雞蛋黃中4種生物活性成分聯合提取工藝

郭曉徐，劉恒洋，尹玉鑫，宋紹奇，劉美玉*

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056038；2.邯鄲市天然產物與功能性食品開發重點實驗室，河北 邯鄲 056038）

雞蛋黃約占雞蛋質量的50%，蛋黃中生物活性成分很多，其中重要成分有卵黃免疫球蛋白（immunoglobulin of yolk，IgY）、卵黃高磷蛋白（phosvitin，PV）、蛋黃油和卵磷脂（phospholipids，PL）[1-2]。IgY 是蛋黃中唯一的免疫蛋白，主要存在于漿液中，約占蛋黃總蛋白的10%[3]。IgY 具有較強的抗菌免疫活性，且安全無毒，同時還具有增強機體的免疫功能的能力[4-5]，廣泛應用于抗病毒、抗細菌感染、抗腫瘤以及免疫學診斷等領域[6-8]，在動物疾病控制中也被廣泛應用[9]；PV 是一種富含磷酸絲氨酰殘基的天然活性蛋白質[10]，具抗氧化性[11]、熱穩定性和乳化性能，常用于化妝品、營養品、醫藥制造等領域[12]，還可作為鈣強化的輔助劑，應用前景廣闊[13-14]。蛋黃油藥食兩用，其味甘、性平，不僅能清熱解毒，而且具有殺菌、消炎、止痛和修復表皮細胞的功能[15-16]。PL 在促進神經信號傳導、提高大腦活力、延緩機體衰老、防止血管硬化和抗血栓等方面均有顯著作用[17]，還具有良好的乳化、潤濕、分散等作用，廣泛應用于食品、醫藥、化妝品等行業[18-19]。本文采用水稀釋法[20]、鹽析法[21]、有機溶劑提取法從蛋黃中提取分離卵黃免疫球蛋白、卵黃高磷蛋白、蛋黃油和卵磷脂，探究雞蛋黃綜合利用最大化、提高雞蛋價值且適合工業化生產的工藝條件，以期為雞蛋精深加工提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

新鮮雞蛋：邯鄲市復興區標準化養雞場。

酶聯免疫試劑盒：上海研尊生物科技有限公司；考馬斯亮藍（G250、R250）：上海康朗生物科技有限公司；牛血清白蛋白（1 mg/mL）：合肥博美生物科技有限責任公司；硫酸銨、95%乙醇、正己烷、氯化鈉（均為分析純）：天津歐博凱化工有限公司；0.1 mol/L HCl、0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphate buf-fered saline，PBS）（pH7.2）：河北工程大學農產品深加工實驗室自制。

1.2 儀器與設備

酶標儀（EL311s）：賽默飛世爾科技有限公司；冷凍干燥機（SCIENTZ-10ND）：寧波新芝生物科技股份有限公司；臺式高速冷凍離心機（TG16）：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；紫外可見分光光度計（UV-2700）：日本島津儀器有限公司；消化爐（HYP-1040）：上海巴玖實業有限公司；多通道磁力攪拌器（SP200-2T）：杭州米歐儀器有限公司；臺式酸度計（PB-10）：賽多利斯公司；生物安全柜（HR40-11A2）：青島海爾生物醫療股份有限公司；電子天平（PX22ZH）：奧豪斯儀器有限公司；高溫鼓風干燥箱（BPG-9100BH）：上海一恒科技有限公司；恒溫水浴槽（WT100-18）：杭州米歐儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 制備流程

