澳洲茄堿對(duì)人乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及其機(jī)制研究

郝志慧 連 薇 代前龍 何 飛

大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 云南省高校細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000

乳腺癌是一類由于基因突變、激素紊亂等多種原因?qū)е氯橄偕掀ぜ?xì)胞發(fā)生癌變的惡性腫瘤。三陰性乳腺癌作為乳腺癌的一種病理亞型，具有預(yù)后差、高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性和高復(fù)發(fā)率的臨床特征。

澳洲茄堿是一種甾體生物堿，從天然草本植物龍葵中提取，具有廣泛的抗腫瘤、抗氧化和抗炎特性。研究證實(shí)澳洲茄堿具有治療糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的潛力[1]，并可以通過(guò)激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/叉頭框轉(zhuǎn)錄因子3a（forkhead box 3a，F(xiàn)oxO3a）信號(hào)通路減輕七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[2]。國(guó)內(nèi)外對(duì)于澳洲茄堿與腫瘤相關(guān)的研究表明，澳洲茄堿在胰腺癌[3]、肺腺癌[4]、膀胱癌[5]、急性單核細(xì)胞白血病[6]、肝細(xì)胞癌[7-8]、胃癌[9-10]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[11]的治療中有效。但目前尚未報(bào)道對(duì)于澳洲茄堿在乳腺癌特別是三陰性乳腺癌中的作用研究。

本研究旨在證實(shí)澳洲茄堿對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，并探索其作用機(jī)制。為臨床上三陰性乳腺癌的治療提供新的藥物應(yīng)用方案，具有重要的應(yīng)用參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞（CL-0290B）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；澳洲茄堿（SS8630）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，溶解于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），首次配制成10 mmol/L濃度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)依據(jù)所需藥物濃度進(jìn)行稀釋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)澳洲茄堿對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞活力的影響 將細(xì)胞以2000個(gè)/孔的濃度均勻種植到96孔板中過(guò)夜培養(yǎng)，分別用濃度為0、10、20、30、40、50 μmol/L的澳洲茄堿進(jìn)行處理，另一對(duì)照組用0.3%DMSO處理，培養(yǎng)至24、48 h。加入CCK-8培養(yǎng)2 h后測(cè)定其450 nm處吸光度，分析不同處理時(shí)間和不同藥物濃度作用下的細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞活力。細(xì)胞活力＝（A藥物-A空白）/（A對(duì)照-A空白）。A藥物：藥物處理組吸光度，A空白：空白組吸光度，A對(duì)照：對(duì)照組吸光度。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察澳洲茄堿對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞遷移能力的影響 將細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的濃度均勻種植到6孔板中。用10 μl槍頭直線劃傷單層細(xì)胞，形成均勻劃痕。用上述不同濃度的澳洲茄堿處理，分別于24、48 h在顯微鏡下拍攝細(xì)胞發(fā)生運(yùn)動(dòng)遷移的情況，并用Image J測(cè)量?jī)蛇吘壖?xì)胞之間的距離。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)澳洲茄堿對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞克隆形成能力的影響 將細(xì)胞以1000個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種于6孔板中。用不同濃度的澳洲茄堿分別處理24、48 h后換液，培養(yǎng)7 d（中間每2～3天換液）。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染液染色。用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌細(xì)胞數(shù)次，晾干后于顯微鏡下拍照。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)三陰性乳腺癌MDAMB-468細(xì)胞中磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）通路相關(guān)蛋白及P53蛋白的表達(dá)水平 分別用含藥物濃度0、40、50 μmol/L的培養(yǎng)基處理細(xì)胞，24 h后提取細(xì)胞總蛋白。使用10%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）凝膠進(jìn)行蛋白電泳。應(yīng)用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。Image J分析各個(gè)條帶的灰度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩兩比較采用Graphpad Prism軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 澳洲茄堿對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞活力的影響

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，不同濃度的澳洲茄堿均可抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞增殖、降低細(xì)胞活力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），且其抑制作用具有濃度依賴性，見(jiàn)圖1。

圖1 澳洲茄堿對(duì)三陰性乳腺癌MDAMB-468細(xì)胞活力的影響（，n=3）

2.2 澳洲茄堿對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468運(yùn)動(dòng)遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，不同濃度的澳洲茄堿均可抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力。其形態(tài)學(xué)結(jié)果觀察以及劃痕愈合率數(shù)據(jù)對(duì)比分析顯示，與對(duì)照組比較，澳洲茄堿40、50 μmol/L的處理組劃痕愈合率上具有顯著差異，見(jiàn)圖2。

圖2 澳洲茄堿對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞遷移的影響（，n=3）

2.3 澳洲茄堿對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468克隆形成能力的作用

對(duì)細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯微鏡下結(jié)果觀察可知：與對(duì)照組比較，不同濃度的澳洲茄堿均可減弱三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞的克隆形成能力。且高濃度處理組（40、50 μmol/L）具有顯著差異，見(jiàn)圖3。

圖3 澳洲茄堿對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞克隆形成能力的影響

2.4 澳洲茄堿對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞的PI3K-AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示高濃度（40、50 μmol/L）澳洲茄堿對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468抑制作用顯著。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示澳洲茄堿可下調(diào)PI3K-AKT通路相關(guān)蛋白PI3K、AKT的表達(dá)量（P< 0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 澳洲茄堿對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞中PI3K、AKT蛋白表達(dá)的影響（，n=3）

2.5 澳洲茄堿對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞的P53抑癌基因蛋白表達(dá)量的影響

