栽培基質中發酵羊糞濃度對靈芝多糖含量的影響

楊鄭州，謝曉娜*

（1.百色學院農業與食品工程學院，廣西百色 533000；2.廣西芒果生物學重點實驗室，廣西百色 533000；3.亞熱帶特色農業產業學院，廣西百色 533000）

靈芝為多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子實體，是我國醫學寶庫中一種珍貴的食藥用菌[1]。現代醫學證明，靈芝具有抗腫瘤、免疫調節、治療心腦血管疾病及抗衰老等功效[2]。靈芝含有豐富的營養物質和生物活性成分。研究表明靈芝的主要生理活性成分有靈芝多糖、三萜類化合物、蛋白質、多肽、核苷類、呋喃類、甾醇、生物堿和氨基酸等[3-4]，其中的靈芝多糖、三萜類化合物是靈芝的主要活性成分。賈少杰等采用響應面分析方法對微波輔助法提取靈芝多糖工藝進行了優化，同時研究靈芝多糖抑菌活性時發現靈芝多糖對5 種供試菌均表現出抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用明顯[5]。羊糞含有豐富的有機質和N、P、K 等元素，混合一定的輔料發酵之后是生產食用菌的優質培養料[6]。近年來靈芝人工栽培已經成為研究熱點，但對生物有機肥基質栽培靈芝的研究卻少見報道。以赤靈芝為材料，初步研究發酵羊糞栽培基質中靈芝多糖含量的變化，對羊糞資源的循環利用及靈芝培養基異源基質材料的探究具有創新意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌種為赤靈芝，由百色學院農學院食用菌基地提供。發酵羊糞由山東豐潤農資有限公司提供。培養基材料由桉木屑、雜木屑、羊糞、石膏、麥麩、石灰粉等組成。

1.2 試驗方法

1.2.1 栽培料配方

以赤靈芝為研究對象，設置5 組不同羊糞添加濃度的配方（詳見表1）。靈芝栽培方法為袋料栽培，選用聚乙烯塑料袋填料，每個配方8袋，3次重復。于高壓滅菌鍋中121 ℃條件下滅菌2 h，冷卻至室溫，于超凈工作臺進行接種，在溫度26～28 ℃、濕度60%～65%、避光條件下培養，菌絲滿袋后開袋出芝并移至大棚，保持溫度26～28 ℃、濕度85%～90%。每袋子實體僅留存最健壯的一個，當菌袋干癟養料耗盡，子實體菌蓋整體呈褐色時，采收子實體。

表1 靈芝栽培料配方 單位：%

1.2.2 羊糞有機質及總養分質量分數的測定

1）羊糞有機質的測定。用定量的重鉻酸鉀-硫酸溶液，在加熱條件下，使有機肥料中的有機碳氧化，多余的重鉻酸鉀用硫酸亞鐵標準溶液滴定，同時以二氧化硅為添加物作空白試驗。根據氧化前后氧化劑耗量，計算有機碳含量，乘以系數1.724，為有機質含量[7]。

2）羊糞總養分質量分數的測定（N+P2O5+K2O）。總氮的測定：有機肥中的有機氮經過硫酸-過氧化氫消煮，轉化為銨態氮。堿化后蒸餾出來的氨，用硼酸溶液吸收，以標準酸溶液滴定，計算樣品中總氮含量[7]。磷含量測定：有機肥試樣采用硫酸和過氧化氫消煮，在一定酸度下，待測液中的硫酸根離子與偏釩酸和鉬酸反應生成黃色三元雜多酸。在一定濃度范圍內，黃色溶液的吸光度與磷含量呈正比例關系，用分光光度法測定磷含量[7]。鉀含量測定：有機肥料試樣經過硫酸和過氧化氫消煮，稀釋后用火焰光度法測定。在一定濃度范圍，溶液中鉀濃度與發射強度成正比例關系[7]。每個處理重復3次。

