順序和同時接種乳酸菌對馬瑟蘭葡萄酒品質的影響

賈世寬，陳佳威，郜成軍，薛楚然，王頡*，劉亞瓊*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000；2.中國長城葡萄酒有限公司，河北 懷來 075400）

葡萄酒釀造主要包括兩個階段，即酒精發酵（alcoholic fermentation，AF）和蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF），是由釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、非釀酒酵母（non-Saccharomycescerevisiae）和乳酸菌（lactic acid bacteria）共同作用的結果[1]。在酒精發酵階段，釀酒酵母起到至關重要的作用，其將糖轉化為乙醇和CO2，并形成許多葡萄酒代謝物，包括高級醇和酯類，該階段對葡萄酒的口感和總體質量產生較大影響[2]。

傳統的釀酒工藝通常是在酒精發酵結束后，接種乳酸菌來誘導MLF，將L-蘋果酸轉化為L-乳酸和CO2，以此降低葡萄酒中蘋果酸的含量、提高微生物穩定性[3]。目前只有乳桿菌屬（Lactobacillus）、酒酒球菌屬（Oenococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）以及片球菌屬（Pediococcus）這4 種乳酸菌屬在釀酒環境中生存，其中酒酒球菌（Oenococcusoeni，O.oeni）已經被廣泛用作商業發酵劑啟動蘋果酸-乳酸發酵[4]。然而，酒精發酵結束后，低pH 值和高乙醇含量以及葡萄酒中營養物質的減少會明顯抑制乳酸菌的生長，從而延長蘋果酸-乳酸發酵時間[5]。為克服低pH 值和高乙醇含量對乳酸菌的抑制作用并縮短蘋果酸-乳酸發酵周期，有研究表明在葡萄汁中同時接種S.cerevisiae和O.oeni可誘導蘋果酸-乳酸發酵，且不會增加葡萄酒的揮發性酸[6]。

非釀酒酵母被認為是導致葡萄酒敗壞的微生物，會產生不良風味，影響葡萄酒的品質。但相關的研究表明，非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵可以提高葡萄酒的香氣復雜性和感官屬性[7]。目前畢赤酵母（Pichia fermentans）、戴爾有孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii）、有孢漢遜酵母（Hanseniasporauvarum）等已被用作商業釀酒發酵劑[8-10]。其中，戴爾有孢圓酵母在釀酒條件下具有高代謝活性以及對乙醇和SO2的抗性，是葡萄酒釀造中最常使用的非釀酒酵母[11-12]。有研究表明，戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母順序接種發酵可促進脂肪酸乙酯的合成，對葡萄酒生產具有協同作用[13]。

近年來，釀酒酵母與乳酸菌同時接種的研究日益增多，但與非釀酒酵母同時發酵會對葡萄酒的風味品質產生何種影響鮮有報道。本文以馬瑟蘭葡萄為原料，研究戴爾有孢圓酵母、釀酒酵母和乳酸菌在不同接種方式下混合發酵對馬瑟蘭葡萄酒基本理化指標以及揮發性香氣物質的影響，探索葡萄酒多菌種發酵的可行性和新模式，促進葡萄酒風味的改善。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬瑟蘭葡萄：2021年10月采自河北張家口中國長城葡萄酒（懷來）有限公司葡萄園，果實含糖量251.73 g/L（以葡萄糖計），含酸量5.33 g/L（以酒石酸計），pH3.49。

釀酒酵母（S.cerevisiae）XR：法國LAMOTHE ABIET 公司；非釀酒酵母（Torulasporadelbrueckii）NS-D：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌（O.oeni）OENO 1：寧夏諾盟生物科技有限公司。

3-辛醇（標準品）：美國Sigma 公司；果膠酶（食品級）：法國LAFFORT 公司；氯化鈉（分析純）、偏亞硫酸鉀（食品級）：國藥集團化學試劑有限公司；檸檬酸、磷酸（均為分析純）：天津市北辰方正試劑廠；有機酸混合標準品（蘋果酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸）：北京索萊寶生物科技有限公司；甲醇（色譜純）：北京迪科馬科技有限公司。