卵黃免疫球蛋白、卵黃高磷蛋白、蛋黃油和卵磷脂4 種活性物質聯合提取工藝流程見圖1。

圖1 提取工藝流程Fig.1 Scheme of extraction process

1.3.2 IgY 提取的單因素設計

準確稱取5 份蛋黃液，每份5 g，分別添加蛋黃液2、4、6、8、10 倍體積的蒸餾水稀釋，并用0.1 mol/L 的HCl 調至不同pH 值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0），攪拌均勻，于-20 ℃下冷凍12 h，4 ℃解凍。分別在4 500×g離心（15、25、35、45、55 min）后得到上清液水溶性組分（water soluble fraction，WSF）和沉淀物（脂蛋白）。在上清液中（WSF）加入不同用量的4 ℃飽和硫酸銨，使硫酸銨濃度達到30%、40%、50%、60%、70%，4 ℃下靜置12 h，進行第1 次鹽析，4 500×g離心25 min 后取沉淀，溶于適量pH7.2 的磷酸鹽緩沖液，加入上清液（WSF）體積2/3 的4 ℃蒸餾水和1/3 的4 ℃飽和硫酸銨，進行第2 次鹽析，靜置4 h，3 000×g離心20 min，取沉淀溶于適量PBS，置于10 kDa 透析袋中，透析脫鹽20 h，期間換水6～7 次，冷凍干燥，得IgY 成品。

1.3.3 IgY 提取的正交試驗設計

根據IgY 提取的單因素試驗結果，選取稀釋倍數、pH 值、離心時間、硫酸銨濃度4 個因素，以IgY 含量為判斷標準，進行正交試驗設計，正交因素與水平見表1。

表1 正交因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3.4 PV 提取的單因素設計

將脂蛋白在常溫下風干2 h，準確稱取5 份，每份3 g。加入不同體積比（1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4）的混合有機溶劑（95%乙醇∶正己烷）。溶劑使用量為脂蛋白的不同倍數（2、4、6、8、10 倍），磁力攪拌30 min，靜置8 h，3 000×g離心20 min，取下層膠狀物，烘干，用玻璃棒碾碎，溶于不同濃度（1.65、1.70、1.75、1.80、1.85 mol/L）氯化鈉溶液中。氯化鈉溶液使用量設計為5、10、15、20、25 mL，混合均勻，靜置6 h，3 000×g離心20 min，取上清液于不同溫度（50、60、70、80、90 ℃）的水浴鍋中加熱30 min，過濾，收集濾液，置于8～10 kDa透析袋中透析脫鹽20 h，冷凍干燥后即為PV 成品。

1.3.5 PV 提取的響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，采用Design-Expert 10.0.8軟件，進行Box-Behnken 三因素三水平響應面設計，以混合有機溶劑體積比、溶劑使用量、氯化鈉濃度為自變量，以提取的PV 含量為響應值進行優化。其響應面試驗設計的因素和水平見表2。

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 Response surface test factors and levels

1.3.6 蛋黃油和卵磷脂提取

上層油狀物是溶解在混合有機溶劑中的蛋黃油、卵磷脂等，提取蛋黃油、卵磷脂首先要去除混合有機溶劑。在45 ℃、50 r/min 的條件下，對上層油狀物旋轉蒸發，以去除有機溶劑，所得產物加入丙酮溶解，靜置5 h，3 000×g離心20 min。取上層液體進行旋轉蒸發，直至無液體蒸餾出，得到蛋黃油。下層沉淀用適量無水乙醇溶解，加入丙酮反復碾洗，至丙酮顏色澄清透明，取沉淀，用蒸餾水清洗干凈，真空干燥，得淡黃色膠條狀卵磷脂（PL）。

1.3.7 指標測定

總蛋白質含量的測定：采用考馬斯亮藍法測定總蛋白質含量[22]。

IgY 含量的測定：使用紫外可見分光光度計分別測定提取液在260 nm 和280 nm 處的吸光值，并以生理鹽水作為對照，根據下列公式來計算IgY 含量[23]。

Q=1.50A280-0.75A260

式中：Q為IgY 含量，mg/mL；A280和A260為IgY 在280 nm 和260 nm 處的吸光值。

PV 含量的測定：磷的含量用微量定磷法來檢測，由于卵黃高磷蛋白含有約10%的磷，所以有機磷含量的10 倍就是卵黃高磷蛋白的含量[24]，計算公式如下。

M=10M1

式中：M為PV 含量，mg/mL；M1為有機磷含量，mg/mL。

PV 回收率的計算公式如下。

R=M1/M2×100

式中：R為PV 回收率，%；M1為PV 含量，mg/mL；M2為回收物中總蛋白質的含量，mg/mL。

IgY 活性的測定：采用酶聯免疫試劑盒進行測定。

1.4 數據統計及分析

使用IBM SPSS Statistics 軟件對IgY 提取正交試驗進行數據統計分析。使用Design-Expert 10.0.8 軟件對PV 提取響應面試驗進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 IgY 提取試驗結果分析

