布托啡諾對白細胞介素-1β誘導的關節軟骨細胞焦亡的影響及機制研究

張 玲,陳 堯,尹 航,程 超

(1.黃石市中醫醫院麻醉科,湖北 黃石435000;2.黃石市中醫醫院骨科,湖北 黃石435000)

骨關節炎(Osteoarthritis,OA)是一種常見的以軟骨退化和破壞為特征的慢性關節疾病,其病理過程主要以軟骨細胞死亡、關節炎癥、衰老為主[1]。OA患者往往因為關節僵硬、疼痛而致殘,最終導致生活質量嚴重下降,并產生巨大的經濟負擔,因此開發新藥物治療OA方法意義重大[2]。布托啡諾(Butorphanol,BT)是一種脂溶性麻醉藥,作為一種合成的阿片受體激動拮抗劑,臨床上廣泛用作鎮痛藥[3]。但研究[4]表明BT可以通過減少炎癥性浸潤損傷減輕神經元損傷及腦損傷,然而在OA治療中鮮有報道。細胞焦亡是一種由促炎介質誘導的炎癥性程序性細胞死亡,可誘導細胞破裂和細胞內容物釋放,其特征是NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)、半胱天冬酶-1(Caspase-1)激活以及白細胞介素(Interleukin-1β,IL-1β)的釋放,參與多種疾病中的進展[5]。Li等[6]研究發現,在脂多糖誘導建立小鼠膝骨關節炎軟骨細胞模型中,下調微小RNA-155(microRNA-155,miR-155)可通過抑制NLRP3/Caspase-1通路增加細胞活力,抑制小鼠膝骨關節炎軟骨細胞焦亡。但BT能否通過抑制NLRP3/Caspase-1通路對OA發展起作用尚不清楚。IL-1β作為一種促炎細胞因子,由激活的巨噬細胞、滑膜細胞產生,在OA進展中起重要作用[7]。本研究以IL-1β誘導的關節軟骨細胞建立OA體外模型,探討BT通過抑制NLRP3/Caspase-1通路對OA發生與發展的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 人關節軟骨細胞HC-a由上海通派生物科技有限公司提供。將細胞放置在含10% FBS的DMEM培養基中,培養于37 ℃、含5% CO2的培養箱中。

1.2 主要試劑 BT(批號:42408-82-2)購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司; IL-1β試劑(批號:SRP6169)、NLRP3激活劑ATP(批號:5.30657)購自Sigma-Aldrich公司;Hoechst 33342染色液/ 碘化丙啶(PI)染色液(批號:FS-79092)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α,批號:70-EK1822)及IL-6 ELISA試劑盒(批號:70-EK3062/2)購自杭州聯科生物科技有限公司;一氧化氮(NO)ELISA試劑盒(批號:fk-fv0386)購自延慕實業有限公司;反轉錄試劑盒(批號:RR037A)購自Takara公司;RIPA裂解液(批號:R0020)、MTT試劑(批號:M1020)購自北京索萊寶生物公司;兔源NLRP3(批號:ab263899)、兔源Caspase-1(批號:ab238972)、兔源IL-1β(批號:ab254360)一抗購自Abcam公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞分組與處理:取對數生長期HC-a細胞,分為對照組、IL-1β組、BT低濃度(BT-L)組、BT中濃度(BT-M)組、BT高濃度(BT-H)組、BT-H+ATP組。其中,對照組未經IL-1β處理細胞;IL-1β組經10 ng/ml IL-1β處理細胞[8]。BT-L、BT-M、BT-H組分別經10 ng/ml IL-1β處理細胞30 min后,然后經1、2、4 μmol/L BT處理細胞[9]。BT-H+ATP組經10 ng/ml IL-1β處理細胞30 min后,給予4 μmol/L BT、3 mmol/L ATP處理細胞[10]。以上各組均處理48 h后進行檢測。