1.2 儀器與設備

7890B-5977A 氣相色譜質譜聯用儀：美國Agilent公司；57328-u 頂空固相微萃取纖維頭：美國Supelco公司；HP-INNOWAX 毛細管色譜柱（60 m×250 μm，0.25 μm）：美國Agilent 公司；Autosampler2707 高效液相色譜儀：美國Waters 公司；葡萄酒成分分析儀Wine Scan FT 120：丹麥FOSS 公司；T6 新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；NomaSense color P100 色差計：法國Nomacorc 有限公司；PHS-3E pH 計：濟南歐萊博技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵方法

挑選新鮮馬瑟蘭葡萄40 kg，除梗破碎后將果漿分別置于9 個5 L 的發酵罐內（每個處理3 罐，每罐4 L葡萄漿）；分別加入50 mg/L 果膠酶和100 mg/L 焦亞硫酸鉀，在4 ℃下冷浸漬48 h 后進入發酵階段。測定發酵液中的糖含量，當酒樣的殘糖小于4 g/L 時，酒精發酵結束，取樣保存于-20 ℃。蘋果酸-乳酸發酵階段測定酒樣中蘋果酸的含量，當蘋果酸含量小于0.5 g/L時，蘋果酸-乳酸發酵結束，取樣保存于-20 ℃。采用順序接種處理（sequential inoculation，SEQ）和同時接種處理（simultaneous inoculation，SIM）兩種處理方法，自然發酵為對照組（control，CK）。不同處理酒樣的酒精和蘋果酸-乳酸發酵階段試驗方法如表1所示。

表1 試驗設計方法Table 1 Test design method

1.3.2 理化指標測定方法

葡萄酒總糖、總酸和酒精度等基本理化指標利用葡萄酒成分分析儀測定，透射掃描波數5 012～926 cm-1；pH值采用pH 計法測定，取10 mL 離心（40 ℃，8 000 r/min，10 min）后的葡萄酒，用數字pH 計測定。

色澤測定方法：酒樣經離心（40 ℃，8 000 r/min，10 min）后過0.45 μm 水系濾膜，濾液加入1 cm 比色皿中，用色差計測定L*值、a*值和b*值，以蒸餾水為標準值，記為L0*值、a0*值、b0*值，參考Barreiro 等[14]的方法計算酒精發酵結束色差（ΔE*），計算公式如下。

ΔE*=[（L*-L0*）2+（a*-a0*）2+（b*-b0*）2]1/2

ΔE*與觀察感覺的關系[15]如表2所示，上述試驗每個樣品重復測定3 次。

表2 色差感官評價Table 2 Color different sensory evaluation

1.3.3 揮發性化合物測定方法

揮發性化合物的測定參照夏亞男等[16]方法，并稍作修改。頂空固相微萃取：樣品解凍后，吸取7.5 mL 葡萄酒，加入20 mL 頂空瓶中，同時加入10 μL 的3-辛醇（300 mg/L）和1 g NaCl，40 ℃水浴預平衡15 min 后，插入萃取頭吸附40 min，于氣相色譜儀進樣口解吸6 min。

色譜分析條件：柱溫箱的升溫程序為50 ℃保持2 min，然后以3 ℃/min 的速率升至80 ℃，再以5 ℃/min速率升至230 ℃，持續6 min。采用不分流進樣，進樣口溫度為240 ℃，載氣He，流量為1 mL/min。質譜條件：電子轟擊電離源，電子能量70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃。溶劑延遲時間8 min，總離子流掃描范圍35～550 m/z。

定性定量分析：采用保留指數和質譜掃描圖譜與NIST14.L 譜庫進行比對定性，對匹配度80%以上的組分進行篩選，確認香氣物質的各個化學成分。各成分的含量采用內標法進行半定量，選用3-辛醇作為內標物質。

1.3.4 有機酸測含量測定方法

參照GB 5009.157—2016《食品安全國家標準食品中有機酸的測定》測定[17]，并稍作修改。色譜柱：C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A 為純甲醇，B 為0.1%磷酸溶液；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；檢測器波長：220 nm；柱溫：40 ℃；梯度洗脫程序：0～4 min，90%～90%B；4～5 min，90%～40%B；5～7 min，40%～10%B；7～9 min，10%～10%B；9～10 min，10%～90%B。

1.3.5 感官評價方法

感官評價小組成員由葡萄酒生產企業具有品酒師資質的人員和研發人員共11 人組成（女性7 人，男性4 人，年齡29～65 歲，平均40 歲），分別從酒樣的外觀（顏色、澄清度）、口感（酸度、甜度）、香氣（濃郁度、典型性、氧化味）和總體評分4 個方面對各葡萄酒樣品進行感官評價，評分范圍從0（弱）～10（最大強度），感官評價結果為所有評估小組成員得分的平均值。

