JS-K對口腔鱗狀細胞癌H157和CAL-27細胞增殖與凋亡的影響及機制實驗研究

高晨峰,劉 斌,陳小鳳,廖衛國,黃小杰,楊 騰,于立明,蘭 青

(1.廣東醫科大學附屬醫院肝膽外科,廣東 湛江 524001;2.廣東醫科大學附屬醫院臨床醫學研究中心,廣東 湛江 524001;3.廣東醫科大學附屬醫院口腔科,廣東 湛江 524001)

口腔鱗狀細胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是世界范圍內導致死亡的常見癌癥之一,以分化和選擇性淋巴結轉移為特征[1-2]。由于風險因素暴露、高病死率和低治愈率,OSCC被公認為是一個全球公共衛生問題,給個人和社會帶來巨大的經濟負擔[3-4]。因此,研究潛在抗腫瘤藥物的分子機制可能有助于探索和開發有效的抗OSCC治療策略。

細胞凋亡是程序性細胞死亡的主要類型,通過一系列生化事件最終導致細胞死亡[5]。凋亡可通過外源性死亡受體相關途徑和(或)內源性細胞器修飾途徑誘導。線粒體凋亡途徑受B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白家族調控,如抗凋亡Bcl-2蛋白和促凋亡蛋白Bak和Bax。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)在細胞凋亡調控中起關鍵作用,可分為啟動子Caspase (Caspase-8/9)和執行子Caspases (Caspase-3/6/7)[6-7]。細胞周期依次經歷G1、S、G2和M四個階段。細胞周期阻滯與腫瘤細胞的增殖密切相關,這一現象被認為是藥物化學預防或抗腫瘤活性的標志。據報道,G2/M檢查點是腫瘤治療的重要靶點,而細胞周期由細胞周期調節蛋白介導,如細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin-dependent kinase,CDK)、p21、p18和p27[8]。此外,細胞周期由激酶家族的各種保守蛋白調節。例如,絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)與細胞周期、細胞增殖和凋亡的調控有關。這些激酶的一個主要亞群p38 MAPK是各種抗癌藥物引發腫瘤細胞凋亡所必需的[9-10]。因此,p38 MAPK可能被用于開發一種新的治療策略,通過激活凋亡和細胞周期進程抑制通路來對抗OSCC。

活性氧(Reactive oxygen species,ROS)是細胞內氧的天然代謝產物,在激活細胞內信號轉導通路和維持細胞穩態方面發揮重要作用。ROS還可調控腫瘤中的多種事件,如細胞增殖、細胞周期進展、分化、免疫反應、凋亡和遷移[11]。ROS水平升高已被證實是許多化療藥物特殊事件的潛在機制[12-13]。而一氧化氮(Nitric oxide,NO)作為一種重要的信號分子,在腫瘤生物學中起著關鍵作用,如細胞遷移、腫瘤生長、腫瘤侵襲和血管生成控制。NO前體化合物JS-K可通過增加ROS水平對各種類型的癌癥(如非小細胞肺癌、前列腺癌和膀胱癌)發揮抗腫瘤作用。已有研究[12]報道,JS-K對腫瘤細胞具有選擇性細胞毒性,但對正常細胞未見明顯毒性。雖然這些研究表明JS-K可能作為一種潛在的抗癌化療藥物,但其對OSCC的影響尚未被徹底研究。因此,在本研究中,我們旨在探討JS-K在OSCC細胞中的抗腫瘤作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 OSCC細胞株H157、SCC4和CAL-27購自上海桐派生物科技有限公司。所有細胞在RPMI 1640培養基中培養,其中包含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)。細胞置于37 ℃、含有5% CO2飽和濕度培養箱中培養。當細胞達到對數生長階段時,用于實驗。

