γ-氨基丁酸生物合成研究進展

賈世杰，劉江花，李國梁

（陜西科技大學食品科學與工程學院，陜西 西安 710021）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種四碳非蛋白質氨基酸，分子式為C4H9NO2，相對分子質量103.12，呈白色結晶粉末狀，于19世紀末首次人工合成[1]。GABA 在醫藥食品領域應用廣泛，富含GABA的食品有助于提高睡眠質量、促進新陳代謝、恢復腦細胞活力等[2]，臨床上主要用于高血壓、癲癇、心率失常、睡眠障礙、焦慮和抑郁癥等疾病的治療[3]。隨著對GABA 生理功能研究的不斷深入，其市場需求量也隨之不斷提高。

目前，GABA 的生產方法主要有化學合成、植物富集及生物合成。化學合成主要以γ-丁內酯、γ-鹵代丁腈、2-溴丙酸和戊二酸酐作為底物合成GABA[4]，其反應速度快、產量高，但存在原料毒性大、反應環境嚴格、設備成本高、易產生有毒有害副產物、造成環境污染等問題，一定程度上限制了其在食品醫藥領域的應用。相較于化學合成，通過低溫或高鹽脅迫處理從植物中富集GABA 操作簡單、安全、環境友好，但其存在富集產率低和成本高的局限性，無法滿足市場需求[5]。生物合成是利用微生物將底物轉化為GABA，具有環境友好、反應溫和、綠色環保的優點，適用于食品藥品領域，又因微生物具有繁殖周期短、生長快及適應性強等特點受到廣泛關注。

盡管當前生物合成GABA 已經取得了一些進展，但仍存在一系列瓶頸問題，影響進一步提高其產量，其一是缺乏高效安全的底盤菌株，盡管常用的大腸桿菌具有比較完備的酶系統，但其固有的內毒素導致的安全性問題在一定程度上限制了它的應用[6]；乳酸菌系多為益生菌，其催化合成GABA 效率較高，但也受到調節因子和環境的抑制[7]；霉菌和酵母菌的催化效率相對較差。此外，還存在因輔酶因子缺乏導致限速酶活性不高、菌株與限速酶最適pH 值和溫度不兼容、從頭合成底物利用率低、代謝負擔影響菌株生長等問題。針對上述問題，已經報道了相應策略如篩選高產益生菌及誘變育種、構建輔酶因子回補途徑、限速酶的定向改造、途徑改造、多菌株共培養等，但是目前還缺乏對GABA 生物合成產量提高策略的系統綜述，因此本文對當前生物合成GABA 及其產量提高策略進行了系統總結（見圖1），并對未來的發展方向進行了展望。

圖1 生物合成γ-氨基丁酸的產量提高策略Fig.1 Production increase measures for the biosynthesis of gamma-aminobutyric acid（GABA）

1 GABA 的生物合成

1.1 GABA 生物合成途徑

微生物發酵生產GABA 主要通過支路途徑和腐胺途徑進行（見圖2）。支路途徑于1970年首次提出，由磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）依賴的谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）催化L-谷氨酸的α-脫羧形成GABA，是微生物生產GABA 的主要方式[8]。腐胺途徑是由腐胺、多胺或鳥氨酸經一系列降解反應合成GABA，由于腐胺及其代謝產物對宿主具有很強的毒性，采用此方法合成GABA 的報道較少[9]。此外，最新研究證明乳酸菌中存在一種新型的GABA合成路徑，以谷氨酸作為氨基供體，在γ-氨基丁酸轉氨酶（γ-aminobutyric acid transaminase，gabT）的作用下將琥珀酸半醛（succinic acid semialdehyde，SSA）轉化為GABA[10]。

