甲磺酸阿帕替尼對裸鼠食管癌的抗腫瘤作用及機制研究

周 敏,張艷霞,郭 楠,田 梅

(新疆維吾爾自治區人民醫院,新疆 烏魯木齊 830001)

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤,具有較高病死率,5年生存率不足15%[1-3]。因此,探尋有效治療方式治療食管癌以改善患者預后仍是臨床研究難點。甲磺酸阿帕替尼是一種口服小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑,能夠針對性地抑制小分子血管內皮生長因子受體2(Vascular endothelial growth factor-2,VEGFR2)表達,抑制腫瘤血管生成,具有不良反應小且易控制的特點,已應用于多種癌癥如食管癌[4]、胃癌[5]等的治療。周夢耘等[6]研究顯示,甲磺酸阿帕替尼對人食管癌裸鼠移植瘤生長具有抑制作用,但具體機制尚未明確。信號轉導和轉錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是VEGFR2下游基因,對腫瘤細胞細胞周期及凋亡具有一定調控作用。張倬等[7]研究顯示,抑制STAT3通路活化能夠抑制食管癌細胞生長并誘導細胞凋亡。目前,有關甲磺酸阿帕替尼對食管癌細胞的抑癌作用是否與調控VEGFR2/STAT3通路有關少見報道,因此本研究基于VEGFR2/STAT3信號通路探究甲磺酸阿帕替尼對裸鼠食管癌的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與動物 人食管癌細胞系NEC細胞購自北京北納創聯生物技術研究院。BALB/C雌性SPF級裸鼠40只,體重20～25 g,5～6周齡,購自新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心,許可證號:SCXK(新)2021-0001。

1.2 主要試劑 甲磺酸阿帕替尼(國藥準字H20140103)購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司;5-氟尿嘧啶(5-Fu,國藥準字H37021358)購自齊魯制藥有限公司;RPMI-1640培養基購自武漢益普生物科技有限公司;原味末端轉移酶標記(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒購自弗元(上海)生物科技有限公司;蛋白提取試劑盒購自北京伊塔生物科技有限公司;兔源一抗VEGFR2、p-VEGFR2、STAT3、p-STAT3、半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)抗體(批號:ab245725、ab145056、ab68153、ab267373、ab145046)購自美國Abcam公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 裸鼠體內移植瘤模型建立[6]:NEC細胞于RPMI-1640培養基(含10%滅活胎牛血清,標準條件)中培養。取對數期細胞,消化、重懸后制成細胞懸液,將2 ml細胞密度為5×106個/ml的細胞懸液,推注于裸鼠背部右側臀部皮下,每日觀察裸鼠飲食情況及腫瘤生長情況,當出現約5 mm皮下硬質結節時表明模型建立成功。

1.3.2 分組與處理:取建模成功的40只移植瘤裸鼠隨機分為荷瘤組、實驗A組、實驗B組、5-氟尿嘧啶(5-Fu)組,每組10只,均于模型建立成功后進行藥物處理。其中,實驗A、B組分別按照體重換算裸鼠用藥劑量,給予每天8.3、16.6 mg/kg甲磺酸阿帕替尼灌胃處理[8],連續4周;荷瘤組于同時間灌胃等量0.9%氯化鈉溶液;5-Fu組于同時間腹腔注射130 mg/kg的5-Fu溶液[9]。藥物處理后,每4 天觀察并記錄腫瘤長、短徑(a、b),計算腫瘤體積繪制生長曲線圖。觀察第4周末時,處死裸鼠,完整剝離腫瘤組織并稱重,計算腫瘤抑制率。腫瘤體積=π/6×a2×b,其中π取3.14。腫瘤抑制率=(荷瘤組瘤體質量-實驗組瘤體質量)/荷瘤組瘤體質量×100%。