1.4 試驗結果統計分析方法

試驗結果以平均值±標準差形式表示，采用SPSS 26 軟件進行方差分析和Duncan 多重比較，顯著性水平P＜0.05；使用Origin 2021 軟件繪圖，SIMCA 14.0 軟件進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 不同試驗處理對馬瑟蘭葡萄酒主要理化指標的影響

不同試驗處理對馬瑟蘭葡萄酒主要理化指標的影響如表3所示。

表3 不同試驗處理對馬瑟蘭葡萄酒主要理化指標的影響Table 3 Effects of different experimental treatments on main physical and chemical indexes of Marselan red wine

由表3 可知，SEQ、SIM 和CK 3 個處理組的酒精發酵均在12 d 時結束，蘋果酸-乳酸發酵時間分別為38、34 d 和45 d，所有處理組蘋果酸-乳酸發酵結束后總糖含量均小于4 g/L，酒精度在13.71%vol ～13.79%vol。

從表3 還可看出，SEQ 組和CK 組的總糖含量顯著高于SIM（P＜0.05）；不同試驗處理對馬瑟蘭葡萄酒酒精度的影響差異不顯著；CK 組的總酸含量顯著高于SEQ 和SIM 處理（P＜0.05），這與之前的報道一致，自發MLF 的葡萄酒總酸含量較高[18]。有研究表明，酒酒球菌與釀酒酵母同時接種可有效縮短蛇龍珠葡萄酒發酵周期，在共發酵過程中的發酵環境更有利于酒酒球菌生長[19]。

不同試驗處理對馬瑟蘭葡萄酒顏色變化的影響如表4所示。

表4 不同試驗處理對馬瑟蘭葡萄酒色差的影響Table 4 Effects of different experimental treatments on the color change of Marselan red wine

從表4 可見，葡萄汁和SEQ、SIM 和CK 處理馬瑟蘭葡萄酒之間的色差分別為50.00、58.43 和49.62，色差均超過12，為不同顏色；CK 和SEQ 處理馬瑟蘭葡萄酒的色差為3.49，顏色差異明顯；CK 與SIM 處理馬瑟蘭葡萄酒的色差為9.97，顏色差異明顯；SEQ 和SIM 處理馬瑟蘭葡萄酒的色差為8.5，顏色差異明顯。不同接種方式下發酵的葡萄酒的色差差異明顯，代表不同的顏色。

2.2 不同試驗處理對馬瑟蘭葡萄酒有機酸含量的影響

不同試驗處理對馬瑟蘭葡萄酒有機酸含量的影響如表5所示。

表5 不同試驗處理對馬瑟蘭葡萄酒有機酸含量的影響Table 5 Effect of different experimental treatment on organic acid content of Marselan red wine g/L

由表5 可知，酒精發酵結束和蘋果酸-乳酸發酵結束時，不同處理對馬瑟蘭葡萄酒有機酸含量的影響差異極顯著（P＜0.01）。馬瑟蘭葡萄汁中主要有機酸含量從高到低依次為蘋果酸、酒石酸、琥珀酸和檸檬酸。葡萄漿果中含有大量的酒石酸，是葡萄酒酸味的主要來源之一[20]。酒精發酵結束后，葡萄酒中除乳酸外，各處理的酒石酸和蘋果酸含量均低于葡萄汁，這可能與戴爾有孢圓酵母具有較強的降解蘋果酸和酒石酸能力有關[21]。SIM 的檸檬酸和琥珀酸含量均顯著高于SEQ和CK 處理（P＜0.05），琥珀酸作為蘋果酸-乳酸酶的抑制劑，會對MLF 有負面影響[22]。在酒精結束后，僅在SIM 處理組檢測到乳酸的生成。

