脫脂榛子粉標準樣品的制備及其過敏原檢測方法驗證

孫秀艷，洪麟，楊莉莉，石雨婷，徐大軍，陳穎，曹際娟*

（1.大連民族大學，遼寧 大連 116600；2.大連市檢驗檢測認證技術服務中心，遼寧 大連 116021；3.中國標準化協會，北京 100048；4.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 102206）

榛子（Corylusavellana）屬于樺木科植物，榛子仁是一種十分常見的食物過敏原[1-2]。榛子仁中蛋白質含量達到7%～13%，其中多種蛋白質是已知的過敏原[3-4]，例如Cor a 9 和Cor a 11。這些蛋白大多具有高耐熱性，在不同的生產工藝中比較穩定[5-6]。對于榛子過敏人群，攝入食物中隱藏的榛子過敏原會引發嚴重后果[7]。極少量的榛子即可引發過敏反應，嚴重的會導致過敏性休克[8-9]。因此，榛子過敏者必須避免食用榛子或含有榛子的食物。然而，僅僅通過查看食品標簽并不能完全規避含有榛子的食品，例如在生產過程中常發生的交叉污染情況。因此，在許多情況下均不能排除食物中榛子殘留物的存在[10]。

食物過敏已成為重要的食品安全問題，評價和檢測食品過敏原逐漸受到重視[11]。目前，在國內外還沒有研制榛子過敏原檢測相關的標準樣品。現階段，最常用的過敏原檢測方法主要有基于過敏蛋白檢測的酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法及基于過敏原物種源性成分基因檢測的實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-timepolymerase chain reaction，qPCR）法[12-13]。上述兩種方法采用的原理不同，無法直接進行測定值、靈敏度的比較，也鮮見二者檢測結果相關性的研究，導致在檢測方法選擇方面缺乏有價值的參考。食品監管部門、食品檢測機構、食品生產企業等在食品過敏原安全控制工作中，始終存在著對方法選擇的困惑[14]。

標準樣品是一種重要的參考物質，經常用于儀器校準和測量結果的量值溯源、測量方法評價、給其他材料賦值以及實驗室的質量控制和能力驗證等技術活動[15-16]，其定義是一種或多種已確定特性值、足夠均勻且穩定的材料，已被確定其符合測量過程的預期用途[17]。標準樣品的特性可以是定量或定性的，均勻性、穩定性、準確性、溯源性是標準樣品的基本屬性[18]，在基于不同原理的檢測方法性能指標驗證方面，標準樣品發揮著不可替代的作用。然而，目前缺乏用于食品過敏原檢測的堅果類標準樣品。

本研究以榛子仁作為原料，經粉碎、正己烷脫脂處理、過篩獲得細粉，并進行脫脂工藝處理前后的比較，在開展均勻性、穩定性及定值評估基礎上，制備了大批量的脫脂榛子粉標準樣品，并用于食品過敏原檢測的qPCR 和ELISA 方法檢出限的驗證及比較，為基于不同原理的分析方法檢出限的驗證提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榛子（顆粒均勻、無雜質，果粒經逐個挑選并感官鑒定均為榛子）：市售。

寶生物病毒核酸提取試劑盒Ver.5.0、探針法qPCR 試劑：大連TaKaRa 公司；榛子（0～40 mg/kg）ELISA試劑盒：青島普瑞邦公司；正己烷：西隴科學股份有限公司。試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ABI QuantStudio 7 定量PCR 儀：美國賽默飛世爾科技公司；ZHJH-C112B 超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；Synergy H1 酶標儀：美國伯騰儀器有限公司；34BL99 高速組織搗碎機、7011S 商用攪拌機：美國皇庭公司；BWS-10 恒溫水浴鍋、BPZ-6063LCB 真空干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；SYH-15 三維運動混合機：常州市恒邁干燥設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂榛子粉標準樣品的制備

榛子去殼清洗干凈，擦干榛子仁表面的水分，使用干凈的搗碎機打磨成粉。稱取約1 kg 榛子粉，以每批50 g 為單位，分批進行脫脂處理[19]，使用三維運動混合機充分混勻。具體脫脂操作流程：取50 g 榛子粉置于錐形瓶中，按照1∶6（g/mL）的料液比加入正己烷，充分混合，封口后將錐形瓶放置在45 ℃的水浴鍋中浸提20 min[20]。用一次性塑料滴管吸除上方的混合油，反復浸提3 次。將脫脂后的榛子粉放置在真空干燥箱中脫除溶劑，過50 目篩，得到干燥、松散狀的脫脂榛子粉。制備好的脫脂榛子粉樣品分裝在西林瓶中，每瓶2 g，加硅膠蓋、鋁箔蓋密封，分裝約500 瓶，于0～4 ℃條件保存。以未經脫脂處理的榛子粉樣品為對照，用于比較正己烷脫脂處理對榛子特性值的影響。