圖2 GABA 的合成途徑Fig.2 The synthetic pathway of GABA

1.2 底盤菌株的選擇

GABA 可以通過多種底盤菌株合成，主要包括大腸桿菌、乳酸菌、谷氨酸棒狀桿菌、酵母菌屬、枯草芽孢桿菌、少數霉菌、雙歧桿菌等。

1.2.1 大腸桿菌

大腸桿菌具有培養周期短、繁殖速度快、適應性強等優點，是天然產物生物合成常用的細胞工廠。研究表明，大腸桿菌具有較為完備的酶系統，在合成生物學中應用較廣。在大腸桿菌中表達密碼子優化的乳球菌谷氨酸脫羧酶B（glutamate decarboxylase B，gadB），以2 mol/L 葡萄糖作為底物，GABA 的平均產率達到40.94 g（/L·h），經3 次補料培養后獲得614.15 g/L GABA，摩爾轉化率接近100%（見表1）[11]，表明大腸桿菌在GABA 生產中具有較大潛力。但是革蘭氏陰性菌固有的內毒素存在潛在毒性風險，限制其在食品藥品領域的應用，無內毒素益生菌EscherichiacoliNissle 1917的發現為GABA 的合成帶來了新機遇，利用基因編輯工具CRISPR/Cas 改造Nissle 1917 合成GABA，其產量可達17.9 g/L[6]。雖然合成產量相較于其它大腸桿菌較低，但是作為益生菌，EscherichiacoliNissle 1917 滿足了安全性要求，在GABA 生物合成中有著更廣闊的應用前景。

表1 GABA 生物合成底盤菌株及產量Table 1 The chassis strains of GABA biosynthesis and their production

1.2.2 乳酸菌

乳酸菌是一種食品級的安全菌株，在自然界分布極為廣泛，具有豐富的物種多樣性，是研究分子生物學和基因工程的理想材料。利用乳酸菌作為底盤菌株生產GABA 由來已久，乳酸菌谷氨酸脫羧酶具有較好的催化活性，常被用來過表達生產GABA。利用靜息乳酸菌以谷氨酸鈉作為底物生產GABA，產量最高可達201.18 g/L，產率為20.118 g（/L·h），轉化率可達99.4%[12]，表明利用乳酸菌生產GABA 具有巨大潛力（表1）。在乳酸菌中，氮調節劑（global transcriptional regulatory proteins of nitrogen metabolism，GlnR）可直接調節谷氨酸與GABA 轉化，能夠抑制谷氨酸脫羧酶基因gadB和GABA 逆轉運蛋白基因（γ-aminobutyrate antiporter，gadC）的轉錄，利用GlnR缺失菌株能夠合成284.7 g/L GABA，其產量是野生型菌株的9.8 倍[7]。乳酸菌生產GABA 也受到中堿性環境的限制，加入過量的谷氨酸，在保障底物充足的情況下，又能維持pH 值穩定，利用這種pH 值自動維持的體系，L.brevisCD0817 能夠合成（321.9±6.7）g/L GABA，產率為6.71 g/（L·h），這是一種低成本、相對簡單的維持環境穩定的方法，但也存在谷氨酸溶解度低、產率不高的問題[13]。

1.2.3 谷氨酸棒狀桿菌

谷氨酸棒狀桿菌一般公認為安全菌株，在合成氨基酸方面有著顯著優勢。Wen 等[14]在谷氨酸棒狀桿菌中過表達來自大腸桿菌的突變谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase B mutant，gadBmut）（Glu89Gln/ΔC452-462），并結合谷氨酸脫羧酶分泌表達策略，GABA 的產量可達77.6 g/L GABA，產率為1.21 g/（L·h），每克葡萄糖可轉化為0.44 g GABA，這是首次報道利用谷氨酸棒狀桿菌胞外催化合成GABA。另外，為了緩解菌株生長與高附加值產品合成之間對底物競爭的矛盾，Wei等[15]創建了一個可調控的生長階段依賴性自主雙功能遺傳開關（growth phase-dependent autonomous bifunctional genetic switch，GABS），能夠實現谷氨酸棒狀桿菌從生長模式到生產模式的狀態轉換，利用甘油作為底物發酵生產GABA，其產量可達45.6 g/L，每克甘油可轉化為0.4 g 的GABA。谷氨酸棒狀桿菌在合成GABA過程中具有良好的底物（谷氨酸）生產能力，但其基因組中不含谷氨酸脫羧酶基因，需要通過引入異源谷氨酸脫羧酶基因進行表達。

1.2.4 酵母菌

酵母菌被廣泛用于釀造業，其基因組中含有谷氨酸脫羧酶基因，因此具有發酵生產GABA 的潛力。Han 等[16]利用分離篩選出來的酵母菌PichiasilvicolaUL6-1 和Sporobolomycescarnicolor402-JB-1 在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培養基中于30 ℃培養30 h，分別能夠合成136.5 μg/mL 和200.8 μg/mL GABA，由此可見，天然酵母菌的谷氨酸脫羧酶活性不佳。為解決野生型酵母產能弱的劣勢，Yuan 等[17]在釀酒酵母菌中異源表達來自鏈霉菌屬的谷氨酸脫羧酶，經十批補料發酵后，GABA 產量達到62.6 g/L，總摩爾轉化率為60.8%，極大地提高了GABA 的產量。此外，Zhang 等[18]利用克魯維酵母以豆渣作為原料生產GABA，在初始pH4.0、培養溫度35 ℃下發酵60 h，最高可獲得4.31 g/L GABA（表1）。但是目前基于酵母生產GABA 的產率相比于其它底盤菌株仍然較低。