1.2 主要試劑 JS-K(貨號:J4137)購自Sigma-Aldrich[使用二甲基亞砜(DMSO)制備的JS-K(20 mmol/L)原液,-20 ℃保存,實驗前使用RPMI 1640培養基進一步稀釋原液];細胞ROS/活性氮(RNS)檢測試劑盒(貨號:ab139473) 購自Abcam[試劑盒包括ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)和氧化應激檢測試劑(綠色)];p38 MAPK抑制劑SB202190和SB203580(SB)購自Med Chem Express;GAPDH抗體(貨號:2218)、p21抗體(貨號:2947)、p18抗體(貨號:2896)、cyclin B1抗體(貨號:4138)、cyclin D1抗體(貨號:2978)、cyclin D3抗體(貨號:2936)、CDK2抗體(貨號:2546)、CDK4抗體(貨號:12790)、多聚ADP核糖聚合酶(PARP)抗體(貨號:9542)、Bcl-2抗體 (貨號:2876)、Bax抗體 (貨號:2772)、細胞色素C(Cyt C)抗體(貨號:4272)、p38抗體 (貨號:9212)、p-p38抗體 (貨號:4511)和Cdc2抗體 (貨號:9112)均購自Cell Signaling Technology;細胞周期分析試劑盒(貨號:C1052) 購自碧云天生物技術公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞活力測定:采用MTT實驗評價JS-K對OSCC的生長抑制作用。將H157、SCC-4和CAL-27細胞以每孔7 × 103個的初始密度種于含有0.1 ml培養基的96孔板上,孵育過夜。待細胞貼壁后,按梯度給藥的方式(0、0.5、1、2.5、5、10、20 μmol/L)處理細胞,每個濃度設置6個復孔,培養24 h或48 h。隨后,每孔中加入20 μl MTT (5 mg/ml),孵育4 h。去除上清液,加入100 μl DMSO溶解甲臜結晶。使用Multiskan MK3微孔板閱讀器測量492 nm波長處吸光度值。統計結果將每個濃度的吸光度與對照組對比并歸一化(對照,100%)。

1.3.2 Western blot分析:按指定方法處理后,用PBS清洗細胞2次,并在含有PMSF的RIPA裂解液中裂解。蛋白質(每組30 μg)在10%聚丙烯酰胺凝膠上分離,轉移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶在TRIS緩沖鹽和1%吐溫于室溫下1 h以阻斷膜的非特異性結合。然后,膜使用p21、GAPDH、p18、cyclin B、cyclin D1、cyclin D3、CDK2、CDK4、PARP、Bcl-2、Bax、Cyt C、p38、p-p38和Cdc2等一抗(1∶1000)在4 ℃孵育過夜,洗滌3次后使用二抗(1∶2000)在4 ℃孵育4 h。最后,在清洗膜3次后,使用Tanon 5200儀器進行檢測。

1.3.3 細胞凋亡檢測:使用膜聯蛋白V-熒光素異硫氰酸酯(Annexin V-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒進行細胞凋亡評估。細胞以3×105個/孔的初始密度種于6孔板上,并使用適量(0、1.25、2.5、5 μmol/L)JS-K處理24 h。將每組細胞1×105個重懸于100 μl Annexin V-FITC結合緩沖液中,加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶(PI),黑暗孵育15 min。加入400 μl 1×結合緩沖液,停止染色反應。采用流式細胞儀檢測樣品,并使用系統軟件進行數據分析。

1.3.4 細胞周期檢測:使用細胞周期分析試劑盒進行。將2.5×106個細胞種于6孔板上,用對應方式(0、1.25、2.5、5 μmol/L,加或不加2.5 μmol/L JS-K,加或不加15 μmol/L SB、2.5 μmol/L JS-K、400 μmol/L NAC)處理24 h。收集細胞,用70%乙醇在4 ℃下固定過夜。將細胞重懸于PBS中,加入25 μl PI,在37 ℃黑暗條件下混合30 min。最后,使用BD FACSCantoTM Ⅱ流式細胞儀檢測樣品,并使用系統軟件分析數據。

1.3.5 亞細胞分離:用對應方式(0、1.25、2.5、5 μmol/L,加或不加2.5 μmol/L JS-K,加或不加15 μmol/L SB、2.5 μmol/L JS-K、400 μmol/L NAC)處理24 h后收集細胞。細胞在1 ml含有線粒體分離試劑中溶解15 min,然后對細胞懸液進行勻漿。4 ℃條件下以600 g離心10 min后取上清,再以11000 g離心10 min。棄上清,將顆粒重懸在線粒體提取緩沖液中。

