含SH2結構域蛋白酪氨酸磷酸酶2表達變化對肝纖維化大鼠肝組織中細胞外信號調節激酶1/2活性的影響

郝禮森,潘恩亮,季景秀,苗笑佳,蔣美鈺,王 薇,劉 甜,高瑩瑩

(華北理工大學附屬醫院消化內科,河北 唐山 063000)

肝纖維化是肝臟受到損傷后的修復反應,可進展為肝硬化,而肝星狀細胞是參與肝纖維化的最重要細胞[1-3]。含SH2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology 2-containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2)是具有促癌作用的蛋白酪氨酸磷酸酶,其過表達可通過增強細胞外信號調節激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)的活性促進腫瘤細胞增殖,參與多種腫瘤的病理過程[4]。近年來研究發現,SHP2除在多種腫瘤的病理過程中發揮重要作用外,也參與了某些非腫瘤性疾病的病理過程。研究發現,在四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化病程中,肝組織SHP2表達逐漸升高[5-6];下調體外活化大鼠肝星狀細胞SHP2表達可顯著抑制其增殖[7]。另有研究[8]發現,ERK1/2信號通路參與了對活化肝星狀細胞增殖的調控。目前,SHP2表達變化對纖維化肝組織中ERK1/2的影響尚不清楚。因此,本研究探討SHP2過表達及低表達對肝纖維化大鼠肝組織中ERK1/2活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠160只,體重350～400 g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,質量合格證編號:11501300046788。所有大鼠均按照清潔級要求飼養,自由飲食和進水。實驗動物倫理經華北理工大學實驗動物倫理委員會審批。

1.2 主要試劑 表達綠色熒光蛋白(GFP)的空病毒Ad-GFP、表達野生型SHP2及GFP的腺病毒Ad-SHP2、表達GFP及靶向SHP2的RNA干擾序列——短發夾RNA(shRNA)的腺病毒Ad-shRNA/SHP2由上海漢恒生物科技公司協助構建;兔抗SHP2多克隆抗體(批號:ET1611-35,武漢Abclonal公司);小鼠抗磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)單克隆抗體(批號:16443-1-AP,北京安諾倫生物科技有限公司);小鼠抗ERK1/2單克隆抗體(批號:381050,北京安諾倫生物科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠肝纖維化模型構建:160只健康雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、Ad-GFP組、Ad-SHP2組和Ad-shRNA/SHP2組,每組32只。將50%四氯化碳橄欖油混合液腹腔注射入模型組、Ad-GFP組、Ad-SHP2組及Ad-shRNA/SHP2組大鼠,每次1 ml/kg,2次/周,共8周[9]。對照組腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。每周將滴度為2×109pfu/ml的Ad-GFP、Ad-SHP2及Ad-shRNA/SHP2腺病毒自大鼠尾靜脈分別注射入Ad-GFP組、Ad-SHP2組及Ad-shRNA/SHP2組大鼠[10]。在造模第2、4、6、8周,每組選取8只大鼠取適量肝組織,一部分用于Western blot及實時熒光定量PCR檢測,另一部分于4%多聚甲醛固定后用于Masson三色及HE染色和免疫組織化學染色。

1.3.2 HE染色和Masson三色染色:采用HE染色觀察大鼠肝組織病理學變化。采用Masson三色染色觀察大鼠肝組織膠原沉積。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測SHP2和ERK1 mRNA表達:提取肝組織總RNA,反轉錄合成cDNA。SHP2、ERK1及內參3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物序列由賽默飛世爾科技公司合成。其中,SHP2正向引物序列為5’-CTTGGTGAGTGAGTAGAT-3’,反向引物序列為5’-CTTACGGCAGAACATTAG-3’;ERK1正向引物序列為5’-GGCTCACCCTTACCTGGAAC-3’,反向引物序列為5’-GTCCAAAAGGACAGGGGGT-3’;GAPDH正向引物序列為5’-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3’,反向引物序列為5’-AGGAAAAGCATCACCCGGAG-3’。在PCR儀上定量擴增,采用2-ΔΔCt法計算大鼠肝組織SHP2、ERK1 mRNA相對表達量[11]。

