 kHz)提取30 min，放冷至室溫，再稱定重量，減失的重量用70%甲醇補足，搖勻，過0.45 μm濾膜，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 取按處方工藝制成不含蒲公英和金銀花、不含紫花地丁的陰性樣品，取適量研細，按“2.3”項下方法制成缺蒲公英和金銀花、缺紫花地丁的陰性樣品溶液。

2.5 線性關系考察 精密量取“2.2”項下的對照品溶液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀中，按“2.1”項下色譜條件測定綠原酸和秦皮乙素的峰面積，以進樣質量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(X)，峰面積(A)為縱坐標(Y)，進行線性回歸。綠原酸、秦皮乙素分別在14.46～144.6 μg·mL-1、3.137～31.37 μg·mL-1范圍內線性關系良好，回歸方程分別為Y=29.97X+0.0071(r=0.9999)、Y=28.59X-0.6687(r=0.9999)。

2.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品儲備溶液適量，用70%甲醇稀釋2倍，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6 次，測定綠原酸、秦皮乙素的峰面積。結果綠原酸、秦皮乙素峰面積的RSD為0.15%、0.18% ，結果表明儀器的精密度良好。

2.7 穩定性試驗 精密吸取同一供試品(批號：2111253)溶液10 μL，分別在0 h、3 h、5 h、7 h、10 h、12 h依次進樣，測定綠原酸、秦皮乙素的峰面積。結果綠原酸、秦皮乙素峰面積的RSD為0.43%、0.95% ，結果表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗 精密稱取同一批樣品(批號：2111253)6份，照“2.3”項下制備，得6份供試品溶液，分別進樣10 μL，測定綠原酸、秦皮乙素的峰面積。結綠原酸、秦皮乙素含量分別為 4.927 mg·g-1、1.079 mg·g-1，RSD分別為0.37%(n=6)、1.73%(n=6)，表明該方法重復性較好。

2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品(批號：2111253)6份，精密稱取0.4 g，置具塞錐形瓶中，按1∶1的比例分別加入綠原酸、秦皮乙素對照品溶液(0.3833 mg·mL-1綠原酸 5mL、0.4076 mg·mL-1秦皮乙素1 mL )，用70%甲醇補足至50 mL，按“2.3”項下方法制備供試品液，進樣10 μL，測定綠原酸、秦皮乙素峰面積，代入標準曲線計算含量，并計算回收率，結果綠原酸、秦皮乙素平均回收率分別為98.65%(RSD= 0.75%)、96.51%(RSD= 1.58%)，結果準確度良好。見表1。

表1 綠原酸、秦皮乙素加樣回收率試驗結果(n=6)

2.10 含量測定 取3個批次的抗骨髓炎片樣品，除去糖衣，研細，精密稱取0.8 g，按“2.3”項下方法各平行制備2份供試品溶液，分別吸取10 μL，進樣測定綠原酸、秦皮乙素峰面積，代入標準曲線計算含量。見表2。

表2 樣品中2種成分含量測定的結果(mg·g-1，n=2)

3 討論

3.1 測定波長的選擇 采用二極管陣列檢測器在波長190～400 nm對綠原酸、秦皮乙素對照品溶液進行紫外掃描，發現綠原酸在327 nm、秦皮乙素在345 nm具有最大吸收，綜合考慮故本文選用327 nm作為檢測波長。

3.2 色譜條件優化 依據文獻[7-8]方法，本文比較了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相，實驗結果表明，采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，綠原酸和秦皮乙素的分離效果較好，當增加磷酸濃度時，2個成分色譜峰峰形無明顯變化，故選擇乙腈-0.1%磷酸作為流動相。再考察了不同色譜柱[Agilent ZORBAX SB C18、SHIMADU Shim-pack-C18、Thermo Hypersil Gold-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)]、不同儀器(Agilent 1260、SHIMADU LC-20AT )對2個成分測定時分離效果的影響，結果均能實現較好的分離。

3.3 供試品制備方法的選擇 預實驗采用不同溶劑(乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇)進行超聲和加熱回流提取，結果顯示，采用70%甲醇超聲提取時，綠原酸和秦皮乙素提取率高，且峰形較佳，超聲提取能明顯縮短提取時間；再考察了超聲提取30 min、40 min、50 min、60 min，結果超聲提取40 min時，綠原酸和秦皮乙素基本提取完全，故選擇超聲提取40 min。

綜上所述，本研究采用HPLC法同時測定抗骨髓片中2種有效成分的含量，涵蓋了制劑中的君藥和臣藥，方法簡單易行、專屬性好、準確度高，為更為全面地控制抗骨髓炎片的質量和完善其質量標準提供實驗基礎。