3種不同組分香菇多糖對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的緩解作用

胡流云，周鈺龍，左勝，黃曉君，范琳琳，黃延盛，聶少平*

（1.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510623；2.南昌大學(xué)食品科學(xué)與資源挖掘國家重點實驗室，中國-加拿大食品科學(xué)與技術(shù)聯(lián)合實驗室，江西省生物活性多糖實驗室，江西 南昌 330047）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一類腸道慢性免疫異常疾病，其癥狀包括便血、腹瀉、嘔吐、體質(zhì)量減少和腹部疼痛等[1-2]。近些年，IBD 發(fā)病率和流行率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢[3]，但其病因及發(fā)病機制尚不明確，有研究認(rèn)為是由遺傳、腸道菌群失衡[4-5]、腸道屏障功能障礙[6]以及腸道免疫應(yīng)答失調(diào)[7]等因素引起。目前，臨床上對IBD 的藥物治療主要包括氨基水楊酸類藥物（如5-氨基水楊酸、柳氮磺胺砒啶）、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等，但是其中可能存在的副作用[8]（如腎損傷[9]）不容忽視。近年來的研究表明，天然產(chǎn)物多糖可作為一種潛在的益生元，在腸道菌群調(diào)節(jié)[10]、腸道免疫調(diào)節(jié)[11]等方面表現(xiàn)出一定的能力且無毒副作用。因此，利用天然產(chǎn)物多糖的功能特性進(jìn)行營養(yǎng)干預(yù)，或可成為緩解炎癥性腸病發(fā)生的有效方式。研究表明，香菇多糖（Lentinulaedodespolysaccharides，LEP）具有良好的免疫調(diào)節(jié)[12]、抗腫瘤[13-15]、抗炎[16-18]等生物活性。因此，香菇多糖對包括IBD 在內(nèi)的腸道炎癥具有潛在的抗炎作用，但是香菇不同組分多糖對該病的作用機制尚不清楚。

基于此，本文利用從香菇中分離得到的3種不同組分多糖，初步研究香菇多糖不同組分對葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎的抗炎活性效果并篩選出具有抗炎活性的香菇多糖組分，同時從炎癥反應(yīng)、腸道免疫等方面探討相應(yīng)的作用機制，以期為炎癥性腸病的治療以及香菇多糖不同組分的合理利用提供一些新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

SPF 級雌性C57BL/6J 小鼠[體質(zhì)量（20.0±1.0）g]：北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗中所有動物均符合美國國家健康研究院的實驗動物飼養(yǎng)規(guī)定。香菇粗提液（Lentinusedodescrude extract，LECE）：無限極（中國）有限公司；香菇多糖：取自南昌大學(xué)食品科學(xué)與資源挖掘國家重點實驗室，在前期工作中利用截留分子量分別為2.5、5.0 kDa 和10.0 kDa 的超濾膜，從香菇粗提液中分離得到的3種不同分子量的香菇多糖組分（LEP1、LEP2、LEP3）；美沙拉嗪（mesalamine，5-ASA）：葵花藥業(yè)集團(tuán)佳木斯鹿靈制藥有限公司；葡聚糖硫酸鈉（分子量36000～50000Da）：美國MP Biomedicals LLC 公司；小鼠髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）酶聯(lián)免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）酶聯(lián)免疫試劑盒、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）酶聯(lián)免疫試劑盒、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶聯(lián)免疫試劑盒、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）酶聯(lián)免疫試劑盒、干擾素-γ（interferon-gamma，IFN-γ）酶聯(lián)免疫試劑盒、白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）酶聯(lián)免疫試劑盒、白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）酶聯(lián)免疫試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；4%多聚甲醛固定液：南京建成生物工程研究所；磷酸鹽緩沖液（phosphate belanced solution，PBS）：上海源葉生物科技有限公司；蘇木素、伊紅染色液：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；愛先藍(lán)-糖原染色液（alcian blue periodic acid schiff，AB-PAS）試劑：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TRIzol、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒：日本寶生物工程株式會社。

1.1.2 試驗儀器

AL 104 型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；3K15 型低溫高速離心機：美國Sigma 公司；CX31型電子顯微鏡：日本Olympus 公司；E-330 型多功能酶標(biāo)儀、NanoDrop 2000 型微量核酸定量儀：美國Thermo 公司；SHP-150 型生化培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；DYY-6C 型電泳儀、DYC-3ID 型水平電泳槽：北京六一儀器廠；7900HT 型實時定量PCR儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗設(shè)計