蘋果酸-乳酸發酵結束后不同處理組蘋果酸含量均小于0.5 g/L，其中SIM 處理蘋果酸含量顯著低于其它處理（P＜0.05），降酸效果較好，乳酸含量顯著高于其它處理組（P＜0.05），有助于調整葡萄酒的整體酸度。乳酸與蘋果酸和酒石酸相比閾值更高，口感比蘋果酸更柔和，會對葡萄酒口感產生積極影響[23]。CK 處理組酒石酸和檸檬酸含量均顯著高于SEQ 和SIM 處理（P＜0.05），琥珀酸和乳酸則顯著低于SEQ 和SIM 處理（P＜0.05）。葡萄酒發酵過程中O.oeni直接參與三羧酸（tricarboxylic acid cycle，TCA）循環，用來消耗檸檬酸從而產生乙酸、乳酸和雙乙酰物質，雙乙酰是產生獨特的黃油風味的化合物，這是MLF 期間葡萄酒中最明顯的風味變化之一[24]。發酵結束后，SEQ 和SIM 處理組具有較高的琥珀酸含量，有研究表明，一些乳酸菌可以消耗蘋果酸、檸檬酸和酒石酸并將其代謝為琥珀酸[25]。

2.3 不同試驗處理對馬瑟蘭葡萄酒中揮發性物質的影響

不同試驗處理對馬瑟蘭葡萄酒揮發性成分香氣含量的影響如表6所示。

表6 不同試驗處理對馬瑟蘭葡萄酒揮發性香氣成分含量的影響Table 6 Effect of different experimental treatment on the content of volatile aroma components in Marselan red wine

由表6 可知，酒精和蘋果酸-乳酸發酵結束時酒樣中共檢測出30 種揮發性香氣化合物，包括14 種酯、11 種醇、3 種脂肪酸和2 種其他化合物。SIM 揮發性成分含量顯著高于其它處理（P＜0.05），為8 871.25 μg/L，SEQ 處理和CK 揮發性成分含量分別為8 741.28 μg/L和8 714.82 μg/L。

2.3.1 不同試驗處理對酯類物質的影響

酯類在葡萄酒的香氣復雜性中起主要作用，對葡萄酒中水果香氣特征具有積極貢獻[26]。酒精發酵結束時，SIM 處理的酯類含量（4 637.29 μg/L）顯著高于SEQ處理和CK（P＜0.05），這與Capozzi 等[27]研究結果一致，在酒精發酵初期同時接種乳酸菌可以增加酯類含量，從而增強果香。與酒精發酵結束相比，蘋果酸-乳酸發酵結束后不同處理葡萄酒的酯類含量均有所降低。SIM 處理的癸酸乙酯（椰子果香）、己酸乙酯（青蘋果、花香）和9-癸烯酸乙酯含量顯著高于CK 和SEQ 處理（P＜0.05），具有較強的產脂肪酸乙酯能力。

蘋果酸-乳酸發酵結束時，SIM 處理酯類含量顯著高于SEQ 處理和CK 處理（P＜0.05），同時接種乳酸菌有助于增加葡萄酒的酯類含量。蘋果酸-乳酸發酵結束后，各處理組的琥珀酸二乙酯含量與對照組相比均有增加，這是由于蘋果酸-乳酸發酵階段代謝葡萄酒中琥珀酸從而轉化為琥珀酸二乙酯，導致其含量升高[28]。其中辛酸乙酯是所有脂肪酸乙酯中含量最高的化合物，有研究表明釀酒酵母與T.delbrueckii混合發酵可有效提高葡萄酒產辛酸乙酯能力，賦予葡萄酒愉悅的水果風味[8]。與CK 組相比，SEQ 和SIM 處理的葡萄酒中乳酸異戊酯含量較高，而CK 組未檢測出。

2.3.2 不同試驗處理對醇類物質的影響

表6 結果表明，蘋果酸-乳酸發酵結束時，對照組CK 的高級醇含量顯著高于SIM 和SEQ 處理（P＜0.05）。醇類物質是葡萄酒揮發性成分的主要成分，占總揮發性香氣60%以上。高級醇由氨基酸通過Ehrlich 途徑或糖代謝Harris 途徑生成。高級醇通過Ehrlich 途徑由糖及其相應氨基酸的代謝產生[29]。蘋果酸-乳酸發酵后的高級醇含量高于酒精發酵結束，蘋果酸-乳酸發酵過程中會增加葡萄酒中氨基酸的含量，葡萄酒中增加的氨基酸能轉化為高級醇，從而增加醇含量[25]。本試驗中共檢測出9 種高級醇，異戊醇是所有醇類物質中占比最高的物質。蘋果酸-乳酸發酵結束時，CK 中異戊醇含量顯著高于其它處理（P＜0.05），可能會給葡萄酒帶來酒精味、溶劑味和指甲油等不良氣味[30]。SIM 處理2，3-丁二醇（黃油味）含量最高，同時接種發酵有助于雙乙酰的降解，使葡萄酒的香氣更加復雜，并對香氣和感官質量有積極的貢獻[31]。與酒精發酵相比，蘋果酸-乳酸發酵的葡萄酒正己醇含量均有明顯增加，賦予葡萄酒青草和植物味道。