1.3.3 原位末端轉移酶標記(TUNEL)法檢測腫瘤組織細胞凋亡情況[10]:取腫瘤組織,固定、石蠟包埋后切片(厚6 μm),根據TUNEL檢測試劑盒說明書檢測,光學顯微鏡下觀察計數,細胞核為棕色或棕褐色為細胞凋亡陽性。每張玻片隨機選取5個視野,統計凋亡細胞數、腫瘤細胞總數,取平均值,計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數/腫瘤細胞總數×100%。

1.3.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測移植瘤組織VEGFR2、STAT3、Caspase-3 mRNA表達[11]:取腫瘤組織制備勻漿,TRIzol試劑盒提取總RNA,反轉錄為cDNA。根據RT-qPCR試劑盒說明書設定反應條件。以β-actin為內參,以2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.3.5 免疫印跡法檢測移植瘤組織VEGFR2、p-VEGFR2、STAT3、p-STAT3、Caspase-3蛋白表達[12]:取腫瘤組織,制備勻漿,裂解,提取總蛋白,電泳、轉膜、脫脂牛奶(5%)封閉,加入兔抗鼠VEGFR2、p-VEGFR2、STAT3、p-STAT3以及Caspase-3一抗(1∶500),4 ℃過夜,清洗,加入HRP標記的山羊抗兔二抗(1∶1000)孵育1 h,顯色、成像,以蛋白條帶灰度值計算蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 食管癌荷瘤鼠模型構建情況 裸鼠接種NEC細胞第5 天時,皮下有稍硬腫瘤結節出現,第8天時,可見直徑≥5 mm結節,無紅腫、壞死,成瘤率為100%,模型構建成功,可進行后續實驗。

2.2 各組移植瘤生長情況比較 見圖1。分組后處理第8 天時,實驗A組裸鼠瘤體體積與荷瘤組比較差異無統計學意義(P>0.05);實驗B組、5-Fu組裸鼠瘤體體積小于實驗A組和荷瘤組(均P<0.05)。第12 天開始,實驗A組、實驗B組及5-Fu組裸鼠瘤體體積小于荷瘤組(均P<0.05)。隨處理時間延長,實驗B組及5-Fu組各時間點裸鼠瘤體體積比較差異無統計學意義(均P>0.05),但兩組裸鼠瘤體體積小于實驗A組(均P<0.05)。

注:與荷瘤組比較,*P<0.05;與實驗A組比較,#P<0.05

2.3 各組移植瘤瘤體質量及抑瘤率比較 見表2。與荷瘤組比較,實驗A組、實驗B組及5-Fu組移植瘤瘤體質量減少,抑瘤率升高(均P<0.05)。實驗B組、5-Fu組移植瘤瘤體質量低于實驗A組,抑瘤率高于實驗A組(均P<0.05)。

表2 各組移植瘤瘤體質量及抑瘤率比較

2.4 各組移植瘤細胞凋亡情況比較 見表3(圖2)。

圖2 各組移植瘤細胞TUNEL染色結果(×200)

表3 各組移植瘤細胞凋亡率比較

與荷瘤組比較,實驗A組、實驗B組及5-Fu組移植瘤細胞凋亡率升高,且實驗B組、5-Fu組移植瘤細胞凋亡率高于實驗A組(均P<0.05)。

2.5 各組移植瘤組織VEGFR2/STAT3通路mRNA表達比較 見表4。四組VEGFR2、STAT3 mRNA水平比較差異無統計學意義(均P>0.05)。與荷瘤組比較,實驗A組、實驗B組及5-Fu組移植瘤組織Caspase-3 mRNA水平升高,且實驗B組、5-Fu組移植瘤組織Caspase-3 mRNA水平高于實驗A組(均P<0.05)。

表4 各組移植瘤組織VEGFR2/STAT3通路mRNA表達比較

2.6 各組移植瘤組織VEGFR2/STAT3通路蛋白表達比較 見表5(圖3)。與荷瘤組比較,實驗A組、實驗B組及5-Fu組移植瘤組織p-VEGFR2/VEGFR2、p-STAT3/STAT3降低,Caspase-3蛋白水平升高,且實驗B組、5-Fu組移植瘤組織p-VEGFR2/VEGFR2、p-STAT3/STAT3低于實驗A組,Caspase-3蛋白水平高于實驗A組(均P<0.05)。