選取108 只5～6 周[（20.0±1.0）g]的SPF 級健康雌性C57BL/6J 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為9 組：正常對照組（Control）、模型組（Model）、陽性藥物美沙拉嗪對照組（5-ASA，300 mg/kg bw）、香菇多糖組分LEP1 低（L-LEP1，100 mg/kg bw）、中（M-LEP1，200 mg/kg bw）、高（H-LEP1，400 mg/kg bw）劑量組、香菇多糖組分LEP2 高劑量組（H-LEP2，400 mg/kg bw）、LEP3 高劑量組（H-LEP3，400 mg/kg bw）及香菇粗提液組（LECE，400 mg/kg bw），香菇多糖各組分性質(zhì)參考文獻(xiàn)[19]。

實驗組小鼠每天分別以對應(yīng)劑量經(jīng)口灌胃相應(yīng)的香菇多糖和香菇粗提液，連續(xù)24 d，小鼠前14 d 自由飲用滅菌飲用水，第15 天開始更換為自由飲用3.5%DSS 溶液以誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎，連續(xù)7 d，后自由飲用滅菌飲用水3 d。

模型組小鼠每天經(jīng)口灌胃0.2 mL 無菌生理鹽水，連續(xù)24 d，小鼠前14 d 自由飲用滅菌飲用水，第15 天開始更換為自由飲用3.5%DSS 溶液以誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎，連續(xù)7 d，后自由飲用滅菌飲用水3 d。

藥物陽性對照組小鼠每天經(jīng)口灌胃0.2 mL 無菌生理鹽水，連續(xù)14 d，第15 天開始每天經(jīng)口灌胃300 mg/kg bw 的5-ASA，連續(xù)10 d，小鼠前14 d 自由飲用滅菌飲用水，第15 天開始更換為自由飲用3.5%DSS 溶液以誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎，連續(xù)7 d，后自由飲用滅菌飲用水3 d。

正常對照組小鼠每天經(jīng)口灌胃0.2 mL 無菌生理鹽水，連續(xù)24 d。

第25 天將所有小鼠頸椎脫臼處死，采取生物樣本，以備后續(xù)研究，動物實驗流程如圖1所示。

圖1 動物實驗設(shè)計Fig.1 Animal experiment design

1.2.2 小鼠體質(zhì)量變化和疾病活動指數(shù)評分

每天灌胃前稱量體質(zhì)量、觀察糞便性狀、記錄小鼠腹瀉、便血情況。以開始DSS 誘導(dǎo)當(dāng)天的小鼠體質(zhì)量作為初始體質(zhì)量，記為B0（g），第n天體質(zhì)量記為Bn（g）。體質(zhì)量下降率（T，%）計算公式如下。

T=（Bn-B0）/B0×100

參考Jackson 等[20]的方法并稍作修改，進(jìn)行疾病活動指數(shù)（disease active index，DAI）評分。具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 疾病活動指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring criteria for disease activity index

疾病活動指數(shù)（D）計算公式如下。

D=（T+F+B）/3

式中：T為體質(zhì)量下降率得分；F為糞便性狀得分；B為便血情況得分。

1.2.3 結(jié)腸長度和質(zhì)量長度比測定

取盲腸至肛門處全部腸段，去除腸管外壁脂肪，拍照，游標(biāo)卡尺測量并記錄長度。隨后盲結(jié)腸分離，取直腸至回盲部的全部結(jié)腸，沿腸縱軸剖開，預(yù)冷的PBS沖洗，濾紙上充分吸干水分，結(jié)腸稱重，比較每組小鼠結(jié)腸長度和質(zhì)量長度比的變化。

1.2.4 小鼠脾臟指數(shù)測定

分離取出脾臟，剔除組織周圍脂肪，觀察器官狀態(tài)并稱重，計算脾臟指數(shù)（P）。

P=M/B

式中：M為脾臟質(zhì)量，g；B為體質(zhì)量，g。

1.2.5 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察及組織學(xué)評分

取結(jié)腸組織固定于4%多聚甲醛溶液中，經(jīng)過脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟復(fù)水、蘇木素和伊紅試劑（hematoxylin-eosin，HE）染色、脫水封片。按照Gadaleta 等[21]的評分標(biāo)準(zhǔn)并稍作修改，對結(jié)腸組織病理情況進(jìn)行評分，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Histological scoring criteria