1.3.4 免疫組化染色檢測SHP2蛋白表達水平:采用SP法進行SHP2免疫組織化學染色,陰性對照用PBS代替一抗,棕褐色為陽性表達。用Image Pro Plus 6.0軟件分析染色圖像,以積分光密度值 (IOD)表示SHP2陽性表達水平。

1.3.5 Western blot法檢測ERK1和p-ERK1蛋白表達:取約100 mg大鼠肝組織剪碎,置于EP管中,加入1 ml改良PIPA裂解緩沖液震蕩研勻,提取蛋白。測定蛋白含量后取一定量蛋白,添加適量上樣緩沖液,經10% SDS-PAGE凝膠電泳后,用水浴式電轉儀轉至硝酸纖維素膜上,加封閉液4 ℃封閉2 h。分別加入小鼠抗GAPDH單克隆抗體(1∶5000稀釋)、小鼠抗ERK1/2單克隆抗體(1∶500稀釋)和小鼠抗p-ERK1/2單克隆抗體(1∶500稀釋),4 ℃過夜。TPBS漂洗后加入HRP標記的山羊抗鼠IgG二抗(1∶5000稀釋),37 ℃孵育2 h。TPBS漂洗后加入ECL顯影液顯色成像,采用Image J 圖像處理軟件分析,ERK1及p-ERK1蛋白表達量用二者的IOD與GAPDH的IOD比值表示。

2 結 果

2.1 各組大鼠肝組織病理形態學及膠原沉積變化 見圖1。HE及Masson三色染色結果顯示,對照組大鼠肝組織無炎癥細胞浸潤,肝細胞及肝小葉正常,匯管區及小葉間隔有少量纖維沉積,肝小葉中央靜脈壁可見纖維染色;模型組、Ad-GFP組、Ad-SHP2組以及Ad-shRNA/SHP2組大鼠肝組織隨時間延長逐漸出現炎癥細胞浸潤、細胞變性壞死、正常肝小葉結構消失,甚至出現假小葉,膠原沉積逐漸增加。在同一造模時間點比較,模型組與Ad-GFP組間上述變化無明顯差異;與模型組及Ad-GFP組比較,Ad-SHP2組上述病理變化及膠原沉積更明顯,而Ad-shRNA/SHP2組減輕。

圖1 各組大鼠造模第6周肝組織HE染色及Masson三色染色結果(×400)

2.2 不同造模時間點各組大鼠肝組織SHP2表達變化 見表1、2(圖2)。在不同造模時間點(第2、4、6、8周)對各組大鼠肝組織SHP2 mRNA表達及蛋白陽性表達IOD比較,模型組、Ad-GFP組、Ad-SHP2組及Ad-shRNA/SHP2組在各造模時間點明顯高于對照組(均P<0.05),Ad-GFP組與模型組在各造模時間點比較差異無統計學意義(均P>0.05),Ad-SHP2組在各造模時間點較Ad-GFP組及模型組升高(均P<0.05),而Ad-shRNA/SHP2組在各造模時間點較Ad-GFP組及模型組降低(均P<0.05)。

表1 各組大鼠肝組織不同造模時間點SHP2 mRNA表達比較

表2 各組大鼠肝組織不同造模時間點SHP2蛋白陽性表達IOD比較

2.3 不同造模時間點各組大鼠肝組織ERK1表達變化 見表3、4。在不同造模時間點(第2、4、6、8周)比較,模型組、Ad-GFP組、Ad-SHP2組及Ad-shRNA/SHP2組ERK1 mRNA及蛋白表達高于對照組(均P<0.05);但上述四組間比較差異無統計學意義(均P>0.05)。

