PCR熒光探針?lè)z測(cè)葉酸三項(xiàng)代謝能力

吳 雪 王亞楠 毛冰昆 盧克新

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科，山東濱州 256600

葉酸缺乏是新生兒出生缺陷、自然流產(chǎn)、妊娠期貧血、妊娠期高血壓疾病的高危因素。孕婦對(duì)葉酸的需求量是普通人群的4倍[1]。隨著基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，認(rèn)識(shí)到葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致個(gè)體葉酸代謝能力存在差異。根據(jù)個(gè)體葉酸代謝基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，評(píng)估育齡婦女葉酸代謝障礙的風(fēng)險(xiǎn)情況，指導(dǎo)其合理補(bǔ)充葉酸，是改善不良孕產(chǎn)史婦女妊娠結(jié)局、降低出生缺陷風(fēng)險(xiǎn)的有效措施。山東英盛生物技術(shù)有限公司研制開發(fā)的葉酸三項(xiàng)代謝能力檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針?lè)ǎ糜诙ㄐ詸z測(cè)人類外周血中葉酸代謝相關(guān)基因（包括MTHFR677、MTHFR1298、MTRR66）位點(diǎn)的堿基突變，以期輔助臨床醫(yī)生評(píng)估患者葉酸代謝障礙風(fēng)險(xiǎn)程度，為育齡期女性科學(xué)增補(bǔ)葉酸進(jìn)行量化指導(dǎo)，增強(qiáng)個(gè)性化補(bǔ)充的依從性。此實(shí)驗(yàn)依托濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、濰坊市人民醫(yī)院、煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院以證明其臨床應(yīng)用中的安全性和有效性。三家醫(yī)院共納入1050例受試者，現(xiàn)報(bào)道濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院研究的350例患者研究結(jié)果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年7—12月于濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診并簽署受試者知情同意書的女性患者350例作為研究對(duì)象，平均年齡（29.30±4.27）歲，根據(jù)既往妊娠史分為正常組（無(wú)不良妊娠史）318例和研究組（有不良妊娠史）32例，正常組納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次孕育，確認(rèn)本次妊娠為宮內(nèi)活胎且胎兒發(fā)育正常；②既往孕育無(wú)不良孕產(chǎn)史；③無(wú)孕育史。研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：①有自然流產(chǎn)史；②有胚胎停育史；③有神經(jīng)管畸形胎兒孕史；④有染色體異常胎兒孕史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①3個(gè)月內(nèi)參加過(guò)臨床試驗(yàn)；②有精神障礙無(wú)法配合完成；③因各種原因受試者自動(dòng)退出或不能完成者；④排除其他遺傳性疾病。本研究經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：2018-007-03）。

1.2 實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品與檢測(cè)儀器

葉酸三項(xiàng)代謝能力檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針?lè)ǎㄉ綎|英盛生物技術(shù)有限公司，1811001、190701）；金標(biāo)準(zhǔn)：sanger測(cè)序法（生工生物工程上海股份有限公司）；檢測(cè)儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Life Technologies Holdings Pte Ltd，型號(hào)：ABI 7500）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 受試者采集兩份靜脈血1.5～2.0 ml，置于EDTA抗凝管中。

1.3.2 樣本處理 取200μl EDTA抗凝血加入600 μl雙蒸水，振蕩混勻，室溫放置10 min，12 000 rpm離心5 min，棄上清；加入200 μl DNA提取液，100℃水浴8 min；12 000 rpm離心5 min，取上清用于檢測(cè)。

1.3.3 樣本檢測(cè)及PCR擴(kuò)增 將2 μl待測(cè)DNA模板、空白對(duì)照、陰性質(zhì)控、陽(yáng)性質(zhì)控加入含有23 μl PCR反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管內(nèi)。按照實(shí)驗(yàn)儀器說(shuō)明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

采用TaqMan探針標(biāo)記的熒光PCR技術(shù)，針對(duì)靶基因（MTHFR基因C677T、A1298C，MTRR基因A66G）設(shè)計(jì)高度特異的引物和探針。每種探針的5’端為報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端為淬滅熒光基團(tuán)，通過(guò)所檢測(cè)到的熒光信號(hào)類型，判斷樣本是否存在相應(yīng)突變位點(diǎn)。將另一份樣本送生工生物工程（上海）股份有限公司完成測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品基因型和對(duì)照方法檢測(cè)結(jié)果一致性分析

葉酸代謝基因相關(guān)位點(diǎn)MTHFRC677T、A1298C、MTRRA66G與測(cè)序法之間的一致率分別為100.00%、99.43%、98.84%；一致率的95%CI為98.93～100.00、0.93～1.00、97.05～99.68；一致性檢驗(yàn)的Kappa值為1.000、0.972、0.979；Kappa檢驗(yàn)P值均<0.0001。見表1～3。

