狹鱈魚蛋白肽對腺嘌呤誘導的慢性腎衰竭小鼠的影響

董晶寧，侯虎

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

慢性腎臟疾病（chronic kidney disease，CKD）已經成為全球性的公共健康問題，每年患病人數不斷增長[1-2]。每年患病人數不斷增長，高達2.8 億，發病率和死亡率高，每年死亡人數高達120 萬[3-5]。CKD 的致病機制主要途徑有漸進性腎臟間質纖維化、腎小管毛細血管缺氧和腎小管萎縮導致的腎臟功能破壞[6]，最終導致慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）[7]。CRF的特征是持續性腎小球硬化和腎間質纖維化，造成腎小球濾過率降低，腎臟排泄物質滯留[7]。目前臨床上尚未有效針對CRF 的治療技術，仍有大量早期腎病患者進入終末期透析治療階段。

研究表明蛋白質水解物對腎損傷具有一定的保護作用。Nasri 等[8]發現從蝦虎魚中制備得到的肌肉蛋白及其水解物可以抑制高糖飲食誘導小鼠的尿酸及血清肌酐水平的升高，防止腎臟結構變化，改善高熱量飲食大鼠的腎損傷。Hidayat 等[9]從營養支持角度出發，探究豌豆蛋白水解物保護腎臟功能的作用，研究結果表明蛋白水解物促進系膜細胞增殖，降低了糖尿病腎小球硬化系膜細胞模型的纖連蛋白和轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的水平。多肽具有多種生物活性，如抗炎活性[10]、抗氧化活性[11]、促進細胞增殖[12]等，而且營養價值高，吸收性好，作為營養功能組分，在預防疾病惡化方面具有極大的研究潛力。目前關于海洋源多肽對腎臟影響作用的研究較少，而狹鱈魚的營養價值極高，并且狹鱈魚蛋白肽具有多種潛在活性[13]。

高濃度的腺嘌呤通過黃嘌呤氧化酶的作用在體內生成極難溶于水的2，8-二羥基嘌呤，沉積于腎小管后發生阻塞，抑制了機體氮質化合物的排泄，造成機體出現氮質血癥、毒素蓄積和電解質、氨基酸代謝紊亂，引起的病理特征類似于CRF[14]。腺嘌呤造模具有周期短、死亡率低、技術難度小等優點，已經成為常用的腎病模型[15]。

本研究使用腺嘌呤誘導的慢性腎衰竭小鼠模型，探究狹鱈魚蛋白肽對腎臟功能、結構以及炎癥、纖維化因子的影響，旨在揭示狹鱈魚蛋白肽對慢性腎衰竭小鼠的影響，以期為狹鱈魚蛋白肽在腎病預防以及治療領域的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狹鱈魚：青島昱順杰商貿有限公司；胰蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司；蛋白質標準品：美國Sigma公司；尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒、肌酐（serum creatinine，Scr）試劑盒：南京建成生物工程研究所；反轉錄試劑盒、熒光定量轉錄試劑盒：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；生理鹽水、4%甲醛固定液：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（Agilent 1260）：安捷倫科技（中國）有限公司；質譜儀（QTOF 5600）：美國SCIEX 公司；電動顯微鏡（NIKON/Ni-E）：上海通灝光電科技有限公司；超微量分光光度計（Nano-100）：美國Thermo Scientific 公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀（FQD-96C）：杭州博日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 狹鱈魚蛋白肽（protein peptides of pollock，THP）的制備

以狹鱈魚肉為原料，用1.5%胰蛋白酶水解，經滅酶、冷卻、100 Da 透析袋除鹽，收集透析液，冷凍干燥，得到狹鱈魚蛋白肽。

1.3.2 THP 理化性質的測定

1.3.2.1 THP 分子量的測定

THP 的分子量分布使用高效液相色譜儀測定[16]。分析柱為TSK GEL G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，流動相為乙腈∶三氟乙酸∶超純水=30∶0.1∶70（體積比）。所選用的標準品為不同分子量的谷胱甘肽（307 Da）、桿菌肽（1 422 Da）、牛胰島素（5 733 Da）、細胞色素C（13 500 Da）和牛血清白蛋白（68 000 Da），以標準品分子量的對數（lgM）和保留時間作圖，得到標準方程（y=-0.200 1x+7.258 1，R2=0.991），根據標準曲線計算THP 的分子量。

1.3.2.2 THP 氨基酸組成的測定

根據GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》[17]，采用氨基酸自動分析儀測定THP 的氨基酸組成。