表3 各組大鼠肝組織不同造模時間點ERK1 mRNA表達比較

表4 各組大鼠肝組織不同造模時間點ERK1蛋白表達水平比較

2.4 不同造模時間點各組大鼠肝組織p-ERK1蛋白表達變化 見表5(圖3)。在不同造模時間點(第2、4、6、8周)對各組大鼠肝組織p-ERK1蛋白表達比較,模型組、Ad-GFP組、Ad-SHP2組及Ad-shRNA/SHP2組在各造模時間點高于對照組(均P<0.05),Ad-GFP組與模型組在各造模時間點比較差異無統計學意義(均P>0.05),Ad-SHP2組在各造模時間點較Ad-GFP組及模型組升高(均P<0.05),Ad-shRNA/SHP2組在各造模時間點較Ad-GFP組及模型組降低(均P<0.05)。

表5 各組大鼠肝組織不同造模時間點p-ERK1蛋白表達比較

圖3 各組大鼠肝組織p-ERK1蛋白電泳圖

3 討 論

ERK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的重要成員,MAPK/ERK信號通路是一種進化保守的信號級聯,在細胞存活、分化、增殖及凋亡的調控中發揮重要作用,其活化可促進細胞增殖,抑制細胞凋亡[12-14]。本研究利用腺病毒載體將靶向SHP2的shRNA及外源性野生型SHP2基因導入四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠,發現SHP2低表達及過表達對大鼠纖維化肝組織中ERK1/2的表達沒有影響,但SHP2低表達使大鼠纖維化肝組織中p-ERK1/2的表達下降,而SHP2過表達使p-ERK1/2的表達升高。因為p-ERK1/2為ERK1/2的活化形式,上述結果提示SHP2表達變化影響了大鼠肝纖維化過程中肝組織ERK1/2的活性,即SHP2低表達使大鼠纖維化肝組織中ERK1/2的活性減弱,SHP2過表達使ERK1/2的活性增強。SHP2是由原癌基因編碼的具有促癌作用的蛋白酪氨酸磷酸酶,其在腫瘤領域的研究[4,15-18]顯示,在多種惡性腫瘤如乳腺癌、肝癌、口腔鱗狀細胞癌組織中過表達,通過增強ERK1/2活性促進腫瘤細胞增殖及抑制腫瘤細胞凋亡參與腫瘤的病理過程,而下調SHP2表達可抑制腫瘤細胞ERK1/2的活性。本研究結果與SHP2在腫瘤領域的研究結果一致,提示肝組織SHP2表達變化可能通過調控ERK1/2的活性影響肝纖維化。

肝纖維化的病理特征是以膠原為主的細胞外基質在肝內的異常沉積。本研究應用Masson三色染色檢測了大鼠肝組織膠原沉積的變化,發現SHP2低表達使大鼠肝組織的膠原沉積減輕,而SHP2過表達則加重了大鼠肝組織的膠原沉積。這提示SHP2表達變化可通過調控膠原沉積影響肝纖維化。已有研究[8,19-20]發現,在大鼠肝纖維化病程中,肝組織p-ERK1/2的表達升高,ERK1/2信號通路活性增強,抑制ERK1/2信號通路則可抑制肝星狀細胞增殖,促進肝星狀細胞凋亡,減輕大鼠肝纖維化。結合本研究中SHP2表達變化對大鼠纖維化肝組織ERK1/2的影響,表明ERK1/2參與了SHP2對肝纖維化的影響,即肝組織中SHP2低表達可通過抑制ERK1/2活性使肝纖維化減輕,SHP2過表達可通過增強ERK1/2活性使肝纖維化加重。肝組織由肝細胞、肝竇內皮細胞、肝星狀細胞、枯否細胞等多種細胞組成,其中肝細胞是主要細胞,而在肝纖維化病程中發揮重要作用的肝星狀細胞僅占約15%[21]。盡管已有研究[7]發現,體外活化大鼠肝星狀細胞HSC-T6的SHP2表達下調時細胞增殖明顯受到抑制,但SHP2表達變化是通過影響肝臟哪種細胞的ERK1/2信號參與肝纖維化尚需進一步探討。

綜上所述,大鼠肝纖維化組織中SHP2過表達可通過促進ERK1/2磷酸化增強ERK1/2活性,而SHP2低表達則可通過抑制ERK1/2磷酸化降低ERK1/2活性。