1.3.2 細胞形態觀察:按照上述分組處理HC-a細胞,48 h后于倒置顯微鏡觀察各組細胞外觀形態變化。

1.3.3 MTT法檢測細胞增殖率:將HC-a細胞接種在96孔板中于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。處理對數生長期HC-a細胞后,將10 μl MTT溶液添加到96孔板中,并在37 ℃下連續孵育4 h,然后除去MTT溶液,將甲臜染料溶解在二甲亞砜中,低速振蕩10 min。于酶標儀上檢測570 nm處的光密度值(OD),計算細胞增殖率。細胞增殖率=(試驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.3.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達:收集HC-a細胞,使用TRIzol試劑提取總RNA,使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。以β-actin為參照,按照2-ΔΔCt分析NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達水平。引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.3.5 Hoechst 33342/PI染色檢測細胞焦亡變化:將HC-a細胞(2×105/ml)接種于6孔板中,用PBS洗滌細胞,在室溫下用PI溶液、Hoechst 33342溶液、細胞染色緩沖液按照1∶1∶200混合后,加入1 ml混合液進行反應,PBS洗滌3次,然后在熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.6 ELISA檢測NO、TNF-α及IL-6水平變化:收集HC-a細胞離心,取上清液按照ELISA試劑盒檢測NO、TNF-α及IL-6水平。

1.3.7 Western blot檢測細胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達水平:用預冷的PBS洗滌上述各組細胞3次,然后用RIPA裂解緩沖液在4 ℃下提取總蛋白。收集上清液,在15% SDS-PAGE電泳上分離蛋白質并進行轉膜,室溫封閉2 h。之后在4 ℃下與NLRP3、Caspase-1、IL-1β一抗孵育過夜,TBST洗膜3次,將膜與二抗在室溫下孵育2 h。通過ECL檢測試劑可視化蛋白,以β-actin為內源參照物,分析各組蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 各組細胞形態變化 見圖1。對照組HC-a細胞呈類圓形形態,胞核核仁清晰,呈圓形或橢圓形。IL-1β組細胞體積縮小、有空泡出現,核分裂現象減少。BT-L、BT-M、BT-H組細胞形態逐漸恢復,其中BT-H趨于正常化。BT-H+ATP組核分裂現象較BT-H組減少,細胞體積皺縮。

圖1 各組細胞形態變化(×400)

2.2 各組細胞增殖率比較 對照組、IL-1β組、BT-L組、BT-M組、BT-H組、BT-H+ATP組細胞增殖率依次為(100.00±0.00)%、(42.31±4.24)%、(58.84±5.89)%、(72.18±7.22)%、(89.61±8.97)%、(64.37±6.44)%。IL-1β組較對照組顯著降低(P<0.05)。BT-L組、BT-M組、BT-H組較IL-1β組顯著增加,且呈劑量依賴性(均P<0.05)。BT-H+ATP組較BT-H組顯著降低(P<0.05)。

2.3 各組細胞PI陽性細胞率比較 見圖2。對照組、IL-1β組、BT-L組、BT-M組、BT-H組、BT-H+ATP組PI陽性細胞率依次為(7.15±0.72)%、(78.51±7.86)%、(51.29±5.25)%、(38.67±3.87)%、(16.51±1.66)%、(52.37±5.24)%。與對照組比較,IL-1β組PI陽性細胞率明顯增加(P<0.05)。與IL-1β組比較,BT-L組、BT-M組、BT-H組PI陽性細胞率明顯減少,且呈劑量依賴性(均P<0.05)。與BT-H組比較,BT-H+ATP組PI陽性細胞率明顯增加(P<0.05)。

圖2 各組細胞Hoechest33342(上)、PI(中)和Merge(下)染色結果(×200)

2.4 各組細胞NO、TNF-α及IL-6水平比較 見表2。與對照組比較,IL-1β組NO、TNF-α及IL-6水平顯著升高(均P<0.05)。與IL-1β組比較,BT-L組、BT-M組、BT-H組NO、TNF-α及IL-6水平顯著降低(均P<0.05)。與BT-H組比較,BT-H+ATP組NO、TNF-α及IL-6水平顯著升高(均P<0.05)。

表2 各組細胞NO、TNF-α及IL-6水平比較(pg/ml)

2.5 各組細胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達比較 見表3。與對照組比較,IL-1β組NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達顯著升高(均P<0.05)。與IL-1β組比較,BT-L組、BT-M組、BT-H組NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達顯著下降(均P<0.05。與BT-H組比較,BT-H+ATP組NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達顯著增加(均P<0.05)。

表3 各組細胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達比較

2.6 各組細胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達比較 見表4。與對照組比較,IL-1β組NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達顯著升高(均P<0.05)。與IL-1β組比較,BT-L組、BT-M組、BT-H組NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達顯著下降(均P<0.05)。與BT-H組比較,BT-H+ATP組NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達顯著增加(均P<0.05)。