2.1.1 稀釋倍數對IgY 含量的影響

稀釋倍數對IgY 含量的影響見圖2。

圖2 稀釋倍數對IgY 含量的影響Fig.2 Effect of dilution fold on IgY content

由圖2 看出，隨著稀釋倍數的增加，IgY 含量呈上升趨勢，在稀釋6 倍后，上升趨勢趨于平緩。根據上清液顏色變化發現稀釋4 倍時，上清液顏色渾濁；6 倍時上清液有輕微的淡黃色，稀釋8、10 倍后上清液為澄清透明。上清液顏色變化與圖2 結合可推斷稀釋4 倍時，脂蛋白未完全分離，IgY 含量在20 mg/mL 左右。稀釋6、8 倍IgY 含量均在28 mg/mL 左右，6 倍為一個轉折點。結合實際生產的成本和蛋白質含量，綜合考慮稀釋倍數選4、6、8 倍較為合適。

2.1.2 pH 值對IgY 含量的影響

pH 值對IgY 含量的影響見圖3。

圖3 pH 值變化對IgY 含量的影響Fig.3 Effect of pH change on IgY content

由圖3 可知，IgY 含量隨pH 值的增加呈先升高后降低的趨勢。在pH5.0 時IgY 含量為最高值，此時的上清液透明，說明脂蛋白和水溶性蛋白已經分離完全。卵黃免疫球蛋白在pH4～11 時蛋白活性保持穩定，因此，pH 值選擇4.5、5.0、5.5 較為合適。

2.1.3 離心時間對IgY 含量的影響

離心時間對IgY 含量的影響見圖4。

圖4 離心時間對IgY 含量的影響Fig.4 Effect of centrifugation time on IgY content

由圖4 得出，IgY 含量隨離心時間的延長而增加，在離心時間為35 min 后IgY 含量上升緩慢，說明此時溶液中的蛋白均已形成沉淀。從實際生產角度出發，離心時間的延長必然會導致生產成本和機器損耗加大。因此，離心時間選擇25、35、45 min 較為合適。

2.1.4 硫酸銨濃度對IgY 含量的影響

硫酸銨濃度對IgY 含量的影響結果見圖5。

圖5 硫酸銨濃度對IgY 含量的影響Fig.5 Effect of ammonium sulfate concentration on IgY content

由圖5 可知，隨著硫酸銨濃度的增加，IgY 含量整體呈現上升趨勢，硫酸銨濃度為60%時，IgY 含量最高，隨后含量下降。高濃度的鹽離子在蛋白質溶液中會與蛋白質競爭水分子，使蛋白質從溶液中沉淀出來，但是過高的鹽濃度會增加后期的脫鹽工作量，也會導致脫鹽不徹底，降低IgY 蛋白含量和純度。因此硫酸銨濃度選擇50%、60%、70%較為合適。

2.1.5 IgY 提取的正交試驗結果分析

IgY 提取的正交試驗結果見表3。

表3 IgY 提取的正交試驗結果Table 3 Orthogonal experimental results of IgY extraction

由表3 可知，各因素對IgY 含量影響順序為稀釋倍數＞硫酸銨濃度＞pH 值＞離心時間。IgY 含量最高的正交試驗組為第8 組，5 g 蛋黃液可提取出33.37 mg卵黃免疫球蛋白。直觀分析最優組合為A3B2C1D3，然而均值的最優組合為A3B2C2D3。其差別在于離心時間的選擇，考慮到實際生活中大規模的生產和成本，離心時間的選擇越小越好，故最優組合為A3B2C1D3。

對最優組合進行驗證試驗，其平均值為33.22mg/mL。與試驗結果33.37 mg/mL 非常接近，試驗重復性很高。

IgY 提取方差分析結果見表4。

表4 IgY 提取方差分析Table 4 Analysis of variance of IgY extraction

由表4 可知，各因素對結果的影響大小為稀釋倍數＞硫酸銨濃度＞pH 值＞離心時間，與直觀分析結果一致。其中稀釋倍數、硫酸銨濃度、pH 值對結果影響極顯著（P＜0.01），離心時間對IgY 含量影響不顯著（P＞0.05）。進一步說明試驗穩定性良好。