1.3.6 Caspase-3/7活性測定:H157和CAL-27細胞用對應方式(0、1.25、2.5、5 μmol/L,加或不加2.5 μmol/L JS-K,加或不加15 μmol/L SB、2.5 μmol/L JSK、400 μmol/L NAC)處理24 h后,收集貼壁與漂浮的細胞。然后,將每組約6×104個細胞以100 μl PBS轉移到1.5 ml試管中。每管中加入100 μl Caspase-Glo試劑,在室溫下黑暗孵育1 h。樣品的發光值使用Sirius L管發光計進行檢測。統計結果將每個濃度(用0、1.25、2.5、5 μmol/L)發光值與對照組對比并歸一化(對照,100%)。

1.3.7 ROS檢測:H157細胞和CAL-27細胞(2.5×106個)分別在6孔板上孵育過夜。然后,用JS-K(0、1.25、2.5、5 μmol/L)培養細胞24 h。處理完成后,PBS洗滌并收集細胞,200 g離心3 min。隨后,用1∶2500的氧化應激檢測試劑(綠色)培養細胞,轉移到96孔板上,37 ℃培養60 min。最后,使用多功能酶標儀在488 nm激發波長和520 nm發射波長下測量熒光。統計結果將每個濃度的發光值與對照組對比并歸一化(對照,100%)。

1.3.8 平板克隆實驗:將H157細胞和CAL-27細胞(2.5×106個)分別種于6孔板上,分別用0、1.25、2.5、5 μmol/L JS-K處理,加或不加2.5 μmol/L JS-K和加或不加15 μmol/L SB、2.5 μmol/L JS-K、400 μmol/L NAC,孵育24 h后收集每組細胞并進行量化。每組大約400個H157細胞和600個CAL-27細胞種于含有無藥物培養基的6孔板上進行集落形成試驗。每隔3 d更換1次培養基。培養7 d后,菌落在4%多聚甲醛中固定15 min,PBS洗滌2次,0.5%結晶紫溶液染色10 min,超純水洗滌3次,用相機拍攝。

1.4 統計學方法 使用Graph Pad Prism 5和SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析,多組間比較采用方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 JS-K對OSCC細胞增殖的影響 見圖1～3。MTT實驗結果表明,JS-K以濃度依賴方式降低細胞活力,H157和CAL-27細胞對JS-K處理表現出更高的敏感性。同時,JS-K處理組觀察到不同程度的細胞凋亡。為了證實JS-K對H157和CAL-27細胞的增殖有抑制作用,進行了平板克隆實驗,結果顯示JS-K處理后H157和CAL-27細胞菌落數量較對照組減少。

注:與JS-K 0 μmol/L比較,*P<0.05

圖2 JS-K干預后H157、CAL-27細胞凋亡情況(Annexin V/PI染色,×200)

2.2 JS-K對OSCC細胞凋亡的影響 見圖4～6。流式細胞儀檢測結果顯示,JS-K對H157和CAL-27細胞均有凋亡誘導作用。Western blot結果顯示,JS-K上調促凋亡蛋白Cleaved-PARP、Bax、Cyt C和Cleave-caspase 9表達,而下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達;此外,線粒體中Cyt C表達下調。同時,JS-K還可促進Caspases-3/7活性,而兩者與細胞凋亡密切相關。

圖4 JS-K干預后H157、CAL-27細胞凋亡流式細胞儀檢測結果

圖5 JS-K干預后H157、CAL-27細胞凋亡相關蛋白Western blot結果

注:與JS-K 0 μmol/L比較,*P<0.05

2.3 JS-K對OSCC細胞周期的影響 圖7～9。流式細胞儀檢測結果顯示,JS-K在H157和CAL-27細胞的G2/M期誘導細胞周期停滯。Western blot檢測結果顯示,在H157和CAL-27細胞中,JS-K可上調p21、p18、CDK2、cyclin B1、cyclin D1、cyclin D3和cyclin E1表達,下調Cdc2和CDK4表達。