1.2.6 AB-PAS 檢測結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞和黏蛋白

取1.2.5 中制作好的切片，參照謝俊華[22]的方法，用AB-PAS 染色試劑盒對結(jié)腸組織進(jìn)行染色。

1.2.7 ELISA 檢測結(jié)腸組織中MPO 和炎癥因子含量

準(zhǔn)確稱取100 mg 結(jié)腸組織，按1∶9（g/mL）比例加入預(yù)冷的生理鹽水或PBS，冰上研磨制成10%組織勻漿，4 ℃、2 000 r/min 離心10 min，收集上清液并分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆谩０凑誆LISA 試劑盒操作說明，分別測定上清液中髓過氧化物酶MPO 和炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17 的含量。

1.2.8 小鼠血清中炎癥因子的含量測定

在實驗的第25 天，小鼠眼眶取血，置于離心管中靜置30 min，在4 ℃下3 000 r/min 離心15 min，取血清分裝保存于-80 ℃。按照對應(yīng)的試劑盒操作說明，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6 和IL-10 的含量。

1.2.9 RT-qPCR 檢測結(jié)腸組織mRNA 的表達(dá)水平

采用Trizol 法提取組織總RNA，取適量RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA 完整性，用微量核酸定量儀檢測RNA 純度，OD260/OD280比值在1.8 至2.0 之間表示純度較高。以提取的總RNA 為模板，用cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后進(jìn)行RT-qPCR 擴增，引物序列見表3。

表3 引物序列Table 3 Primer sequences

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way-ANOVA）和Tukey 檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠疾病表觀癥狀的影響

香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠疾病表觀癥狀的影響見圖2。

圖2 香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠疾病表觀癥狀的影響Fig.2 Effects of different fractions of Lentinula edodes polysaccharides on the apparent symptoms of the mouse model of colitis

如圖2（a）和圖2（c）所示，實驗結(jié)束時，模型組小鼠體質(zhì)量下降27.4%，與對照組相比下降高度顯著（p＜0.001），且伴隨著更為嚴(yán)重的血便和肛門出血情況，而造模前14 d 給予不同組分香菇多糖或粗提液進(jìn)行干預(yù)的各組小鼠體質(zhì)量均有所下降，其中LEP1 低、中、高劑量組及H-LEP3、LECE 組分別降至原體質(zhì)量的82.3%、84.9%、86.1%、88.6%和86.3%，與模型組相比下降幅度顯著減小（p＜0.001）。H-LEP2 組小鼠體質(zhì)量下降了23.1%，雖與模型組相比下降得更少但卻無顯著差異（p＞0.05）。實驗過程中LEP1 低、中、高劑量組及H-LEP3、LECE 組小鼠出現(xiàn)腹瀉和便血的時間較模型組有所延緩，且在實驗結(jié)束后糞便保持輕微潮濕及成型，肛門無血跡，接近于對照狀態(tài)，而H-LEP2 組小鼠仍保持稀便、血便和肛門出血情況，與模型組小鼠癥狀相似。

根據(jù)小鼠體質(zhì)量、糞便性狀及便血情況計算得到的小鼠疾病活動指數(shù)（DAI）能綜合反映DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎過程中小鼠炎癥程度的動態(tài)變化[23]。如圖2（b）所示，經(jīng)過14 d 干預(yù)后，在DSS 誘導(dǎo)后的前3 d，LEP1 低、中、高劑量組以及H-LEP3、LECE 組小鼠的DAI 小于模型組；從第4 天開始，各組小鼠的DAI 明顯增加，除HLEP2 組外，各多糖干預(yù)組小鼠的DAI 增加趨勢均小于模型組。在造模結(jié)束后給予普通飲用水的3 d 恢復(fù)期，模型組小鼠的DAI 持續(xù)增加，而LEP1 低、中、高劑量組以及H-LEP3、LECE 組小鼠的DAI 開始降低，并在實驗結(jié)束時高度顯著低于模型組（p＜0.001），其中以H-LEP3 和LECE 對DAI 的降低效果最為顯著，LEP1的效果次之但呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其對DAI 的降低效果與劑量呈正相關(guān)；與之相反，H-LEP2 組小鼠的DAI 雖低于模型組，但并無顯著差異（p＞0.05）。