1.3.2.3 THP 氨基酸評分的計算

根據Hammad 等[18]的方法進行必需氨基酸評分（amino acid score，AAS）計算，計算公式（1）如下。

式中：A為必需氨基酸評分；S為樣品蛋白質中氨基酸含量，mg/g；F為聯合國糧農組織/世界衛生組織評分標準模式中相應必需氨基酸含量（RPa），mg/g。

1.3.3 慢性腎衰竭小鼠模型的建立和給藥方式

慢性腎衰竭小鼠模型的建立參考Wang 等[19]的方法并作一定的修改。6 周齡無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級C57BL/6J 雄性小鼠適應性喂養7 d 后隨機分組，每組10 只，分別為正常組、模型組、陽性藥物組（吡非尼酮藥物治療）、TL 組[THP 400 mg/（kg·d）]、TH 組[THP 800 mg/（kg·d）]。本研究中所有方案和程序經中國海洋大學食品科學與工程學院實驗動物護理倫理委員會的審批通過。具體實驗分組及給藥方式如下。

1）正常組（CON）：喂養普通飼料，自由飲水。

2）模型組（CRF）：造模期間喂養0.2%腺嘌呤飼料，自由飲水，21 d；造模成功后，換為普通飼料，自由飲水。

3）陽性藥物組（PFD）：造模期間喂養0.2%腺嘌呤飼料，自由飲水，21 d；造模成功后，換為普通飼料，同時灌胃吡非尼酮混懸液[102 mg/（kg·d）]，自由飲水。

4）TL 組、TH 組：造模期間喂養0.2%腺嘌呤飼料，自由飲水，21 d；造模成功后，換為普通飼料，灌胃THP溶液[TL 組400 mg/（kg·d），TH 組800 mg/（kg·d）]，自由飲水。

整個實驗過程中，每日觀察小鼠的生長狀態，每周記錄小鼠的體質量。藥物作用28 d 后，進行眼部取血，然后解剖采取腎臟組織，記錄腎臟組織質量，計算腎臟指數（R，mg/g），計算公式（2）如下。

式中：W為腎臟質量，mg；M為體質量，g。

1.3.4 小鼠腎臟組織病理學觀察

取小鼠腎臟組織于4%甲醛固定液中48 h，石蠟包埋，使用冷凍切片機得到厚度為4 μm 的切片，對切片進行蘇木精-伊紅（H＆E）染色和馬松（Masson）染色，使用電動光學顯微鏡拍攝染色照片。

1.3.5 小鼠血清生化指標的測定

小鼠禁食12 h 后取材，采集小鼠血液后，于常溫下靜置1～2 h，使血清分層，6 000 r/min、4 ℃離心40 min，取上層血清，使用試劑盒測定尿素氮、肌酐含量。

1.3.6 小鼠腎臟組織中因子mRNA 水平的測定

稱取50～100 mg 腎臟組織，使用Trizol 法提取總mRNA，使用超微量分光光度計測定吸光度（OD 值），OD260/280范圍在1.8～2.0 之間表明RNA 純度較好。根據試劑盒說明進行逆轉錄得到cDNA，反應體系：總RNA 1 μg；4×g DNA wiper Mix 4 μL；Rnase-free ddH2O 補足至16 μL；42 ℃反應5 min；5×HiScript ⅡqRT SuperMixⅡ4 μL；50 ℃反應15 min；85 ℃反應5 s。cDNA 溶液于-80 ℃冷凍保存。

以cDNA 為模板，以β-肌動蛋白為內參，實時熒光定量PCR 進行定量分析，引物序列見表1。

表1 實時熒光定量-PCR 反應的引物序列Table 1 Primer sequences of real time quantitative-PCR

反應體系：cDNA 2 μL；Primer 1（10 μmol/L）0.4 μL；Primer 2（10 μmol/L）0.4 μL；2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL；ddH2O 7.2 μL。擴增程序：預變性95 ℃、30 s；變性95 ℃、10 s，退火60 ℃、30 s，延伸95 ℃、15 s，40 個循環；溶解曲線95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。每個樣品設置兩個復孔，采用2-△△Ct法進行相對定量分析[20]。

1.4 統計分析

所有實驗結果以平均數±標準差表示，單因素方差分析采用SPSS 25.0 以及Graghpad 軟件進行分析處理，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 THP 的理化性質測定結果

THP 的高效液相色譜圖如圖1所示。

圖1 THP 的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of THP

由圖1 可知，THP 的出峰時間為24.984 min，計算得分子量為181.47 Da。分子量小于1 000 Da，屬于小分子肽，具有結構簡單、易于吸收等優點。

THP 的氨基酸組成見表2。

表2 THP 的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of THP

由表2 可知，谷氨酸含量最高，其次是天冬氨酸，甘氨酸、丙氨酸和亮氨酸含量都較高。由表中數據可以看出，氨基酸種類齊全，THP 可以作為一種潛在優質蛋白來源。

THP 的氨基酸評分見表3。

表3 THP 的必需氨基酸評分Table 3 Essential amino acid score of THP

由表3 可知，THP 的必需氨基酸種類齊全且大部分必需氨基酸（異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸）的氨基酸評分大于1.0，其氨基酸組成符合人體對氨基酸的需求，說明THP 可以作為一種優質蛋白質來源，為人體提供能量。