表1 MTHFR基因C677T位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果一致性列表（測(cè)序法診斷基因型）

表2 MTHFR基因A1298C位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果一致性列表（測(cè)序法診斷基因型）

表3 MTRR基因A66G位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果一致性列表（測(cè)序法診斷基因型）

統(tǒng)計(jì)結(jié)果均顯示試驗(yàn)產(chǎn)品與對(duì)照方法檢測(cè)結(jié)果的Kappa值均>0.95，證明兩種方法所測(cè)的檢測(cè)結(jié)果一致性極好，對(duì)Kappa值做假設(shè)檢驗(yàn)，P值均<0.0001，證明兩種方法一致性由隨機(jī)因素造成的可能性較小。

2.2 葉酸代謝障礙相關(guān)基因多態(tài)性與女性不良孕產(chǎn)史相關(guān)性討論

單個(gè)基因位點(diǎn)比較，研究組與正常組基因型分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。見表4～6。

表4 MTHFR基因C677T位點(diǎn)

表5 MTHFR基因A1298C位點(diǎn)

表6 MTRR基因A66G位點(diǎn)

在32例有不良孕產(chǎn)史的受試者中，因C677T位點(diǎn)突變而提示風(fēng)險(xiǎn)的僅有16例，占不良孕產(chǎn)史受試者總數(shù)的50.00%。綜合考慮三個(gè)位點(diǎn)（包括單位點(diǎn)突變和多位點(diǎn)突變），提示葉酸代謝風(fēng)險(xiǎn)的受試者有29例，占所有不良孕史受試者的90.63%。

3 討論

我國(guó)是出生缺陷高發(fā)國(guó)家，在現(xiàn)有的8000多萬(wàn)殘疾人中，70%是由出生缺陷所致[2]。葉酸參與多種物質(zhì)的合成，影響葉酸代謝水平的酶包括5，10-亞甲基四氫葉酸葉酸還原酶（MTHFR）和甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）。MTHFR常見基因多態(tài)性有C667T和A1298C兩個(gè)位點(diǎn)，該兩處位點(diǎn)的突變都將引起酶活性改變，其中兩個(gè)位點(diǎn)雙突變時(shí)酶活性降到最低，僅為野生型15%[3]。根據(jù)閔愛萍等[4-5]研究，MTHFR基因C677T、A1298C，MTRR基因A66G突變是導(dǎo)致體內(nèi)同型半胱氨酸升高的獨(dú)立遺傳決定因素，同時(shí)MTHFR基因A1298C位點(diǎn)的突變與MTHFR基因C677T、MTRR基因A66G位點(diǎn)突變對(duì)體內(nèi)同型半胱氨酸水平升高具有聯(lián)合作用。孕前3個(gè)月補(bǔ)充葉酸，可以降低胎兒神經(jīng)管發(fā)育缺陷，從而降低無(wú)腦兒、裂腦兒的發(fā)生率[6-7]。多數(shù)NTDs可以通過(guò)服用葉酸達(dá)到預(yù)防作用[8]，2009年6月21日原衛(wèi)生部啟動(dòng)增補(bǔ)葉酸預(yù)防神經(jīng)管缺陷項(xiàng)目[9]，建議無(wú)高危因素的育齡期婦女孕前3個(gè)月口服0.4～0.8 mg葉酸，有神經(jīng)管缺陷生育史的婦女建議至少孕前1個(gè)月開始每日增補(bǔ)4 mg葉酸。目前育齡夫婦已經(jīng)意識(shí)到孕前應(yīng)用葉酸或葉酸復(fù)合營(yíng)養(yǎng)素有助于預(yù)防神經(jīng)發(fā)育相關(guān)缺陷疾病[10-11]。

目前，檢測(cè)MTHFR和MTRR基因多態(tài)性的方法包括Taqman-MGB技術(shù)、高分辨溶解曲線法、PCR-RFLP法、引物擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)結(jié)合側(cè)向流層[12-15]。本研究通過(guò)PCR熒光探針?lè)ㄩ_發(fā)了一種快速檢測(cè)MTHFR、MTRR基因多態(tài)性的檢測(cè)方法。本研究組所研制的檢測(cè)體系的檢測(cè)結(jié)果與驗(yàn)證方法一致。PCR熒光探針?lè)ň邆錂z測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、樣本要求低的特點(diǎn)，產(chǎn)品適用于具備雙通道檢測(cè)能力的多種型號(hào)PCR儀。可在臨床上廣泛使用。

有研究[16]指出MTHFR和MTRR是不良妊娠發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。綜合考慮三個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合應(yīng)用可更好地預(yù)測(cè)不良妊娠結(jié)局，因此在孕前進(jìn)行基因分析并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果科學(xué)補(bǔ)充葉酸是降低不良妊娠發(fā)生重要手段。