2.2 香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸形態(tài)和質(zhì)量長度比的影響

香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸形態(tài)和質(zhì)量長度比的影響見圖3。

在DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中，結(jié)腸的病變程度，包括結(jié)腸形態(tài)、結(jié)腸長度和結(jié)腸質(zhì)量長度比，是反映炎癥嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)之一。由圖3 可知，與對照組相比，DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎后，模型組小鼠結(jié)腸長度明顯縮短且出現(xiàn)充血糜爛情況，由于水腫情況嚴(yán)重，其質(zhì)量長度比是對照組的近2.0 倍。香菇多糖組分LEP1低、中、高劑量組以及H-LEP3、LECE 組小鼠結(jié)腸長度顯著高于模型組，結(jié)腸外觀無肉眼可見的糜爛充血情況，與陽性藥物對照組相比差異不大，且質(zhì)量長度比分別較模型組降低（8.3±3.9）、（0.4±3.0）、（15.9±2.8）、（7.2±3.7）、（9.9±4.1）mg/cm，而H-LEP2 組小鼠結(jié)腸長度雖略微高于模型組，但較其余各實驗組相比更短，且結(jié)腸質(zhì)量長度比與模型組相比無顯著差異（p＞0.05）。以上結(jié)果表明，香菇多糖組分LEP1、LEP3 及粗提液LECE 的干預(yù)能夠有效改善結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸縮短、水腫糜爛情況，而LEP2 的效果不佳。

2.3 香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠脾臟指數(shù)的影響

研究表明，DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎易引發(fā)小鼠免疫系統(tǒng)障礙，損傷免疫器官的對照功能，誘發(fā)脾臟腫大等病變發(fā)生[24-25]，故脾腫大情況在一定程度上亦能反映出DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥程度。香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠脾臟指數(shù)影響見圖4。

圖4 香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠脾臟指數(shù)的影響Fig.4 Effects of different fractions of Lentinula edodes polysaccharides on spleen index of the mouse model of colitis

如圖4所示，對照小鼠脾臟外觀紅潤，形態(tài)正常，而經(jīng)DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠在不同程度上出現(xiàn)脾臟腫大、淤血等癥狀，其中以模型組與H-LEP2 組小鼠最為嚴(yán)重；而香菇多糖組分LEP1 低、中、高劑量組以及H-LEP3、LECE 組小鼠脾臟指數(shù)較模型組顯著降低，脾腫大情況較模型組相對改善，其中H-LEP1、LECE組小鼠脾腫大情況較輕，H-LEP3 組次之。以上結(jié)果表明，低、中、高劑量香菇多糖LEP1 以及高劑量LEP3、粗提液LECE 的干預(yù)能夠有效改善結(jié)腸炎小鼠的脾臟腫大，降低脾臟指數(shù)。

2.4 香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織形態(tài)的影響

結(jié)腸作為機體營養(yǎng)物質(zhì)吸收轉(zhuǎn)運的重要部位，腸絨毛、隱窩、腺體的結(jié)構(gòu)完整性能在一定程度上反映結(jié)腸的健康程度。香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織形態(tài)的影響見圖5。

圖5 香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織形態(tài)的影響Fig.5 Effects of different fractions of Lentinula edodes polysaccharides on the colon morphology of the mouse model of colitis