2.2 THP 對慢性腎衰竭小鼠的生理狀態和臟器指數的影響

THP 對慢性腎衰竭小鼠的體質量和腎臟指數的影響見圖2。

圖2 THP 對慢性腎衰竭小鼠的體質量和腎臟指數的影響Fig.2 Effects of THP on the body mass and kidney index in the mouse model of chronic renal failure

實驗期間，對小鼠的生長狀態進行觀察。CON 組小鼠反應靈敏，活動力強；皮毛呈現亮黑色且具有光澤度。CRF 組小鼠的精神狀態明顯下降，反應遲鈍，活動力減弱；皮毛光澤度下降且變稀疏；墊料易潮濕，表現出多飲多尿癥狀，糞便干燥，出現一定程度的血尿。28 d 干預期間，TL、TH 組小鼠活動力明顯增強，精神狀態好轉，皮毛光澤度增加。因此，THP 可以很好地改善慢性腎衰竭小鼠的生長狀態。

由圖2A 可知，28 d 時，與CRF 組相比，PFD、TH組[800 mg/（kg·d）]的小鼠體質量逐漸增加，而[400 mg/（kg·d）]THP 對慢性腎衰竭小鼠體質量沒有明顯影響。

組織器官損傷程度可以通過組織器官的質量變化來間接反映，腎臟指數是反映腎功能的半定量指標[21]。干預28 d 后，取各組小鼠的腎臟組織稱重、計算腎臟指數。由圖2B 可知，CON 組的腎臟指數為12.82 mg/g，CRF 組的腎臟指數為14.69 mg/g。與CON 組相比，CRF腎臟指數極顯著上升（P＜0.01），表明模型組小鼠出現腎臟損傷和水腫。PFD、TL 組和TH 組的腎臟指數分別為10.27、11.01、10.07 mg/g，與CRF 組相比，PFD 組小鼠的腎臟指數下降（P＜0.01），TL組和TH 組小鼠的腎臟指數分別下降了25.05%和31.45%，表明THP 對改善慢性腎衰竭小鼠的腎臟損傷有促進作用。

2.3 THP 對慢性腎衰竭小鼠血清生化指標的影響

上述結果表明，THP 對慢性腎衰竭的腎臟損傷有改善作用。測定慢性腎衰竭小鼠的血清尿素氮和肌酐含量的變化，分析THP 對腎臟功能的影響，結果見圖3。

圖3 THP 對慢性腎衰竭小鼠的尿素氮和肌酐含量的影響Fig.3 Effects of THP on urea nitrogen and creatinine content in mice with chronic renal failure

機體內的蛋白質代謝產物尿素氮，主要通過腎小球的濾過作用排出體外[22]。臨床上，尿毒氮是判斷腎小球濾過率功能的重要指標之一。由圖3A 可知，與CON 組相比，CRF 組血清尿素氮含量升高了3.31 mmol/L（P＜0.01），表明腺嘌呤飲食對小鼠的腎臟功能具有損害作用，表現出腎損傷。經過28 d 干預后，PFD、TL、TH組尿素氮含量分別為12.04、11.70、11.39 mmol/L，與CRF 組相比，TL 組和TH 組小鼠的尿素氮含量下降了16.55%和18.76%。并且，隨著THP 作用劑量的增加，尿素氮含量下降程度增大。

機體內產生的血肌酐在腎小球過濾作用下，經過尿液排出體外，是評價腎臟功能的一項指標[23]。由圖3B可知，CON 和CRF 組血肌酐含量分別為25.84 μmol/L和55.49 μmol/L，CRF 組小鼠的血肌酐含量是CON組的2 倍，表現出腎功能不全。28 d 干預后，TL、TH 組血肌酐含量分別為36.19 μmol/L 和35.31 μmol/L。與CRF 組相比，THP 極顯著降低了慢性腎衰竭小鼠的血肌酐含量（P＜0.01），并且具有劑量依賴性，TL 組和TH組小鼠的血肌酐含量分別降低了34.78%和36.37%。

綜合以上實驗結果，THP 對改善腎臟功能具有顯著作用。

2.4 THP 對慢性腎衰竭小鼠腎臟組織狀態的影響

觀察小鼠的腎臟形態，如圖4A所示。為了研究THP 對腎臟結構的影響，取小鼠的腎臟進行染色處理，H＆E 染色結果如圖4B所示，Masson 染色結果如圖4C所示。

圖4 THP 對慢性腎衰竭小鼠的腎臟結構的影響Fig.4 Effects of THP on kidney histopathology in the mouse model of chronic renal failure