2.3.3 不同試驗處理對其它揮發性物質的影響

蘋果酸-乳酸發酵結束時，不同試驗處理對馬瑟蘭葡萄酒揮發性物質總量的影響差異顯著（P＜0.05）。揮發性脂肪酸是發酵過程酵母和乳酸菌代謝產生的副產物，盡管在葡萄酒中微量存在，但其刺激性氣味和低閾值使其成為必需的香氣貢獻者。與AF 相比，MLF 發酵的葡萄酒中乙酸含量增加，主要原因是酒酒球菌對糖的異源利用以及檸檬酸代謝[24]。蘋果酸-乳酸發酵后SEQ和CK 處理己酸含量低于酒精階段，己酸乙酯含量卻高于酒精發酵，有研究表明在發酵過程中脂肪酸會轉化為相應的脂肪酸乙酯[32]。由乳酸菌指導的SEQ 和SIM 在發酵結束后未檢測出揮發性酚，有效降低了不良風味的影響，這與Devi 等[33]研究結果一致。本試驗中在蘋果酸-乳酸發酵階段檢測出1 種萜類化合物大馬士酮，CK 中大馬士酮含量最高，主要呈現玫瑰、鈴蘭等花香[34]。

2.4 主成分分析

不同接種方式香氣物質的主成分分析如圖1所示。

圖1 香氣化合物主成分分析的因子載荷圖Fig.1 Factor load diagram of principal component analysis of aroma compounds

由圖1 可知，PC1 和PC2 分別占47.1%和31.4%，累計貢獻達到78.5%。對照組CK 揮發性化合物可與PC1 上的SIM 和SEQ 區分開，而SIM 處理可以進一步與PC2 上的SEQ 區分開。SIM 主要分布在第四象限，并與正PC1 的變量密切相關。乳酸菌同時接種處理對一些重要酯類如Y1（乙酸己酯）、Y2（乙酸異戊酯）、Y9（己酸乙酯）、Y11（9-癸烯酸乙酯）表現出較高強度，主要是為葡萄酒貢獻了比較濃郁的果香和花香。CK 主要分布在第二和第三象限，CK 受與負PC1 強相關的變量影響更大，其中Y10（十二酸乙酯）、Y13（己酸異戊酯）、Y18（順-3-己烯醇）、Y23（異丁醇）和Y30（2，5-二叔丁基酚）的相關性較高。SEQ 位于第一象限，表現出與Y5（辛酸乙酯）相關性較高，賦予葡萄酒白蘭地和果香味。

2.5 不同試驗處理對馬瑟蘭葡萄酒感官評分的影響

不同試驗處理對馬瑟蘭葡萄酒感官評分如圖2所示。

圖2 馬瑟蘭葡萄酒感官評分Fig.2 Sensory score of Marselan red wine

由圖2 可知，不同試驗處理對馬瑟蘭葡萄酒澄清度、甜度和典型性的影響無明顯差異。馬瑟蘭葡萄酒的顏色主要呈深寶石紅色，其中SIM 處理色澤評分更高。在口感方面，SEQ 和SIM 處理酸度得分略高于CK，這與上述理化指標結果基本一致。香氣方面，SIM處理濃郁度評分更高些，果香味更明顯。CK 溶劑味略高于SEQ 和SIM 處理，這可能與葡萄酒較高的異戊醇含量有關。在總體評價方面，SIM 處理風味接受度略高于其它處理組，具有良好的口感和較為濃郁的果香。

3 結論

本文主要研究乳酸菌與釀酒酵母、非釀酒酵母順序和同時接種對馬瑟蘭葡萄酒基本理化指標、有機酸、揮發性成分和感官特性的影響。不同試驗處理均能完成酒精發酵和蘋果酸-乳酸發酵，總糖、總酸、酒精度均達到國家標準；SIM 處理能夠縮短發酵周期，且降低蘋果酸的效果較好，促進大量果香酯的合成，增加葡萄酒香氣，并改善葡萄酒口感。本試驗結果為馬瑟蘭葡萄酒的品質調控提供了新的思路和借鑒，但發酵過程中微生物間的相互作用機制還有待進一步深入研究。