由圖5（a）可知，對照組小鼠結(jié)腸腺體排列整齊緊密，腸絨毛和隱窩結(jié)構(gòu)清晰完整。與對照組相比，經(jīng)DSS 誘導(dǎo)后，模型組小鼠結(jié)腸腸絨毛結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞、腸隱窩和腺體消失、上皮細(xì)胞脫落，且存在大量的炎癥細(xì)胞浸潤到黏膜肌層，腸道潰瘍糜爛情況嚴(yán)重；相對于模型組，陽性藥物5-ASA、H-LEP3、LECE 及LEP1低、中、高劑量組小鼠的結(jié)腸絨毛和腺體排列更為整齊、腸隱窩結(jié)構(gòu)更為完整，且只存在少許的炎癥細(xì)胞浸潤到固有層，腸上皮屏障破壞得到緩解，而高劑量的LEP2 在組織病理方面并沒有顯示出對小鼠結(jié)腸的保護(hù)作用。進(jìn)一步從腸隱窩損傷程度、腸上皮損傷范圍及炎癥細(xì)胞浸潤3 方面綜合考察能更客觀地反映出小鼠的結(jié)腸損傷程度[23]。如圖5（b）所示，對照組小鼠的腸道幾乎無損傷，模型組小鼠的病理學(xué)指數(shù)顯著高于對照組，而5-ASA、香菇多糖組分LEP1 低、中、高劑量組及H-LEP3、LECE 組小鼠的病理學(xué)指數(shù)較模型組顯著降低，分別為模型組的46.3%、50.6%、49.6%、33.3%、35.6%和39.3%；相反，H-LEP2 組小鼠的病理學(xué)指數(shù)與模型組相比無顯著差異（p＞0.05）。以上結(jié)果顯示，低、中、高劑量的香菇多糖組分LEP1 以及高劑量的LEP3、LECE對DSS 引起的小鼠結(jié)腸潰瘍糜爛、炎病細(xì)胞浸潤等組織損傷有一定修復(fù)作用，對結(jié)腸炎癥狀顯示出改善作用，而高劑量LEP2 的作用效果不甚明顯。

由圖5（c）可知，在對照組小鼠結(jié)腸組織中，可以看到大量形如高腳杯狀的杯狀細(xì)胞分布在腸絨毛表面和隱窩側(cè)壁；此外，腸上皮表面大面積紫紅色區(qū)域也顯示對照組小鼠腸道黏液層中含有豐富的黏蛋白。與之相反，經(jīng)DSS 誘導(dǎo)后，模型組小鼠結(jié)腸上皮隱窩和腸絨毛表面的AB-PAS 陽性染色區(qū)域大幅減少，隱窩和腸絨毛表面的杯狀細(xì)胞幾乎消失；顯而易見的是，5-ASA、高劑量的LEP1 以及LECE 能明顯改善結(jié)腸炎小鼠腸道中杯狀細(xì)胞和黏蛋白數(shù)量的減少，低、中劑量的LEP1 和LEP3 也顯示出一定的改善效果。

2.5 香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸MPO 含量的影響

DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜受損嚴(yán)重，進(jìn)而組織中大量的炎癥細(xì)胞浸潤，其中中性粒細(xì)胞可分泌大量的髓過氧化物酶MPO，參與結(jié)腸炎癥的惡化。因此，MPO 是炎癥組織中的標(biāo)志性酶[26]，其水平變化可以反映腸黏膜的損傷程度。香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸MPO 含量的影響見圖6。

圖6 香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠髓過氧化物酶MPO 含量的影響Fig.6 Effects of different fractions of Lentinula edodes polysaccharides on the myeloperoxidase content in the colon of the mouse model of colitis

由圖6 可知，模型組小鼠的結(jié)腸組織中MPO 含量顯著高于對照組；提前14 d 給予香菇多糖各組分和粗提液進(jìn)行干預(yù)，除LEP2 組外，其余各干預(yù)組小鼠的腸道損傷均得到改善，炎癥細(xì)胞含量減少，MPO 含量較模型組顯著降低（p＜0.05）。結(jié)果表明，低、中、高劑量的香菇多糖組分LEP1 及高劑量的LEP3、LECE 能夠抑制中性粒細(xì)胞侵入腸黏膜，降低小鼠腸道MPO 含量，進(jìn)一步緩解結(jié)腸炎癥。

2.6 香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠炎癥因子的影響

在腸道中，細(xì)胞因子與腸道上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞間復(fù)雜有序的交流可以調(diào)控腸道穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而維持機體生理平衡，預(yù)防疾病的發(fā)生；反之，腸道生理結(jié)構(gòu)遭到破壞亦會打破細(xì)胞因子間的交流網(wǎng)絡(luò)平衡，引發(fā)組織炎癥、纖維化等病變[27]。因此，炎癥細(xì)胞因子的水平對于評判炎癥的輕重程度具有重要作用。香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠炎癥因子的影響見圖7。

圖7 香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠炎癥因子的影響Fig.7 Effects of different fractions of Lentinula edodes polysaccharides on inflammatory cytokines in the mouse model of colitis

