尿石素A對高脂飲食老齡小鼠白色脂肪棕色化的影響

劉星宇,李 慧,李 菁,王 瑩,趙立升,封純真

肥胖癥是一種以體內脂肪過度沉積和體重超常為特征的慢性代謝性疾病,是引起高血壓病、糖尿病、心腦血管疾病、腫瘤等衰老相關疾病的危險因素和病理基礎。在過去30多年,世界范圍內超重和肥胖患者急劇增多,導致一系列肥胖相關的健康問題[1]。因此,尋找防治肥胖的干預措施迫在眉睫。

尿石素A(urolithin A)是石榴、草莓、樹莓及核桃等水果或堅果中的鞣花單寧與鞣花酸經(jīng)腸道微生物作用產(chǎn)生的活性代謝物[2],具有抗癌[3]、抗炎[4,5]、抗衰老[6]等多種生物學作用。最近有研究發(fā)現(xiàn),尿石素A對肥胖及其相關疾病發(fā)揮有益的保護作用[7, 8],但其作用機制尚不十分清楚。促進白色脂肪棕色化是防治肥胖及其相關疾病的重要靶點[9, 10],因此,本研究探討尿石素A對高脂飲食小鼠白色脂肪棕色化的影響,以期為防治肥胖癥提供新藥物及新靶點。

1 對象與方法

1.1 材料與試劑 18月齡雄性C57小鼠18只(湖北省實驗動物研究中心);穩(wěn)豪倍優(yōu)型血糖儀(美國強生);酶標儀(Synergy HT,美國Bio Tek);LabMaster呼吸代謝分析系統(tǒng)(德國TSE);電泳儀(DYY-8C,北京六一儀器廠);凝膠成像分析儀(FlourChem FC12,美國Alpha);血糖試紙(英國LifeScan Europe);BCA(bicinchoninic acid);測定試劑盒(中國博邁德);吐溫-80(美國Sigma-Aldrich);游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)試劑盒(南京建成生物工程研宄所);預制膠電泳液(中國索萊寶);PVDF(polyvinylidene fluoride)膜(美國Millipore);脫脂奶粉(美國BD);解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1;貨號bs-1925R,稀釋比例1∶1000,分子量33 ku,北京博奧森)、過氧化物酶體增殖體激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)抗體(貨號bs-4590R,稀釋比例1∶1000,分子量57 ku,北京博奧森);過氧化物酶體增殖體激活受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator 1α, PGC-1α)抗體(貨號sc-518025,稀釋比例1∶500,分子量92 ku,美國Santa Cruz);小鼠β-肌動蛋白(β-actin)抗體(貨號#3700,稀釋比例1∶1000,分子量45 ku,美國CST)。

1.2 實驗分組 實驗動物在解放軍總醫(yī)院實驗動物中心SPF級屏障環(huán)境中飼養(yǎng),溫度(25±1)℃,相對濕度(60±5)%,光照時間12 h/d,干燥通風。實驗動物均單籠飼養(yǎng),自由進食、進水。實驗動物購回后適應性喂養(yǎng)1周,然后將18只C57小鼠隨機分成3組:對照組,高脂飲食組(high fat diet,HFD)和尿石素A干預組(UA)。對照組小鼠仍采用維持飼料喂養(yǎng),HFD和UA組小鼠給予高脂飼料(60%能量由脂肪供應)喂養(yǎng)12周。期間UA組小鼠按照30 mg/(kg.d)[7]的劑量給予尿石素A灌胃(吐溫-80助溶),對照組和HFD組給予等劑量的吐溫-80灌胃。

1.3 檢測指標 (1)血液學指標檢測:實驗結束時,小鼠禁食不禁水過夜。剪尾法采血,測定空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG);腹腔靜脈采血,測血清中三酰甘油(triglycerides,TG),總膽固醇(total cholesterol,TC),高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)。試劑盒檢測血清中FFA濃度。(2)產(chǎn)熱量檢測:實驗結束前1周,將小鼠放入LabMaster 呼吸代謝分析系統(tǒng)的分析籠內,適應6 h后,記錄12 h白天和12 h黑夜的產(chǎn)熱量。采樣流速為 0.8 L/min, 每30 min采集1次數(shù)據(jù)。(3)病理學檢查:實驗結束時,腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠,取腹股溝白色脂肪組織常規(guī)固定1周,石蠟包埋切片后進行HE染色,顯微鏡下觀察并拍照。(4)qRT-PCR:Trizol 法提取心肌組織總RNA,兩步法反轉錄為cDNA并進行擴增,擴增條件為94 ℃預變性3 min,94 ℃變30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,擴增30個循環(huán),最后72 ℃ 延伸10 min?；蛞镉缮虾Ｓ⒔芄竞铣蒣10]。(5)Western blot:取出凍存的脂肪組織粉碎,加入300 μl 含PMSF的 RIPA裂解液裂勻漿,用移液器將裂解液吸至1.5 ml ep管(冰上操作)中。在4 ℃,12 000 g的條件下離心15 min,吸取上清液迅速轉移至新的ep管,此即為提取的總蛋白。取30 μg總蛋白上樣后進行電泳,220 nm的條件下轉膜2 h,室溫封閉2 h,分別滴加特異性一抗(UCP1,PPARγ,PGC-1α與β-actin)封閉過夜,再以辣根過氧化物酶標記的二抗封閉2 h。化學發(fā)光劑染色、顯影,采用BandScan 5.0軟件分析膠片灰度。所有實驗至少重復3次。