圖7 JS-K干預后H157、CAL-27細胞周期檢測結果

注:與JS-K 0 μmol/L比較,*P<0.05

圖9 JS-K干預后細胞周期相關蛋白和p38 MAPK信號通路蛋白Western blot結果

2.4 JS-K通過調控p38 MAPK信號通路誘導細胞凋亡 見圖10～13。JS-K和SB聯合使用降低了細胞凋亡水平,增加了細胞集落形成。Western blot結果顯示SB可逆轉JS-K下調H157和CAL-27細胞Bcl-2,上調Bax、Cyt C、Cleaved-PARP和Cleaved-caspase 9的作用。同時,Caspase-3/7活性水平下調。

圖10 JS-K和(或)SB干預后H157、CAL-27細胞凋亡情況(Annexin V/PI染色,×200)

圖11 JS-K和(或)SB干預后H157、CAL-27細胞平板克隆實驗結果(結晶紫染色)

圖12 JS-K和(或)SB干預后H157、CAL-27細胞凋亡相關蛋白Western blot結果

注:與JS-K 2.5 μmol/L比較,*P<0.05

2.5 JS-K通過調控p38 MAPK信號通路誘導細胞周期阻滯 見圖14～16。細胞周期分布圖譜顯示,使用JS-KH157、CAL-27細胞系似乎都被阻滯在細胞周期的G2/M期,而使用p38 MAPK抑制劑SB202190和SB202580可緩解這種情況。使用SB202580后,Western blot分析結果與細胞周期評價結果一致。SB202580逆轉了JS-K誘導的細胞周期蛋白表達的激活,包括p18、p21、cyclin D1、cyclin D3、cyclin B1、CDK2和CDK4。

圖14 JS-K和(或)SB干預后H157、CAL-27細胞周期檢測結果

注:與JS-K 2.5 μmol/L比較,*P<0.05

2.6 JS-K通過調控ROS觸發p38 MAPK通路誘導細胞周期阻滯 見圖17～21。JS-K增加了H157和CAL-27細胞的ROS活性。經JS-K處理的細胞形態分析顯示細胞凋亡水平較高,而經JS-K和NAC處理的細胞凋亡水平較低。與單純的JS-K處理(2.5 μmol/L)比較,ROS抑制劑NAC (400 μmol/L)在JS-K處理前預孵育H157和CAL-27細胞1 h后,p-p38表達減少。這些結果有力地表明,JS-K誘導的ROS導致OSCC細胞中p38 MAPK通路激活。此外,流式細胞術分析顯示,NAC明顯逆轉了H157和CAL-27細胞中JS-K誘導的G2/M期細胞周期阻滯。

注:與JS-K 0 μmol/L比較,*P<0.05

圖18 JS-K和(或)NAC干預后H157、CAL-27細胞凋亡情況(Annexin V/PI染色,×200)

圖20 JS-K和(或)NAC干預后H157、CAL-27細胞周期檢測結果

注:與JS-K 2.5 μmol/L比較,*P<0.05

3 討 論

JS-K是目前正在開發的一種很有前景的抗癌藥物,可以抑制癌細胞增殖,對各種類型的腫瘤細胞有選擇性的細胞毒作用。

研究[14]表明,JS-K可通過激活ROS在多種癌癥類型中誘導細胞周期阻滯和凋亡。然而JS-K對OSCC的抗癌作用尚未見報道[15-17]。在本研究中,MTT和平板克隆實驗結果顯示,JS-K對H157和CAL-27細胞具有抗增殖作用,說明JS-K對OSCC細胞具有一定程度的細胞毒作用。Annexin V/PI染色結果證實,JS-K以濃度依賴性方式誘導H157和CAL-27細胞凋亡,提示JS-K可誘導細胞凋亡。細胞凋亡作為一種生理途徑,在清除受損或感染細胞以維持組織穩態方面起著關鍵作用。

為進一步研究JS-K誘導H157和CAL-27細胞凋亡的機制,我們評估了常見的凋亡調節因子。Bcl-2家族蛋白不僅在線粒體水平誘導細胞凋亡,而且在非線粒體位點也有作用。此外,Bcl-2可以通過調節線粒體動力學和代謝在未死亡的細胞中發揮生理作用。Bcl-2水平的降低與凋亡刺激引發的細胞死亡有關。與Bcl-2單獨表達水平相比,Bcl-2/Bax與細胞凋亡誘導的關系更為密切[6,18]。在本研究中,JS-K可通過下調Bcl-2和上調Bax(即降低Bcl-2/Bax比值)誘導H157和CAL-27細胞凋亡。Caspase-3作為一種劊子手Caspase,可被死亡配體和線粒體功能障礙誘導激活[19]。PARP與DNA復制和轉錄有關,而效應子Caspases(Caspases-3/7/9)可調控并裂解PARP,導致細胞收縮和DNA斷裂,最終刺激細胞死亡信號[20]。