對(duì)細(xì)胞的藥物處理方法及蛋白提取流程同PI3K-AKT通路相關(guān)蛋白。結(jié)果顯示澳洲茄堿可以下調(diào)MDA-MB-468細(xì)胞P53蛋白的表達(dá)量（P< 0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 澳洲茄堿對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)的影響（，n=3）

3 討論

澳洲茄堿是一類糖苷生物堿，近年來(lái)被應(yīng)用于抗腫瘤的研究。研究發(fā)現(xiàn)，澳洲茄堿可引起胰腺癌細(xì)胞[3]和肺腺癌細(xì)胞[4]中的鐵死亡；可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯影響膀胱癌細(xì)胞的活力[5]；可上調(diào)AMPK/FoxO3a通路抑制急性單核細(xì)胞白血病的體外和體內(nèi)進(jìn)展[6]；可通過(guò)miR-375-3p和lncRNA CCAT1之間的相互調(diào)控抑制肝細(xì)胞癌HepG2的生長(zhǎng)[7]。目前關(guān)于澳洲茄堿對(duì)三陰性乳腺癌作用的研究未見(jiàn)報(bào)道，考慮到其廣泛的抗腫瘤作用，因此研究了其對(duì)三陰性乳腺癌的生長(zhǎng)抑制作用及其相關(guān)作用機(jī)制。

PI3K-AKT信號(hào)通路在細(xì)胞代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和血管生成等基本細(xì)胞活動(dòng)中起主要作用，并在多種腫瘤中存在異常激活。高聚偉等[12]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了澳洲茄堿的抗腫瘤機(jī)制，發(fā)現(xiàn)澳洲茄堿具有“多靶點(diǎn)-多通路”作用機(jī)制，參與多個(gè)生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，其中PI3K-AKT是其核心信號(hào)通路之一。基于該通路在細(xì)胞活動(dòng)中的廣泛作用及其在腫瘤細(xì)胞中的重要影響，本研究首先應(yīng)用不同濃度的澳洲茄堿處理MDA-MB-468細(xì)胞，分別對(duì)藥物處理24、48 h的細(xì)胞進(jìn)行了CCK-8檢測(cè)、劃痕實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)，后續(xù)應(yīng)用Western blotting分子實(shí)驗(yàn)對(duì)該通路相關(guān)蛋白表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，澳洲茄堿可顯著降低MDA-MB-468細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)遷移能力，抑制細(xì)胞的克隆形成能力。高濃度組（>40 μmol/L）較低濃度組（10 μmol/L）的抑制效果更加顯著，證實(shí)了澳洲茄堿的抑癌效果具有濃度依賴性。

在澳洲茄堿對(duì)于其他腫瘤的作用研究中，Liang等[3]的研究采用了50 μmol/L的澳洲茄堿，對(duì)兩種胰腺癌細(xì)胞系（PANC-1、CFPAC-1）進(jìn)行了克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell，結(jié)果證實(shí)在該濃度下的澳洲茄堿能夠抑制細(xì)胞的克隆形成和遷移能力。Li等[9]研究應(yīng)用同樣方法檢測(cè)了澳洲茄堿對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞增殖的作用，發(fā)現(xiàn)澳洲茄堿以劑量依賴性方式顯著抑制了SGC-7901細(xì)胞的體外增殖。Zhang等[10]研究應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)了澳洲茄堿可抑制胃癌細(xì)胞增殖并降低其克隆形成能力。Wang等[11]研究證實(shí)澳洲茄堿可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和克隆形成，抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)。在乳腺癌中，PI3K突變和AKT激活將導(dǎo)致激素治療耐藥性[13]。Ma等[14]研究發(fā)現(xiàn)KAT7通過(guò)上調(diào)PI3KAKT信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌的放射耐藥性。在中藥與腫瘤治療的研究中，郭利培等[15]研究發(fā)現(xiàn)中藥成分吳茱萸堿可能通過(guò)抑制PI3K-AKT信號(hào)通路活性來(lái)抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖。劉楠等[16]研究驗(yàn)證了紅花多糖能夠顯著降低MDA-MB-435細(xì)胞中PI3K、AKT蛋白的表達(dá)水平，有效抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)凋亡。本研究同樣驗(yàn)證了澳洲茄堿對(duì)MDAMB-468細(xì)胞中PI3K-AKT通路的作用，結(jié)果顯示PI3K和AKT蛋白的表達(dá)量均受到顯著抑制。

P53是一種抑癌基因，Pham等[8]研究表明澳洲茄堿可通過(guò)P53依賴性途徑和P53非依賴性途徑誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌HCC細(xì)胞系的凋亡。P53基因在乳腺癌中呈高表達(dá)，與乳腺癌患者病理分期、組織學(xué)分級(jí)等病理特征呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示澳洲茄堿能夠顯著抑制P53蛋白的表達(dá)，且50 μmol/L處理組的抑制作用較40 μmol/L更加明顯，有劑量相關(guān)性。

綜上所述，本研究證實(shí)了澳洲茄堿能夠抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)遷移和克隆形成能力，并初步驗(yàn)證了澳洲茄堿抗三陰性乳腺癌的作用機(jī)制可能與抑制PI3K-AKT信號(hào)通路及降低P53蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。在后續(xù)的研究中仍需進(jìn)一步驗(yàn)證：澳洲茄堿與PI3K-AKT通路抑制劑以及鉑類腫瘤化療藥物聯(lián)合應(yīng)用是否能夠起到協(xié)同促進(jìn)作用。從而在更少的藥物用量和更低的化療副作用下產(chǎn)生有效的抗癌效果，為將來(lái)澳洲茄堿可能應(yīng)用于乳腺癌的臨床治療提供理論參考。