1.3.2 定性測定

采用SN/T 1961.8—2013《出口食品過敏原成分檢測第8 部分：實時熒光PCR 方法檢測榛果成分》[21]中的方法測定原料的榛子源性成分，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）方法檢測榛子蛋白，其中榛子蛋白的檢測按照試劑盒說明書進行。

1.3.3 均勻性檢驗

均勻性是指標準樣品特性值在空間分布的均勻程度，是標準樣品的重要指標之一[22]。均勻性檢驗按照GB/T 15000.3—2008《標準樣品工作導則（3）標準樣品定值的一般原則和統計方法》[23]中的方法進行，從所制備的500 瓶獨立包裝的標準樣品中隨機抽取15 瓶用于均勻性檢驗（m=15，n=2）。采用qPCR 測定榛子Oleosin基因的閾值循環數（threshold cycle，Ct）值，采用ELISA 法測定榛子過敏蛋白含量值，均用于評估均勻性。

1.3.4 穩定性檢驗

1.3.4.1 長期穩定性檢驗

在適宜的環境條件下，標準樣品特性值不會隨著貯存時間的延長發生顯著變化[24]。為確定標準樣品的有效期，需要考察標準樣品的長期穩定性[25]。長期穩定性檢驗按照GB/T 15000.3—2008《標準樣品工作導則（3）標準樣品定值的一般原則和統計方法》[23]中的方法，從長時間保存于-20 ℃低溫條件的標準樣品中隨機抽取樣品，按照第一年每2 個月、第二年每3 個月的時間間隔點，在每個時間點、每次隨機抽取2 瓶樣品（m=2，n=2）用于長期穩定性的評估。采用qPCR 法測定榛子Oleosin基因Ct 值，采用ELISA 法測定榛子蛋白含量值，均用于檢驗長期穩定性。采用直線經驗模型分析評價，當測定值的|b1|＜t(0.95，n-2)×s（b1），表明穩定性良好。式中：|b1|為均值斜率的絕對值；t(0.95，n-2)為t檢驗雙邊臨界值；s（b1）為與斜率相關的不確定度。

1.3.4.2 短期穩定性檢驗

采用同步設計方法在-20～50 ℃條件下進行運輸條件下短期穩定性檢驗（選擇-20 ℃7 d、0～4 ℃7 d 和14 d、25 ℃7 d、50 ℃7 d），每個溫度條件下測試3 瓶標準樣品（m=3），每瓶重復測試2 次（n=2），采用線性回歸方差分析評價短期穩定性。

1.3.5 定值測定

按照ISO Guide 35：2017 的典型標準樣品定值模式[26]，鑒于本標準樣品是由精選純榛子仁制備，且制備過程中已采取措施，為防止特性值成分的變化和其他成分的帶入，因此本研究選擇單一實驗室采用不同原理、獨立程序的3 種定值方法：基于基因測序鑒定榛子基因序列[27]、qPCR 方法鑒定榛子特異性Oleosin基因[28]、ELISA 方法測定榛子蛋白[29]。采用簡單隨機抽樣法，從本批標準樣品中抽取9 個單元，每種方法測定3 個單元的標準樣品（m=3），每個單元進行2 次重復檢測（n=2）。以基因測序鑒定榛子基因序列為標準值，其他2 種方法進行特性值核對。

1.3.6 qPCR 和ELISA 方法檢出限的驗證

方法的檢出限（limit of detection，LOD6）是通過試驗確定的[30-31]。取脫脂榛子粉標準樣品，按照不同的質量比添加到小麥粉中制成5 個系列的不同質量含量（5.0%、3.0%、1.0%、0.5%、0.1%）樣品。具體制備流程（以5.0%脫脂榛子粉樣品制備為例）：稱取20 g 脫脂榛子粉標準樣品，加入至380 g 小麥粉中，放置于三維運動混合機中充分混勻，時間不短于20 h；然后將混合粉再經過50 目篩篩分，反復10 次過篩，使混合粉全部通過50 目篩，確保樣品均勻；分裝在西林瓶中，每瓶2 g，每個質量含量樣品分裝約200 瓶。其中，以0.1%榛子粉樣品的待測液（如DNA 提取液或榛子蛋白待測液）進一步進行梯度稀釋（0.01%、0.001%、0.000 1%、0.000 01%、0.000 001%、0.000 000 1%）。隨機抽取上述所制備的0.000 000 1%～5.0%不同質量含量系列榛子粉樣品，用于驗證和比較qPCR 和ELISA 方法的LOD6。每個含量點進行6 個重復分析（m=6），每個重復分析進行2 次運行（n=2）。最低濃度水平的所有12 個重復結果均顯示陽性，可被視為LOD6。以線性曲線的相關系數R2來衡量反應線性度，R2應不低于0.98[32]。