由圖4A 可知，CON 組小鼠雙腎大小、色澤均正常，呈現紅褐色，表面光滑且有光澤；CRF 組小鼠腎臟萎縮，質地變軟，呈現出灰白色，表面無光澤且凹凸不平，表現出明顯的腎損傷。與CRF 組相比，TL、TH 組小鼠腎臟逐漸恢復，色澤和形態有所改善，凹凸不平癥狀有所減輕，表明THP 可以改善慢性腎衰竭小鼠的腎臟損傷并具有劑量依賴性。

由圖4B 可知，CON 組腎小球和腎小管結構完整且清晰，腎小球皮質和髓質輪廓清晰，腎小管大小、形狀、間質面積正常，腎小管腔無擴張，腎小管上皮細胞有序排列，腎間質無膠原纖維組織增生，無炎癥浸潤。CRF 組腎小球數量減少，腎小管上皮細胞脫落，腎小管間質不規則，管腔擴張，炎性細胞浸潤。TL、TH 組小鼠腎臟的管腔擴張明顯減輕，腎間質炎性浸潤減輕。

腎小管間質纖維化與CKD 向ESRD 進展密切相關[24]。由圖4C 可知，肌原纖維被染成紅色，膠原纖維呈現藍色。CON 組小鼠的腎小球、腎小管及間質狀態均正常，未見間質纖維化；CRF 組呈藍色的纖維性腎組織廣泛分布，腎小球、腎小管及腎間質沉積大量膠原纖維，表明慢性腎衰竭小鼠的腎臟間質損傷嚴重。與CRF 組相比，THP 干預28 d 后，腎損傷面積明顯減少。

以上染色結果說明，THP 對慢性腎衰竭小鼠的腎損傷具有一定的保護作用。

2.5 THP 對慢性腎衰竭小鼠腎臟組織中炎癥因子mRNA 相對水平的影響

THP 對慢性腎衰竭小鼠腎臟中促炎因子在mRNA水平的影響見圖5。

圖5 THP 對慢性腎衰竭小鼠腎臟組織中炎癥因子mRNA 水平的影響Fig.5 Effects of THP on the mRNA levels of inflammatory cytokines in the kidney tissue of the mouse model of chronic renal failure

有大量研究表明，炎癥細胞因子（白細胞介素-1α、白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子、白細胞介素-6[25]等）誘導炎癥的產生，炎癥的持續發展會導致白細胞募集、小管細胞凋亡、腎小管萎縮以及間質纖維化[26]。由圖5 可知，與CON 組相比，CRF 組炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平極顯著升高（P＜0.01）。與CRF 組相比，THP 極顯著下調慢性腎衰竭小鼠腎臟炎癥因子水平（P＜0.01），并且具有劑量依賴性。這說明THP 對慢性腎衰竭小鼠的腎臟炎癥具有一定的抑制作用，與腎臟組織的H&E 染色結果一致。

2.6 THP 對慢性腎衰竭小鼠腎臟組織中纖維化因子mRNA 相對水平的影響

THP 對慢性腎衰竭小鼠腎臟中促纖維化因子在mRNA 水平的影響見圖6。

圖6 THP 對慢性腎衰竭小鼠腎臟組織中纖維化因子mRNA 水平的影響Fig.6 Effects of THP on the mRNA levels of fibrotic factors in the kidney tissue of the mouse model of chronic renal failure

TGF-β1 通過與膜上TGFβ II 型受體（TβRII）、TGFβ Ⅰ型受體（TβRⅠ）結合使Smad2/3 磷酸化[27]，轉位到細胞核中，在細胞核中調節靶基因如COL1、a-SMA 和FN1 的轉錄，促使腎臟間質纖維化[28-30]。由圖6可知，與CON 組相比，CRF 組中纖維化因子COL1、FN1 的mRNA 水平極顯著上升（P＜0.01）。干預28 d 后，與CRF 組相比，TH 組慢性腎衰竭小鼠腎臟組織中的COL1 因子的mRNA 水平顯著下降（P＜0.05）；FN1 因子的mRNA水平極顯著下降（P＜0.01）。這說明THP 可以減輕慢性腎衰竭小鼠的腎臟纖維化，并且具有劑量依賴性，與腎臟組織的Masson 染色結果一致。

3 結論

本研究探究了狹鱈魚蛋白肽THP 對腺嘌呤誘導慢性腎衰竭小鼠的影響作用。結果表明，THP 干預了小鼠體質量下降，顯著降低了腎臟指數，降低了血清尿素氮和肌酐含量，有助于改善腎臟組織結構損傷，同時下調炎癥和纖維化因子mRNA 水平，可以有效緩解慢性腎衰竭小鼠的腎臟損傷程度。因此，THP 在預防腎臟疾病領域具有很好的潛質。