2 結 果

2.1 尿石素A干預對高脂飲食小鼠體質量及代謝的影響 與對照組相比,HFD組小鼠的體質量、FPG、TG、TC、FFA和LDL顯著升高(P<0.05);與HFD組比較,UA組老齡鼠的體質量、TG、FFA和LDL明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,表1)。

表1 尿石素A干預對高脂飲食小鼠體質量及代謝的影響

2.2 尿石素A干預對高脂飲食小鼠代謝產(chǎn)熱的影響 與對照組比較,HFD組小鼠日間產(chǎn)熱量和夜間產(chǎn)熱量均顯著降低(P<0.05;表2),而尿石素A干預能明顯升高老齡鼠的日間和夜間產(chǎn)熱量,與HFD組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 尿石素A干預對高脂飲食小鼠體重及代謝的影響

2.3 尿石素A干預對高脂飲食小鼠白色脂肪組織形態(tài)的影響 與對照組相比,HFD組小鼠白色脂肪組織細胞體積增大,而尿石素A干預能明顯降低高脂飲食老齡鼠白色脂肪細胞的體積(圖1)。

2.4 尿石素A干預對HFD組小鼠白色脂肪棕色化基因轉錄與表達的影響 如圖2所示,與對照組相比,HFD組小鼠白色脂肪組織棕色化基因PGC-1α轉錄表達下調, UCP1、PPARγ、PGC-1α蛋白的表達顯著降低(P<0.05),而尿石素A干預顯著上調白色脂肪組織棕色化基因UCP1、PPARγ與PGC-1α轉錄與蛋白表達水平(P<0.05,表3)。

圖1 尿石素A干預對高脂飲食小鼠白色脂肪組織形態(tài)的影響(HE,×200)

圖2 尿石素A干預對高脂飲食小鼠白色脂肪棕色化蛋白表達的影響

表3 尿石素A對高脂飲食小鼠白色脂肪棕色化基因轉錄與表達的影響

3 討 論

肥胖癥是一種多因素疾病,與遺傳、環(huán)境、內分泌調節(jié)紊亂、炎癥、腸道菌群等因素均有關系,其發(fā)生機制是能量攝入超過能量消耗。肥胖癥治療的中心環(huán)節(jié)是減少熱量的攝取或增加熱量的消耗。既往研究表明,尿石素A具有抗腫瘤、抗炎和抗衰老等多種生物學作用[12-15],而且對肥胖癥及其相關疾病發(fā)揮有益的保護作用,但其具體作用機制尚不清楚[7, 8]。本研究發(fā)現(xiàn),尿石素A通過促進白色脂肪棕色化來增加能量消耗進而防治肥胖癥,但對能量攝入無影響。

哺乳動物的脂肪組織類型主要分為白色脂肪組織和棕色脂肪組織,白色脂肪組織主要的生理功能是以三酰甘油的形式儲存能量,而棕色脂肪組織主要的生理功能是以非戰(zhàn)栗方式產(chǎn)熱。棕色脂肪的代謝產(chǎn)熱量巨大,是新生兒在寒冷條件下維持體溫的重要方式。但是,成人體內棕色脂肪組織含量很少。在一定條件下,白色脂肪組織可以向棕色脂肪組織轉化,亦即白色脂肪棕色化,如何促進白色脂肪棕色化是減重研究的重要方向之一[16]。本研究發(fā)現(xiàn),尿石素A干預能促進肥胖老齡鼠白色脂肪棕色化并降低其體質量,可能的機制如下:(1)白色脂肪細胞胞質內通常可見1個大脂滴,而棕色脂肪細胞胞質內則有諸多小脂滴。尿石素A干預明顯減少肥胖小鼠白色脂肪細胞的體積。(2)UCP1、PPARγ與PGC-1α是棕色脂肪細胞分化調控的重要分子[10],UCP1是棕色脂肪細胞線粒體內膜上的解耦聯(lián)蛋白,當H+順濃度梯度沿UCP1返回線粒體基質時,使得經(jīng)線粒體呼吸鏈電子傳遞建立的質子跨膜電-化學勢能以熱能的形式釋放出來,而不用于合成ATP。PPARγ是脂肪組織高表達的核受體,與脂肪細胞分化、棕色脂肪組織形成密切相關[17]。既往研究表明,PPARγ激動劑羅格列酮能促進寒冷環(huán)境中C57小鼠燃脂產(chǎn)熱[18]。PGC-1α在棕色脂肪組織中高表達,在白色脂肪組織中低表達。在白色脂肪組織中過表達PGC-1α可使其獲得棕色脂肪組織的某些特征,如線粒體增多、脂肪酸氧化增強等[19]。而且,PGC-1α的代謝產(chǎn)物鳶尾素也能促進白色脂肪的棕色化[20]。本研究發(fā)現(xiàn),尿石素A干預從轉錄和翻譯兩個層面促進UCP1、PPARγ與PGC-1α的表達。(3)因老齡鼠比年輕鼠在高脂飲食條件更容易發(fā)生肥胖[21],因此本研究以18月齡老齡小鼠為研究對象。尿石素A干預可以減少肥胖老齡鼠的體質量,而且與小鼠的進食與排泄量無關。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),尿石素A能促進肥胖小鼠白色脂肪棕色化,可能是防治肥胖癥的一種有效干預措施。但對于尿石素A促進白色脂肪棕色化的確切作用機制還不十分清楚。既往研究提示,線粒體自噬是維持棕色脂肪組織生理功能所必需的[22, 23],而尿石素A是一種線粒體自噬激活劑[15, 24],尿石素A是否通過調節(jié)線粒體自噬促進白色脂肪棕色化值得進一步探討。