2.2 PV 提取試驗結果

2.2.1 不同混合有機溶劑體積比對PV 含量的影響

不同混合有機溶劑體積比對PV 含量的影響見圖6。

圖6 混合有機溶劑體積比對PV 含量的影響Fig.6 Effect of volume ratio of mixed organic solvent on PV content

由圖6 可知，卵黃高磷蛋白的含量隨著混合有機溶劑中正己烷的增加先升高后降低。正己烷的存在能夠加強脂類和蛋白質的分離效果，隨著正己烷的增加，在收集卵黃高磷蛋白時，附著在燒杯壁上的蛋白也隨之增加，收集不徹底可能是導致蛋白含量降低的原因。如用混合有機溶劑收集附著在燒杯壁上的蛋白會造成溶劑使用量的變化，影響結果。從生產成本和蛋白含量的角度出發，選用混合有機溶劑體積比為1∶0、1∶1、1∶2 較為合適。

2.2.2 不同溶劑使用量對PV 含量的影響

不同溶劑使用量對PV 含量的影響見圖7。

圖7 溶劑使用量對PV 含量的影響Fig.7 Effect of solvent usage on PV content

由圖7 可知，PV 含量隨有機溶劑使用量的增加而增加，在使用量為6 倍混合有機溶劑時蛋白含量沒有大的變化，說明此時有機溶劑的作用已可以做到蛋白質和脂類分離效果的最大化。此后溶劑使用量的增加不會增加生產效益，還會使生產成本加大，環境污染加大。綜合考慮選用6 倍溶劑使用量進行后續試驗。

2.2.3 不同氯化鈉濃度對PV 含量的影響

不同氯化鈉濃度對PV 含量的影響見圖8。

圖8 氯化鈉濃度對PV 含量的影響Fig.8 Effect of NaCl concentration on PV content

由圖8 可知，卵黃高磷蛋白在一定濃度的NaCl 溶液中有較好的溶解性，卵黃高磷蛋白在1.65～1.85 mol/L NaCl 溶液中蛋白溶解性先增加后下降，1.75 mol/L 的NaCl 溶液中溶解性最好，提取蛋白含量最高。實際生產中NaCl 濃度增加會加大成本。綜合考慮，NaCl 溶液濃度選擇1.70、1.75、1.80 mol/L 較為合適。

2.2.4 不同氯化鈉用量對PV 含量的影響

不同氯化鈉用量對PV 含量的影響見圖9。

圖9 氯化鈉用量對PV 含量的影響Fig.9 Effect of sodium chloride dosage on PV content

由圖9 可知，NaCl 溶液作為卵黃高磷蛋白的溶解劑對結果而言是比較穩定的，PV 含量在NaCl 用量15 mL 和25 mL 處有較高值，隨著用量的增加對結果的影響幅度在0.2 mg 以內。用量的增加必然會加大后續的脫鹽流程的工作量，從成本和蛋白含量兩方面考慮，選用15 mL 作為NaCl 的用量。

2.2.5 不同溫度對PV 含量的影響不同溫度對PV 含量的影響見圖10。

圖10 溫度對PV 含量的影響Fig.10 Effect of temperature on PV content

由圖10 可知，隨著溫度的升高，卵黃高磷蛋白的含量也會隨之增加，在50～90 ℃范圍內，蛋白含量增幅在0.5 mg 以內。卵黃高磷蛋白具有較好的熱穩定性，溫度的升高會使其它的蛋白變性從而沉淀下來，起到一定的純化效果。從純度和含量等方面考慮，以90 ℃作為溫度最佳選擇。

2.2.6 PV 響應面試驗結果分析

對PV 提取的工藝以單因素試驗確定的水平因素，結合卵黃高磷蛋白含量，根據表2 進行響應面提取優化，結果如表5、表6所示。

表5 響應面設計試驗結果Table 5 Experimental results of response surface design

表6 模型方差分析Table 6 Analysis of variance

PV 含量的二次回歸擬合方程：PV 含量/（mg/mL）=33.35+0.747 5A+0.581 3B-0.316 3C+0.305 0AB+0.425 0AC-0.647 5BC-4.95A2-1.91B2-3.54C2。