2 GABA 產量的提高

2.1 篩選野生型高產菌株及誘變育種

篩選天然高產菌株是提高GABA 產量的基本策略。Wang 等[28]從我國泡菜中分離的短乳酸桿菌NCL912，發酵48 h，GABA 的產量可達（205.8±8.0）g/L，此外，酵母菌、霉菌等也被篩選出來用于GABA 生產，但產率均不高，需做進一步改造。

微生物誘變育種是以人工手段誘發微生物基因突變，改變其遺傳信息和功能，通過誘變育種能夠篩選性能優越的突變菌株。Wu 等[30]通過大氣與室溫等離子體誘變過的紅曲霉具有固態發酵GABA 的能力，優化底物配比后，GABA 的產量可達15.93 mg/g，但是誘變育種的不定向性與低頻性導致菌種選育工作量大，采用此方法生產GABA 的報道較少。

2.2 限速酶優化

2.2.1 不同菌株來源的限速酶活性

自然界中谷氨酸脫羧酶廣泛分布于各種微生物中，其來源不同，活性也存在差異，目前報道的少數乳酸菌屬、芽孢桿菌屬谷氨酸脫羧酶活性較高。GAD 限速酶活性比較見表2。

表2 GAD 限速酶活性比較Table 2 Comparison of the activity of rate-limiting enzyme（glutamic acid decarboxylase）among different strains

2.2.2 兩階段pH 值調控策略合成GABA

在支路途徑生產GABA 中，谷氨酸脫羧酶（GAD）扮演了重要角色，以磷酸吡哆醛為輔酶、不可逆地將谷氨酸（L-glutamate,L-Glu）轉化為GABA，反應過程中消耗H+并釋放CO2，使培養基中pH 值上升[38]。不同菌株來源的GAD 在低pH 值下發揮作用，即使是來自GAD 活性普遍較高的大腸桿菌和乳酸桿菌，在中性條件下也會急劇失活，而大多數微生物的最適生長條件偏向于中性（見表3），因此導致了菌株與限速酶pH 值不兼容。采用兩階段pH 值發酵策略能在一定程度解決該問題，首先調節pH 值使得菌株快速生長，待菌株達到穩定期后，調節到限速酶的最適pH 值，用于生產GABA。應用此思路，利用來自L.brevisTCCC13007 建立了一個用于生產GABA 的兩步細胞生物轉化過程。首先，在7%的含味精培養基中，初始pH 值為6.0，隨后控制pH 值為4.6，發酵66 h 可獲得約38 g/L 的GABA，轉化率為98.6%[39]。在谷氨酸棒狀桿菌中引入來自乳酸菌谷氨酸脫羧酶和磷酸激酶，采用兩階段pH 值調控策略，最終產量達到70.6 g/L[40]，兩階段pH 值調控策略對于GABA 的合成有效，但步驟較為繁瑣。

表3 菌株與限速酶最適pH 值和溫度Table 3 Optimum pH values and temperatures for strains and the rate-limiting enzyme

2.2.3 限速酶定向改造

近年來，隨著結構信息學的不斷進步，GAD 的晶體結構已被獲悉，通過在不同條件下對GAD 晶體結構的分析發現，GAD 的羧基端在酸性pH 值下大多是沒有結構的，但接近中性條件時，會形成類似于“塞”的結構，阻止了底物谷氨酸在中性pH 值下與活性位點的結合[41，45]。另外，研究發現幾個關鍵的氨基酸殘基與酶活性位點有關，不同來源的GAD 關鍵位點不同，大腸桿菌的谷氨酸脫羧酶中Glu89 與pH 值協同活性相關，雙重突變體Glu89Gln/ΔC452-466 不僅破壞了協同性，而且產生了在接近中性pH 值下仍保持活性的突變GAD[46]。而在乳酸菌谷氨酸脫羧酶中，則與17、294、312、346 號位氨基酸有關，多重突變體K17T/D294G/E312S/Q346/ΔC11 表現出中性pH 值下的活性，酶的催化活性kcat/Km 達到3.91 m·mol/（L·S），與野生型相比提高了5 倍多[45]。而在巨大芽孢桿菌中酶的pH 值協同活性則與294 和467 號氨基酸有關，突變體E294R/H467A 提高了pH 值的活性范圍[43]。在恥垢分枝桿菌中C 端缺失突變體GADMSMΔC 的Vmax 和Km 值在pH5.5 下分別為14.69 和5.70，在pH7.0 下分別為9.87和6.17。與野生型GAD 相比，GADMSMΔC 保持了更高的底物親和力和酶活性，即使在pH7.0 時也保持了78.5%的酶活性[47]。