由圖7 可知，經(jīng)DSS 誘導(dǎo)后，模型組小鼠血清中促炎因子TNF-α 與IL-6 的含量顯著增加，分別較對照組高（115.2±22.6）pg/mL 和（3.9±1.2）pg/mL，而IL-1β的含量雖有少許增加卻無顯著性差異（p＞0.05）。同時，香菇多糖組分LEP1 低、中、高劑量組以及H-LEP3、LECE 組小鼠血清中TNF-α 的含量較模型組分別下降36.4%、49.2%、53.6%、52.8%和47.7%，且均在一定程度上較5-ASA 組更低，而IL-1β 和IL-6 的水平與模型組相比無顯著差異（p＞0.05），這與Hartog 等[28]的研究結(jié)果相似，不可消化多糖能夠改善DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，但對腸道免疫的調(diào)節(jié)更為顯著，對于血清中IL-1β 等部分炎癥因子的影響不顯著。有研究顯示，DSS 會破壞結(jié)腸屏障功能，在趨化因子的作用下眾多炎癥細(xì)胞活化并募集至受損組織，誘發(fā)腸道組織局部炎癥反應(yīng)，眾多炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6 等含量增加[29]。持續(xù)的腸道炎癥反應(yīng)常造成腸上皮破壞，導(dǎo)致致病菌的過度侵襲，致病菌抗原穿越腸道進(jìn)入血液，從而放大局部炎癥反應(yīng)，誘發(fā)全身性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致血清中炎癥細(xì)胞因子含量的急劇上升[30]。這在一定程度上說明，DSS 誘導(dǎo)后的腸道局部炎癥反應(yīng)已放大為全身炎癥反應(yīng)，而低、中、高劑量的LEP1 以及高劑量的LEP3 和LECE 在一定程度上對其有更好的抑制作用。此外，5-ASA、LEP1 低、中、高劑量、HLEP3 和LECE 組小鼠腸道組織中炎癥因子TNF-α、IL-6 及IL-1β 的水平均顯著低于模型組。模型組小鼠血清中IL-10 的含量較對照組有一定下降，而5-ASA、LEP1 低、中、高劑量組及H-LEP3、LECE 組較模型組均有顯著提高。IL-10 作為調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分泌的標(biāo)志性細(xì)胞因子，在以CD4+T 細(xì)胞為主的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能時起到關(guān)鍵作用。以上結(jié)果說明各實驗組對炎癥的緩解作用或主要歸因于對腸道中炎癥因子的調(diào)節(jié)。

2.7 香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠細(xì)胞免疫的影響

Th1 型細(xì)胞主要由轉(zhuǎn)錄因子T-bet 介導(dǎo)其分化成熟并分泌細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ 和TNF-α，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，幫助機體抑制腫瘤、抵抗細(xì)菌病毒感染；而Th2 型細(xì)胞的成熟分化主要由轉(zhuǎn)錄因子GATA3介導(dǎo)，其標(biāo)志性細(xì)胞因子有IL-4 和IL-6 等，主要介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，幫助機體合成特定抗原的抗體。T-bet和GATA3 在調(diào)節(jié)Th1/Th2 分化平衡中有重要作用。香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠細(xì)胞免疫的影響見圖8。

圖8 香菇多糖不同組分對結(jié)腸炎小鼠細(xì)胞免疫的影響Fig.8 Effects of different fractions of Lentinula edodes polysaccharides on the cellular immunity in the mouse model of colitis

由圖8 可知，經(jīng)DSS 誘導(dǎo)后，模型組小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4 的水平較對照組顯著提高，T-bet的表達(dá)水平較對照組顯著上調(diào)，說明在DSS破壞腸道后，機體啟動Th1、Th2 型免疫清除入侵的致病菌抗原。然而，5-ASA、香菇多糖LEP1 低、中、高劑量、H-LEP3 及LECE 組小鼠結(jié)腸組織中GATA3的表達(dá)與模型組相比幾乎無差異，這與結(jié)腸組織中IL-4 含量的變化趨勢一致。對于T-bet，各實驗組T-bet的表達(dá)較模型組極顯著下調(diào)（p＜0.01），而H-LEP3、LECE組小鼠結(jié)腸中IFN-γ 的水平與模型組相比并無顯著差異（p＞0.05），只有5-ASA 及LEP1 組較模型組略有下降且趨近于對照水平，其原因可能是LEP3、LECE 通過其他方式促進(jìn)了Th1 免疫，這有待于進(jìn)一步研究闡明。