通過表6 的模型方差分析可以得出，A、B對PV含量顯著影響（P＜0.05），A2、B2、C2均為極顯著（P＜0.01），C影響不顯著（P＞0.05），且各因素之間的交互作用不顯著，并且對響應值卵黃高磷蛋白含量的影響順序為A＞B＞C。

根據回歸方程得出各因素之間交互作用對PV 含量影響的響應面和等高線，見圖11。

圖11 各因素交互作用的響應面與等高線Fig.11 Response surface and contour map of interaction of various factors

根據二次回歸方程得到響應面圖均為凸起開口向下的曲面，表示PV 含量存在最大值，響應曲面的坡度越陡說明變化越快，對試驗結果影響越顯著；等高線呈橢圓形、越密集，交互作用越強，等高線呈圓形、越稀疏則相反。

由圖11 可知，A、B、C三者間的兩兩交互作用對PV 含量影響不顯著，該結論與方差分析結果一致。

2.2.7 結果驗證

根據回歸模型，利用Box-Behnken 對試驗結果進行分析處理，得到提取卵黃高磷蛋白的最佳條件為混合有機溶劑體積比為1∶1.078、有機溶劑使用量為6.34 倍、氯化鈉濃度為1.747 mol/L，測得卵黃高磷蛋白含量為33.437 mg/mL。

為檢驗響應面優化結果的可靠性，綜合考慮實際操作的局限性，取混合有機溶劑體積比為1∶1.08、有機溶劑使用量為6.35 倍、氯化鈉濃度為1.75 mol/L。在此最優條件下進行5 次驗證試驗，卵黃高磷蛋白含量為33.30 mg/mL，與理論值比較，相對誤差較小，重復性好，因此該優化提取工藝參數模型準確可靠。此方法為取3 g 沉淀物（脂蛋白），而5 g 蛋黃液可得到4.5 g沉淀物（脂蛋白），5 g 蛋黃液可得到49.95 mg PV，即1 g蛋黃液可得9.99 mgPV。

2.3 蛋黃油和卵磷脂分離結果分析

上層液體旋轉蒸發后得蛋黃油，下層沉淀經丙酮純化、真空干燥后得卵磷脂，實測值與理論值見表7。

表7 試驗實測值與理論值比較Table 7 Comparison between measured value and theoretical value

從表7 看出，蛋黃油提取含量偏低，其原因為采用溶劑萃取法提取蛋黃油，參考文獻[25]出油率僅60%左右，此方法提取率偏低。提取過程中多次離心分離，也可能導致脂類附著于離心管上，造成含量偏低。

卵磷脂提取量與理論值相接近，提取產品顏色為淡黃色。高純度的卵磷脂顏色為淡黃乳白色，這說明本方法提取的卵磷脂純度較高。

3 結論

本文探索了以雞蛋黃為原料，制備卵黃免疫球蛋白、卵黃高磷蛋白、蛋黃油、蛋黃卵磷脂的工藝流程。新鮮蛋黃預處理后的蛋黃液在一定條件下應用不同的提取方法，通過單因素試驗選取因素、以正交試驗或響應面試驗對工藝進行優化，結果表明，正交試驗優化IgY 提取的最優工藝條件為5 g 蛋黃稀釋8 倍、調pH 值到5.0、離心時間為35 min、硫酸銨濃度為70%；響應面優化PV 提取的最佳提取工藝條件為混合有機溶劑體積比（95%乙醇∶正己烷）1∶1.08、有機溶劑使用量為6.35 倍、氯化鈉濃度為1.75 mol/L。在此條件下5 g 蛋黃可得33.30 mg IgY、49.95 mg PV、0.97 g 蛋黃油、0.53 g PL，換算得1 g 蛋黃得6.66 mg IgY、9.99 mg PV、194 mg 蛋黃油、106 mg PL。該方法成本低、無污染、便捷、高效，可為功能食品提供功能基料，極大提高雞蛋附加值，保障蛋雞業健康可持續發展。