除了pH 值協同活性，酶對溫度的耐受性也是工業化要求之一，因此可以定向改造GAD 的熱穩定性。乳酸菌谷氨酸脫羧酶突變體S325A 不僅提高了半熱致死溫度，且酶活性相較于野生型也有明顯增強[35]。大腸桿菌谷氨酸脫羧酶三重突變體Gln5Ile/Val6Asp/Thr7Gln 相較于野生型顯示出更高的熱穩定性[48]。

近期報道了一種基于序列的蛋白質設計新策略，基于全一致序列設計的人工谷氨酸脫羧酶（Full consensus GAD，FcGAD）在耐熱性、耐酸性及催化活性較野生型有著明顯優勢，利用表達FcGAD 的大腸桿菌作為生物催化劑，實現了克級GABA 的合成[36]。隨著生物信息學的發展，基于共識序列設計蛋白質為提高GABA產量提供了新思路。

2.2.4 構建輔酶因子回補途徑提高酶活性

PLP 是谷氨酸脫羧酶重要的輔酶因子，機體缺乏PLP 會導致GAD 活性下降，因此可以通過構建輔酶因子回補途徑來解決活性不足的問題。在大腸桿菌中共表達來自乳酸菌的GAD 與來自大腸桿菌磷酸吡哆醛激酶（pyridoxal kinase gene，pdxY），優化培養和反應條件，0.6 mol/L 谷氨酸鈉實現了100%轉化率[49]。同樣在大腸桿菌中表達來自釀酒酵母的pdx1 和pdx2 兩種磷酸激酶，以25 g/L 谷氨酸鈉為底物合成了13.2 g/L 的GABA，其合成產量相較于原始菌株有著明顯提高[50]。

2.3 支路途徑改造

2.3.1 一步法途徑改造

一步法合成GABA 是指在培養基中直接補充底物谷氨酸（或谷氨酸鈉），在谷氨酸脫羧酶的作用下生成GABA，其受到幾個關鍵基因調控：gadB編碼谷氨酸脫羧酶，能夠將谷氨酸轉化為GABA；gadC編碼轉運蛋白，負責將胞外的谷氨酸轉運到胞內，將合成GABA 轉運到胞外，其轉運效率受到pH 值的影響，當pH 值高于6.5 時，其羧基末端塞子狀結構域閉合，阻斷向內開放[51]；gabT編碼GABA 轉氨酶，能夠將GABA轉化為琥珀酸半醛；gabP編碼逆轉運蛋白，負責將胞外的GABA 轉運至胞內。在重塑代謝網絡提高產量的策略中，需要上調谷氨酸流向GABA 的通量，即上調gadB和gadC的轉錄與翻譯水平，下調降解途徑及逆轉運途徑，即敲除gabT與gabP途徑。應用此策略，過表達與GABA 生物合成和轉運相關的基因gadA、gadB和gadC，同時敲除降解相關基因gabT，以及逆轉運通道gabP，構建的菌株獲得了19.79 g/L 的GABA，轉化率達到93.8%[20]。在敲除gabT的大腸桿菌突變體中，聯合表達gadB和gadC，10 g/L 的谷氨酸鈉中可產生5.46 g/L 的GABA，摩爾轉化率高達89.5%[52]。應用支架在大腸桿菌中共表達gadB和gadC，10 g/L 的谷氨酸鈉中可產生5.65 g/L 的GABA，摩爾轉化率高達93%[19]。在大腸桿菌中共表達gadBM4-2和gadCΔC，最終產量達到（307.50±5.94）g/L[53]。