1.4 數據處理

樣品的均勻性采用單因素方差分析（F檢驗）進行統計分析，通過單因素方差分析（Tukey's 檢驗）統計p值，使用OriginPro 2022 軟件進行數據分析計算，使用Medcalc Portable Launcher 進行概率回歸分析，通過graphpad prism 8.4.0 軟件繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 正己烷脫脂處理對榛子特性值的影響

榛子源性成分（如Oleosin基因、2S 球蛋白基因等）和榛子蛋白是用于食品過敏原檢測的脫脂榛子粉標準樣品的特性指標。脫脂處理前后的榛子粉中Oleosin基因Ct 值和榛子蛋白的比較如圖1所示。

圖1 脫脂處理前后的榛子粉中Oleosin 基因Ct 值和榛子蛋白含量Fig.1 Ct values of Oleosin gene and hazelnut protein content in hazelnut powder before and after degreasing

由圖1A 可知，脫脂處理前，榛子粉樣品Oleosin基因Ct 值為26.22±0.47，脫脂處理后的Ct 值為25.80±0.31，經Tukey's 檢驗，統計量p=0.009。由圖1B 可知，脫脂處理前，榛子蛋白含量為（5.09±0.01）×105mg/kg，脫脂處理后則為（5.34±0.01）×105mg/kg，統計量p＜0.000 01。結果表明，脫脂處理沒有對榛子源性成分的特性基因及榛子蛋白造成損失和破壞，樣品單位質量內的特性含量有所增加且差異極其顯著（p＜0.01）。

2.2 均勻性評估

采用單因素方差分析法評估均勻性，結果如表1。

表1 脫脂榛子粉標準樣品均勻性的方差分析Table 1 Analysis of variance for homogeneity of standard samples of nonfat hazelnut powder

由表1 可知，在剔除個別離群值后，qPCR 法測定Oleosin基因Ct 值的總平均值為25.14±0.83，ELISA 法測定榛子蛋白含量總平均值為（5.32±0.03）×105mg/kg。經F檢驗，在95%置信概率下，兩種方法測定值計算得到的F比分別為2.17 和2.10，均小于F臨界值[F0.05(14，15)=2.42]，表明標準樣品的特性值在瓶間和瓶內不存在明顯差異，均勻性良好。

圖2、圖3 分別為基于qPCR、ELISA 測定的脫脂榛子粉標準樣品均勻性差異分析結果。

圖2 基于qPCR 測定的脫脂榛子粉標準樣品均勻性差異分析Fig.2 Uniformity difference analysis of reference material of nonfat hazelnut powder determined by qPCR

由圖2、圖3 可知，統計量p值分別為0.07 和0.08（p＞0.05），表明樣品群組間標準樣品的特性值無顯著差異。

2.3 穩定性評價

2.3.1 長期穩定性

在95%置信概率下，經直線經驗模型統計檢驗，長期穩定性檢驗結果見表2、圖4、圖5。

表2 脫脂榛子粉標準樣品長期穩定性的直線模型分析Table 2 The linear model analysis of long-term stability of reference material of defatted hazelnut powder

圖4 基于qPCR 測定的長期穩定性的直線模型分析比較Fig.4 Analysis and comparison of long-term stability by linear model based on qPCR determination

圖5 基于ELISA 測定的長期穩定性的直線模型分析比較Fig.5 Analysis and comparison of long-term stability by linear model based on ELISA assays

由表2、圖4、圖5 可知，在剔除個別離群值后，脫脂榛子粉標準樣品中Oleosin基因的Ct 值總平均值為25.75±0.39，榛子蛋白含量總平均值為（5.31±0.05）×105mg/kg，兩者測定值的|b1|分別為0.011 67 和0.000 24，均小于t(0.95，n-2)×s（b1），表明該標準樣品在24個月內穩定性良好，標準樣品的特性值沒有發生明顯的趨勢性變化。群組間樣品中Oleosin基因Ct 值和榛子蛋白含量值的統計量p值分別為0.08 和0.054（p＞0.05），表明在24 個月的貯存期內，標準樣品的特性值穩定，且無顯著差異。

2.3.2 短期穩定性

短期穩定性分析結果如表3、圖6、圖7所示。

表3 短期穩定性線性回歸方差分析Table 3 The regression analysis of variance of short-term stability

圖7 基于ELISA 測定的運輸條件下短期穩定性的單因素方差分析評價Fig.7 One-way ANOVA evaluation of short-term stability under transport conditions based on ELISA assays