1.2.3 超聲波法提取靈芝多糖

采收不同配方的靈芝子實體粉碎成末。稱取1.0 g過20 mm 孔徑篩的樣品粉末，置于50 mL 具塞離心管內，用5 mL 水浸潤樣品，加入20 mL 無水乙醇，震蕩搖勻，置于超聲波清洗機中于120 W、60 ℃條件下提取30 min，提取結束后，于4 000 r·min-1離心10 min棄去上清液，不溶物用10 mL 乙醇溶液（80%）洗滌、離心。用水將上述不溶物轉移至圓底燒瓶，加入50 mL水，于120 W、60 ℃下超聲提取30 min，重復2 次。冷卻至室溫，過濾，將上清液轉移至200 mL 容量瓶中，殘渣洗滌2～3 次，洗滌液轉至容量瓶，加水定容。此溶液為樣品待測液。如多糖含量較高，可適當稀釋后進行分析測定。

1.2.4 苯酚硫酸法測定多糖含量

糖在濃硫酸作用下，水解生成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚縮合成橙黃色化合物，且顏色穩定，在波長490 nm 處和一定的濃度范圍內，其吸光度與多糖含量呈線性關系，利用分光度計測定其吸光度，在標準曲線上查出樣品的多糖含量[16]。具體試劑配制、試驗步驟及多糖含量計算方法參考《SN/T 4260-2015 出口植物源食品中粗多糖的測定苯酚-硫酸法》。

2 結果與分析

2.1 羊糞質量檢測結果

由表2 可知試驗所用發酵羊糞肥料中，有機質含量最高，鉀含量其次，磷含量較低，氮含量最低。羊糞中含有豐富的有機質，在靈芝栽培過程中主要為靈芝生長提供碳源。碳源是提供食用菌生長發育碳素的重要營養來源。食用菌吸收的碳約有20%被用來合成細胞和代謝產物中的碳架結構，80%被用來維持生命活動所需的能量[8]。因此，利用發酵羊糞栽培靈芝不失為一種好的羊糞資源的無害化處理方式。

表2 重復性試驗驗證 單位：%

2.2 不同羊糞添加濃度下靈芝菌袋污染率比較

據表3 可知，隨著發酵羊糞在栽培基質中的占比越來越大，菌袋污染率也隨之升高，由此推測羊糞添加量與菌袋污染率呈正相關。在羊糞添加量為0%時，菌袋污染率僅為8.33%；而在靈芝栽培基質中羊糞含量占比達45%時，菌袋污染率高達62.5%。造成這種趨勢的原因是靈芝菌絲無法充分分解羊糞中的養分，而一些霉菌微生物適應性強，添加羊糞使其競爭力大大提高，抑制了靈芝菌絲生長，造成菌袋污染。

表3 不同羊糞添加濃度下靈芝菌袋污染率統計

2.3 不同羊糞添加濃度下菌絲生長速度比較

利用SPSS 軟件對試驗數據進行單因素方差分析。據表4 可知，不同羊糞添加量下的靈芝菌絲生長速度差異極顯著（p<0.01）；10%試驗組、20%試驗組、30%試驗組菌絲生長速度與對照組之間差異極顯著（p<0.01），45% 試驗組與對照組無顯著差異（p＞0.05）。表明隨著羊糞添加量的增加，靈芝菌絲生長速度呈現先升高后下降的趨勢。羊糞添加量在0%～20%之間，菌絲生長速度呈現上升趨勢；羊糞添加量大于20%時，菌絲生長速度顯著下降。當羊糞添加量為20%時，菌絲生長速度達到最大；10%試驗組和30%試驗組菌絲生長速度相近，僅次于20%試驗組。30%試驗組和45%試驗組菌絲生長速度下降的原因可能是培養料中羊糞作為碳源占比過大導致料內碳氮比不適宜靈芝菌絲生長，菌絲體活性下降，分解養分能力不足。

表4 不同羊糞添加濃度下菌絲生長速度比較

2.4 不同羊糞添加濃度下靈芝的多糖含量比較

利用SPSS 軟件對試驗數據進行單因素方差分析。據表5 可知，不同配方所得靈芝子實體的多糖含量差異極顯著（p<0.01）；同一配方下所得樣品的多糖含量無顯著差異。10%試驗組、45%試驗組和對照組樣品之間的多糖含量無顯著差異；20%試驗組、30%試驗組與其他各組樣品的多糖含量差異極顯著（p<0.01）。隨著羊糞添加劑量的升高，樣品的多糖含量呈現先升高后降低的趨勢，且差異極顯著（p<0.01），其中20%試驗組中樣品多糖含量最高，30%試驗組次之。