Th17/Treg 的平衡對于結(jié)腸炎的發(fā)展起到?jīng)Q定性作用。研究顯示，IL-10 缺陷小鼠體內(nèi)出現(xiàn)自發(fā)性結(jié)腸炎[31]；巨噬細(xì)胞分泌的IL-23 可促進(jìn)Th17 細(xì)胞的增殖及腸道炎癥的發(fā)生[32]；在結(jié)腸炎患者的腸黏膜中，IL-17 的水平高于對照人群。相反，IL-17 缺失的小鼠Treg細(xì)胞活性增強，進(jìn)而抑制結(jié)腸炎癥[33]。RORγt 是Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，作為炎性細(xì)胞亞群，Th17細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞因子IL-17、IL-22 和IL-23 的分泌，進(jìn)而活化和募集中性粒細(xì)胞向炎癥部位遷移，最終引起Th17 型炎性免疫反應(yīng)；而Treg 型細(xì)胞則在調(diào)控因子Foxp3 的作用下進(jìn)行生長發(fā)育并分泌抗炎因子IL-10，有效抑制過度的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)DSS 誘導(dǎo)后，模型組小鼠結(jié)腸組織中IL-17 的水平較對照組顯著提高（p＜0.01），且在基因水平上，RORγt的表達(dá)較對照組顯著上調(diào)（p＜0.001），說明在DSS 破壞腸道后，Th17 免疫細(xì)胞大量分化使Th17/Treg 平衡偏向Th17 免疫，Treg 免疫受到抑制，引發(fā)炎癥反應(yīng)。因此，模型組小鼠結(jié)腸組織中IL-10 的水平和Foxp3的基因表達(dá)量均較對照組有所下降。香菇多糖LEP1 低、中、高劑量、H-LEP3 及LECE 組小鼠結(jié)腸組織中IL-10 的水平分別較模型組提高（50.4±6.4）、（35.9±4.6）、（74.2±9.4）、（73.6±9.3）、（46.6±5.9）pg/mg 蛋白，而IL-17 的水平分別為模型組的61.6%、71.2%、80.6%、60.9%和86.7%。在基因水平上與模型組相比，各組Foxp3的表達(dá)量也顯著上調(diào)（p＜0.001），RORγt的表達(dá)量顯著下調(diào)。

3 討論與結(jié)論

在本研究中，低、中、高劑量的香菇多糖組分LEP1以及高劑量LEP3 和粗提液LECE 提前14 d 干預(yù)能有效緩解DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、腹瀉、便血等癥狀，降低小鼠疾病活動指數(shù)，減輕腸道病理損傷，改善免疫器官指數(shù)，能夠在一定程度上延緩小鼠結(jié)腸炎癥的發(fā)展。

香菇多糖組分LEP1、LEP3 及粗提液LECE 能顯著降低結(jié)腸炎小鼠血清炎癥因子TNF-α 的水平，提升血清中抗炎因子IL-10 的水平，同時顯著提升腸道組織中炎癥因子TNF-α、IL-6 及IL-1β 的水平，各組分對炎癥的緩解作用可能主要歸因于對腸道中炎癥因子水平的調(diào)節(jié)。

同時，香菇多糖組分LEP1、LEP3 及粗提液LECE能顯著提高結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中IL-10 并降低IL-17 的水平，同時上調(diào)Foxp3基因、下調(diào)RORγt基因的表達(dá)，各組分通過促進(jìn)Treg 免疫、抑制Th17 免疫，促使Treg/Th17 平衡偏向Treg 型免疫，從而延緩結(jié)腸炎癥。

本研究結(jié)果雖顯示香菇多糖組分LEP1、LEP3 的干預(yù)對小鼠結(jié)腸炎的發(fā)展具有一定阻礙，但是LEP2卻無明顯作用，多數(shù)研究均表明多糖的活性與其分子量大小、支鏈結(jié)構(gòu)、取代基等有很大關(guān)系，未來的研究應(yīng)就香菇多糖不同組分的構(gòu)效關(guān)系展開深入研究，并對作用最佳的香菇多糖組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，為多糖的現(xiàn)代化開發(fā)利用提供參考。