由表3、圖6、圖7 可知，歷經模擬運輸條件后，標準樣品中Oleosin基因Ct 值總平均值為25.65±0.25，榛子蛋白含量總平均值為（5.29±0.04）×105mg/kg。群組間統計量p值分別為0.14 和0.27（p＞0.05），表明在歷經模擬運輸條件下，標準樣品的特性值沒有發生顯著性變化，短期穩定性良好。

2.4 定值分析

經基因測序測定獲得的Oleosin基因序列如表4所示。

表4 基于3 種獨立程序的脫脂榛子粉標準樣品定值結果Table 4 Values of reference material of nonfat hazelnut powder based on three independent procedures

由表4 可知，Oleosin基因序列與Genbank 中登錄號為AY224599.1 的榛子Oleosin基因序列同源性為100%，可鑒定為榛子物種；采用實時熒光PCR 法檢測Oleosin基因的Ct 值為25.80±0.25，判定為榛子源性成分；ELISA 法測定的蛋白含量為（5.30±0.04）×105mg/kg，判定為含有榛子蛋白。上述2 種方法的測定值（m=3，n=2），經Shapiro-Wilk 檢驗符合正態分布，經Grubb's法檢驗結果無異常值。由于本標準樣品是由精選純榛子仁制備，且制備過程中已采取措施，為防止特性值成分的變化和其他成分的帶入，結合3 種方法的定值結果，可以表明本標準樣品為具有榛子源性成分和榛子蛋白特性的純榛子物質。

2.5 qPCR 和ELISA 檢出限的驗證

圖8 為基于qPCR 和ELISA 分析的線性標準曲線。

圖8 基于qPCR 和ELISA 分析的線性標準曲線Fig.8 Linear standard curve based on qPCR and ELISA analysis

由圖8A 可知，基于qPCR 法測定，對于0.1%含量以上的樣品可以呈現很好的線性標準曲線，線性擬合度R2=0.985 4（R2≥0.98），LOD6為0.1%。由圖8B 可知，基于ELISA 法，對于0.01%含量以上的樣品可以呈現很好的線性標準曲線，線性擬合度R2=0.994 5（R2≥0.98），LOD6為0.000 1%。

不同榛子質量含量的qPCR 和ELISA 方法檢出限結果見圖9。

圖9 不同榛子質量含量的qPCR 和ELISA 分析檢出限Fig.9 Detection limits of hazelnut by qPCR and ELISA analysis

由圖9 可知，ELISA 方法與qPCR 法相比，具有更好的檢測靈敏度，當在食品中含有0.000 1%的少量榛子殘留物時，采用ELISA 方法可以被靈敏檢出。

3 結論

本研究制備了用于食品過敏原檢測的脫脂榛子粉標準樣品，具有很好的均勻性和穩定性。使用該標準樣品用于方法檢出限的驗證和比較，發現ELISA 法的檢測靈敏度遠高于qPCR 法，更適合于對微量榛子殘留物的檢測。

本研究首次比較了正己烷脫脂處理對榛子特性值的影響，未經脫脂處理的榛子粉樣品Oleosin基因Ct 值為26.22±0.47，脫脂處理后的Ct 值為25.80±0.31，二者無明顯差異，說明正己烷脫脂處理對榛子源性成分及榛子蛋白沒有造成破壞，建立了穩定的脫脂榛子粉標準樣品制備工藝。脫脂后的榛子粉呈現松散細粉狀，更易于添加至其他食品基質中用作質控品。此外，經F檢驗，在95%置信概率下，2 種方法測定值計算得到的F比分別為2.17 和2.10，均小于F臨界值[F0.05(14，15)=2.42]，表現出良好的均勻性；在長期穩定性檢測中，2種方法測定值的|b1|分別為0.011 67 和0.000 24，均小于t(0.95，n-2)×s（b1），統計量p值分別為0.08 和0.054（p＞0.05）；短期穩定性檢測中，群組間統計量p值分別為0.14 和0.27（p＞0.05），表明在長期與短期貯存中，樣品具有良好的穩定性；基于3種不同原理的方法定值表明本標準樣品為具有榛子源性成分和榛子蛋白特性的純榛子物質，達到國家標準樣品的技術要求，符合測量過程的預期用途，滿足標準樣品的基本屬性，可用于申報國家有證標準樣品。經對qPCR 和ELISA 方法檢出限的驗證，可進一步用于多種方法開展對食品過敏原檢測的實驗室質量控制技術活動。該標準樣品為其他油脂含量高的食品基體標準樣品的研制提供了極有價值的參考，對于進一步闡釋榛子過敏機理，預防榛子過敏及保護消費者安全具有重要意義。