3 結論與討論

試驗結果顯示發酵羊糞中含有豐富的有機質，可作為靈芝生長的碳源；此外羊糞含有豐富的有機質和N、P、K 等元素，混合一定的輔料發酵之后是生產食用菌的優質培養料。本次研究結果還表明發酵羊糞添加量與菌袋污染率呈正相關；對照組與20%、30%試驗組的菌絲生長速度、樣品多糖含量均存在極顯著差異（p<0.01）；20%試驗組所得靈芝的菌絲生長速度、多糖含量最大。因此在實際生產中可以添加較低劑量的發酵羊糞(20%～30%)來改良靈芝培養基，提高靈芝品質。此外，培養過程中也要保持環境嚴格無菌，將菌袋污染率控制在合理范圍內，以降低生產材料的耗損率。在靈芝菌絲生長過程中，保持一定的溫度、濕度，及時補水、通風，適當添加一些營養物質調節料內碳氮比，可以促進菌絲生長，縮短靈芝生長周期，達到增產的目的。利用畜禽糞便和農作物秸稈等栽培食用菌不僅是對農業廢棄物的資源化利用，而且生產出高營養價值和經濟效益的食用菌，栽培后的菌渣還能還田作肥料，真正實現了資源的多層次循環利用。

隨著近年來農牧業的迅速發展，規模化養殖場逐漸增多，如何解決羊糞堆積、防止環境污染，保證人畜健康已成為養殖者面臨的重大問題。據報道羊糞含有有機質24%～27%、氮0.7%～0.8%、磷0.45%～0.6%、鉀0.4%～0.5%。羊糞的有機質含量比其他畜糞多，糞質較細，肥分濃厚[8]。試驗所購羊糞的有機質含量略低于上述報道標準，總氮含量低于報道標準，磷含量和鉀含量遠遠高出報道標準。形成這種差異的原因可能在于所使用的羊糞來源不同，如羊的品種、產地、所喂食料的不同均有可能造成羊糞養分含量的差異。也有可能是羊糞發酵過程中有機質養分被某些微生物所利用，導致一定量的損耗和流失。劉大徹等用羊糞培育金針菇，結果顯示袋栽金針菇比瓶栽產量高[9]。任愛民研究發現用麥草羊糞培養料栽培雙孢蘑菇具有出菇早、產量高、品質好的優點[10]。毛偉娟利用牛糞和大蒜秸稈等農村固體廢棄物生產食用菌，1 m2菇床可生產8 kg 雙孢蘑菇[11]。雅梅用干羊糞和禾草堆肥發酵制作菌菇培養料，因羊糞中含有一些殺菌物質，與其他糞肥發酵制作的培養基相比較，羊糞培養料污染和生蟲的概率更低[12]。為明確蟹味菇菌渣的堆肥效果，明晰菌渣與豬糞、羊糞、稻草等原料在堆肥過程中的碳氮轉化效率和損失，干瑩瑩等按濕質量比設菌渣、菌渣與豬糞、菌渣與羊糞進行堆肥試驗，結果顯示純菌渣堆肥后有機肥總養分含量高，但產出量較低，發酵過程中碳氮損失多，相對于豬糞，羊糞的C/N 高，養分含量低[13]。梁明勤等報道用杏鮑菇菌糠和玉米芯為主料，麩皮、石膏和過磷酸鈣為輔料，添加不同比例的豬糞沼液栽培平菇1618，結果表明其菌絲生長速度顯著高于CK，菌絲長勢也好于CK[14]。據統計，早在2000年國內養殖所產生的畜禽糞便等廢棄物達到27 億t，到2018 年高達38 億t，2020 年時全國產生42.44 億t 的畜禽糞便廢棄物，成為中國最主要的農業污染源之一[15]，因此畜禽糞便廢棄物的資源化利用成為亟待解決的問題。