2.3.2 從頭設計合成途徑

在GABA 的合成中，除了利用谷氨酸（或谷氨酸鈉）作為底物，還可以利用其它碳源如纖維素、葡萄糖、木糖、甘油和甲醇等原料，既能節約資源，又能生產高附加值產品。但由于這些底物利用率低，直接以其作為底物合成GABA 效率不高，因此需要根據碳源種類開發高利用菌株，并進行途徑改造提高GABA 的產量。例如，Wei 等[15]為了構建高甘油利用率的谷氨酸棒狀桿菌，首先，過表達甘油跨膜通道（aquaglyceroporin，GlpF）、甘油脫氫酶（glycerol dehydrogenase，DhaD）、ATP 依賴的二羥基丙酮激酶（ATP-dependent dihy droxyacetone kinase，DhaK）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PPC）、丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase，PC）、檸檬酸合酶（citrate synthase，GltA）等，提高甘油利用率；然后，調控α-酮戊二酸碳流偏向谷氨酸合成途徑，過表達gad、gadC，獲得高產GABA 的菌株。在構建高利用甘油的大腸桿菌生產GABA 的菌株中，首先采用進化和代謝工程篩選出甘油適應性高的菌株，然后失活一些非必要的代謝基因，使得更多碳通量流向GABA，提高了GABA 的產量[54]。

途徑改造雖然能夠將碳通量高效導向目標產物，但改造過程繁瑣，一些關鍵基因的缺失可能導致無法滿足菌株正常的生長發育需求，造成菌株濃度低下，產量沒有大幅提高甚至下降的情況。因此，平衡生長與代謝壓力之間的矛盾是關鍵。已有研究報道了一些敏感性元件，可以克服微生物生長繁殖與代謝壓力之間的矛盾，使碳源優先滿足菌株生長發育，待菌群達到穩定后，再用于產物代謝。如利用對生長期敏感的GPP啟動子調控生長模式到生產模式的轉換[15]。利用對溫度敏感的啟動子，如冷休克基因CSPA 啟動子，通過對溫度的改變實現從生長模式到生產模式的轉變[55]。利用對底物專一的啟動子，如木糖啟動子，在利用玉米芯水解物發酵生產附加值產品時，葡萄糖優先用來滿足生長后，在木糖啟動子的作用下進入生產模式[56]。

2.4 共培養策略

單菌株細胞工廠改造增加了宿主生長發育的代謝負擔，容易導致目標化合物產量不高，多菌株共培養減小單個菌株代謝的負擔，且減少了生物合成途徑設計，是提高目標化合物合成產量的有效策略[57]。利用嗜熱鏈球菌與乳酸菌共培養發酵生產高含量GABA牛奶，嗜熱鏈球菌水解特定肽滿足了乳酸菌的生長，同時，嗜熱鏈球菌分解代謝產生的乳酸所產生的酸性環境維持了乳酸菌中的GAD 活性，提高了GABA 含量[58]。糞腸球菌與融合魏斯氏菌共培養合成的GABA 產量更高，發酵時間更短[59]。釀酒酵母菌與植物乳桿菌共培養發酵桑椹飲料，合成了更高產量的GABA[60]。基于釀酒酵母與大腸桿菌共培養生產羥基酪醇的思路[61]，利用谷氨酸棒狀桿菌與大腸桿菌共培養，前者為后者提供底物谷氨酸，后者催化谷氨酸合成GABA 或許會成為可能。目前，共培養策略生產GABA 還僅僅應用在一些功能性飲品中，直接用于GABA 高產量合成的尚未報道。

3 總結與展望

GABA 作為一種具有多種生理活性的物質，被廣泛用于開發以健康為導向的產品，而化學合成易產生有毒副產物，植物富集效率低，難以滿足日漸增長的市場需求，生物合成因綠色環保且具有較高的生物轉化率而備受關注，但目前生物合成GABA 仍然存在一系列瓶頸問題，很大程度上制約了GABA 產量的進一步提高。本文系統總結了目前報道的提高GABA 生物合成產量的策略，主要包括：通過酶的定向改造解決限速酶與菌株最適生長環境（溫度或pH 值）不兼容的問題，利用生物信息學進行蛋白結構功能化設計；通過構建回補途徑以廉價的磷酸吡哆醇替代磷酸吡哆醛作為底物生成輔酶因子，利用代謝途徑改造能夠有效提高底物利用率和目標物產量，多菌株共培養分擔代謝壓力等。另外，選用安全高效底盤菌株如乳酸菌、谷氨酸棒狀桿菌能夠提高合成GABA 的安全性，使其直接應用于食品醫藥領域。在提高底物利用率的基礎上，擴大底物選擇范圍，選擇便宜易得的底物，如大豆水解液、玉米芯水解液等也是合成GABA 且降低生產成本的有效策略。