在本研究中,我們觀察到在JS-K處理H157和CAL-27細胞24 h后,Caspase-3/7/9激活和p-PARP上調,而用SB(15 μmol/L)預處理后,Caspases-3/7/9下調,p-PARP活性被抑制。這些結果表明,JS-K可通過線粒體介導的凋亡途徑選擇性誘導H157和CAL-27細胞凋亡。

研究表明,細胞周期進程可以控制細胞增殖,細胞周期的每個階段都包括可以啟動修復機制的檢查點,而腫瘤細胞更依賴于G2檢查點來抵御DNA損傷。細胞周期進程與CDKs相關。其中,Cdc2也被稱為CDK-1,控制哺乳動物細胞的G2/M轉變,cyclin蛋白可以通過與CDKs形成復合物激活。Cdc2-cyclin B復合物調節G2/M期的細胞周期進程[21]。DNA合成由CDK4/6-cyclin D復合物控制。此外,G1/S和S/G2轉變由CDK2-cyclin E/A復合物介導。p21、p27和p18是CDK抑制劑,它們可以調節細胞周期及DNA復制和修復[8]。在使用JS-K處理H157和CAL-27細胞24 h后,CDK2蛋白表達下降,p18和p21蛋白表達上升,提示JS-K在H157和CAL-27細胞中誘導細胞周期停滯在了G2/M期。

p38 MAPK是MAPK家族成員,在細胞應激反應中起關鍵作用,與細胞凋亡相關[22]。作為DNA損傷信號通路的重要組成部分,p38 MAPK通路的作用在過去十年中得到了重視。細胞周期檢查點G2/M和較小程度的G1/S是由p38 MAPK激活介導的[23]。p38 MAPK通路可被多種化療藥物激活,并與癌細胞凋亡相關[24]。p38磷酸化程度是決定細胞死亡和存活的重要因素。此外,p38的過度激活會導致細胞損傷[25]。本研究表明,JS-K處理提高了p-p38的水平,而在JS-K處理組中p38蛋白的表達沒有明顯變化。此外,p38 MAPK信號的抑制中斷了JS-K誘導的H157和CAL-27細胞凋亡和細胞周期阻滯。以上表明,JS-K通過調節p38 MAPK通路誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯。

ROS的生成在正常生理條件下受到嚴格的調控。ROS同時參與復雜的信號網絡。然而,過多的ROS產生會導致細胞損傷。癌細胞通常會產生和維持比正常細胞更高水平的ROS。一旦細胞內ROS水平升高,癌細胞對正常細胞更加敏感。因此,提高ROS水平是一種潛在的治療癌癥的策略[26]。本研究揭示了JS-K誘導OSCC細胞產生ROS。此外,高水平的細胞內ROS可能是OSCC細胞誘導凋亡的主要機制之一,因為ROS清除劑NAC對細胞的預處理顯著逆轉了細胞凋亡誘導的變化。眾所周知,過多的ROS生成可以激活p38 MAPK通路。為了研究p38 MAPK通路是否與JS-K誘導的凋亡有關,我們評估了H157和CAL-27細胞中關鍵p38 MAPK通路蛋白的表達。JS-K處理顯著激活了兩種細胞系的p38 MAPK通路。此外,我們發現NAC預處理顯著逆轉了JS-K誘導的H157和CAL-27細胞中p-p38的上調。這些結果表明,在H157和CAL-27細胞中,細胞內ROS積累導致p38 MAPK信號通路激活。

綜上所述,JS-K通過p38 MAPK信號通路調控ROS,誘導OSCC細胞周期阻滯在G2/M期并凋亡,最終抑制OSCC細胞增殖。JS-K可能為一種治療OSCC的潛在藥物。