表4 各組細胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達比較

3 討 論

OA常見的癥狀包括關節疼痛和關節功能紊亂,是全世界常見的慢性退行性疾病,發病率較高,但其主要發生在老年人群中[11]。雖然OA進展緩慢,但其病理變化會影響關節中的所有組織,如軟骨下硬化、軟骨退化、關節肥大、不同程度的滑膜炎癥等,造成患者運動過程中負擔嚴重,進而影響其日常生活[12]。目前OA的病因和發病機制尚不完全清楚,但在OA的進展過程中往往伴隨著軟骨基質丟失、自噬、氧化應激、炎癥和細胞死亡等病理變化,尚未發現有藥物能阻斷OA的進展[13],因此需要關注病理變化,探討發病機制以找尋更安全有效的藥物。

BT是一種美國食品和藥物管理局批準的鎮痛劑,是一種有效的κ-阿片受體激動劑和μ-阿片受體拮抗劑,臨床應用較為廣泛。近年來的研究主要集中在BT的鎮痛作用方面,如可用作治療偏頭痛的鼻腔噴霧劑,也可用作治療中度至重度疼痛的麻醉鎮痛劑或作為全身麻醉的輔助劑[14]。除此之外,研究發現BT還具有抗炎等作用。例如,脂多糖刺激H9C2細胞后導致釋放的炎癥細胞因子增加,而BT處理后抑制了炎癥因子的釋放,為膿毒癥引起的心肌功能障礙提供潛在藥物[15];彭賽等[16]研究發現,在子宮全切手術中,BT聯合舒芬太尼可以降低患者疼痛,抑制炎癥因子水平。值得關注的是,Zhang等[17]研究證明TNF-α誘導人軟骨細胞-關節細胞衰老過程中,BT可以通過降低炎癥因子水平保護細胞免受TNF-α引起的細胞衰老,可用作治療與衰老相關的骨關節炎的潛在藥物。本研究發現,IL-1β誘導的HC-a細胞中,炎癥因子(NO、IL-6、TNF-α)水平明顯增加,細胞焦亡(PI陽性表達)增加,但細胞增殖顯著下降,經不同濃度的BT處理后,細胞增殖顯著增加,炎癥反應及細胞焦亡均被抑制,表明BT可能在OA治療中發揮抑制炎癥反應及細胞焦亡的作用,但具體機制需探索。

細胞死亡包括自噬、壞死性凋亡、細胞焦亡、鐵死亡等,其中細胞焦亡是炎癥小體觸發的促炎程序性細胞死亡,其特點是細胞膜溶解,細胞腫脹、破裂,細胞質內容物釋放到細胞外。典型激活途徑是由NLRP3炎性小體介導的,通過NLRP3響應細胞受到的刺激而被激活,募集凋亡相關斑點樣蛋白,并與pro-Caspase-1結合組裝成NLRP3炎性小體,然后炎性小體可將pro-Caspase-1切割成活化的Caspase-1,同時也可以切割IL-1β前體,促進其成熟和分泌,從而誘導細胞焦亡[18]。Zhang等[19]研究發現,阻斷NLRP3/Caspase-1軸可以減少神經病理損傷,改善細胞焦亡并緩解認知功能障礙,為治療氯胺酮相關的神經毒性提供了新研究方向。在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導的帕金森小鼠模型中[20],紅景天苷通過抑制NLRP3/Caspase-1信號通路抑制細胞焦亡,保護多巴胺能神經元。本研究發現,IL-1β誘導的HC-a細胞中IL-1β、Caspase-1、NLRP3表達顯著增加,提示激活NLRP3/Caspase-1信號通路可能與IL-1β誘導的HC-a細胞中炎癥因子及細胞焦亡產生有關。經不同濃度的BT處理后,IL-1β、Caspase-1、NLRP3表達顯著下調,炎癥因子及細胞焦亡均被抑制,推測BT可以通過抑制NLRP3/Caspase-1信號通路降低炎癥因子水平,抑制細胞焦亡。為進一步驗證上述猜想,本實驗引入NLRP3激活劑ATP,結果發現ATP逆轉了BT-H對IL-1β誘導的HC-a細胞中炎癥因子及細胞焦亡的抑制作用,提示BT通過抑制NLRP3/Caspase-1信號通路降低IL-1β誘導的HC-a細胞焦亡。

綜上所述,BT可以抑制IL-1β誘導的關節軟骨細胞焦亡,可能與抑制NLRP3/Caspase-1信號通路有關。但本研究僅在體外進行了實驗,接下來計劃在動物體內開展相關實驗,并設置抑制劑陰性對照以進一步完善該機制的研究。