圖3 各組移植瘤組織VEGFR2/STAT3

表5 各組移植瘤組織VEGFR2/STAT3通路蛋白表達比較

3 討 論

食管癌起源自食管上皮組織,其發病被認為與多種信號通路及基因異常表達相關,涉及正常食管上皮細胞向癌前病變及最終形成浸潤性腫瘤的轉化,食管上皮細胞在長期受到慢性刺激和損傷后,發生表觀遺傳改變、信號通路異常、細胞周期失調及血管生成促進等,引發細胞增殖、分化、凋亡及侵襲等功能紊亂,最終形成惡性腫瘤[13-15]。該病具有高度侵襲性,盡管隨著醫療水平的不斷進步,腫瘤局部控制效果得以很大程度提高,但手術具有一定風險,且放化療又給患者帶來較大不良反應[16]。因此繼續探究食管癌相關發病機制并尋找有效治療藥物對于提高治療效果具有重大的臨床意義。

本研究顯示,甲磺酸阿帕替尼可抑制腫瘤生長,并促進食管癌腫瘤細胞凋亡。甲磺酸阿帕替尼是一種口服的小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑物,屬于血管內皮生長因子受體(VEGFR)抑制劑,可抑制VEGFR的激活阻斷腫瘤血管生成和生長,減少腫瘤血液、營養和氧氣供應,從而抑制腫瘤的生長和擴散;可抑制腫瘤細胞中VEGFR通路的信號傳導,從而降低腫瘤細胞的增殖、生存和遷移能力;可改善微環境,降低免疫抑制因子表達,增強機體免疫功能,從而增加對腫瘤的免疫監視和殺傷效應[17]。一項多中心、雙盲、隨機、安慰劑對照的三期試驗顯示,甲磺酸阿帕替尼對晚期肝細胞癌顯示出抗腫瘤活性,患者總生存期顯著提高。此外,Meng等[18]認為,甲磺酸阿帕替尼治療晚期食管鱗狀細胞癌時表現出良好的效果及可控的毒性,可能是該病的潛在二線治療選擇。

VEGFR2是血管內皮生長的早期標志物,腫瘤細胞生長及增殖是通過VEGFR2通路介導的,VEGFR2被激活后發生磷酸化反應,進而促進下游重要的轉錄因子STAT3發生磷酸化反應而激活,使其從細胞質轉移到細胞核,進入細胞核后,活化的STAT3調控多個基因的轉錄,抑制促凋亡基因Caspase-3表達,最終促進腫瘤進展[19]。VEGFR2/STAT3通路的活化可促進腫瘤細胞的增殖、存活和遷移,同時誘導腫瘤相關血管生成,為腫瘤提供充足的營養和氧氣。毛績偉等[20]研究顯示,阿帕替尼能夠通過抑制鼻咽癌細胞中VEGFR2/STAT3通路活性降低細胞增殖能力。本研究結果顯示,與荷瘤組比較,實驗A組、實驗B組及5-Fu組移植瘤組織p-VEGFR2/VEGFR2、p-STAT3/STAT3水平均降低,Caspase-3蛋白水平升高,且實驗B組、5-Fu組移植瘤組織p-VEGFR2/VEGFR2、p-STAT3/STAT3水平低于實驗A組,Caspase-3蛋白水平高于實驗A組,說明甲磺酸阿帕替尼可能通過抑制VEGFR2/STAT3通路活化抑制食管癌荷瘤裸鼠移植瘤生長,促進細胞凋亡。

綜上所述,甲磺酸阿帕替尼對裸鼠食管癌移植瘤具有抑制作用,并可促進腫瘤細胞凋亡,推測其機制可能與抑制VEGFR2/STAT3通路有關。