CD166對多發(fā)性骨髓瘤RPMI-8226細胞增殖、凋亡及自噬的影響實驗研究

張治業(yè),余醒醒,張 璐,翟志敏

(1.安徽醫(yī)科大學附屬阜陽醫(yī)院血液內(nèi)科,安徽 阜陽 236000;2.安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科,安徽 合肥 230601)

多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是一種由克隆性漿細胞異常增殖導致的惡性疾病。據(jù)統(tǒng)計,MM占所有惡性腫瘤的1%,占造血腫瘤的10%～15%,是僅次于非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma,NHL)的第二大血液性腫瘤[1-2]。截止到2020年,每年約有176404例新發(fā)患者,近117077例患者死于MM[3]。盡管新型藥物引入和干細胞移植技術(shù)進步顯著改善了患者的預后,然而在生存率方面仍面臨巨大挑戰(zhàn)[4-5]。因此,深入了解多發(fā)性骨髓瘤的分子機制并尋找有效的治療靶點具有重要意義。CD166也稱白細胞活化黏附分子(Activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM)是黏附分子免疫球蛋白超家族的一種糖蛋白,已被證明在細胞間相互作用、血管生成、單核細胞轉(zhuǎn)運和T細胞激活等方面發(fā)揮重要作用[6-7]。其在各種類型腫瘤中過表達,且表達水平或細胞表面豐度與不良預后相關(guān)[8]。CD166已成為一種腫瘤進展調(diào)節(jié)劑,主要通過調(diào)節(jié)細胞增殖、黏附、遷移和侵襲[9],也被確定為腫瘤干細胞標志物[10]。然而,CD166在MM中的作用機制尚不明確。本研究探究CD166對MM細胞增殖、凋亡和皮下成瘤能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與動物 多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI-8226購自中國科學院細胞庫,在添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的PRIM1640 (Gibco)培養(yǎng)基中培養(yǎng),保持潮濕、37 ℃、5% CO2環(huán)境,每2天更換1次培養(yǎng)基。BALB/c裸鼠(4周,雄性,10只)購自中國北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物實驗方案經(jīng)過動物倫理委員會批準并根據(jù)指南進行。

1.2 主要試劑 PRIM1640高糖培養(yǎng)基(C11875500BT)、胎牛血清(10099-141C)、青霉素/鏈霉素(15140122)和0.25%胰蛋白酶(25200-056)購自美國Gibco公司;Lipofectamine 3000(L3000015)購自美國Invitrogen公司;sh-CD166由中國上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司合成;MTT細胞增殖和細胞毒性試劑盒(C0009M)、結(jié)晶紫染色液(C0121)與細胞凋亡試劑盒(C1052)購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司;mCherry-GFP-LC3雙標腺病毒試劑盒(AP22031201)購自漢恒生物科技(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞轉(zhuǎn)染[11]:當RPMI-8226細胞生長至80%時進行傳代或開展實驗。靶向CD166的短發(fā)夾RNA(shRNA)和陰性對照(NC)由上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司設(shè)計并合成,基因序列分別為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’(NC)、5’-AAGCCCGATGGCTCCCCAGTA-3’(sh-CD166-1)和5’-CCCGTGTCATGCACAATAT-3’(sh-CD166-2)。將RPMI-8226細胞以30%～50%融合度接種于6孔板中,更換無血清培養(yǎng)基并在37 ℃、5% CO2環(huán)境中繼續(xù)孵育6 h。根據(jù)試劑盒說明書,將sh-CD166和NC與Lipofectamine 3000瞬時轉(zhuǎn)染進細胞中。24～48 h后收集細胞進行鑒定并進行后續(xù)實驗。

1.3.2 MTT實驗:將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的細胞以5×104/ml密度接種于96孔板上。隨后,于接種后24、48、72 h在每孔中加入MTT溶液10 μl,在37 ℃下培養(yǎng)4 h。使用酶標儀檢測450 nm處的光密度(OD)值。

1.3.3 平板克隆實驗:將轉(zhuǎn)染后的細胞以5×102/孔密度接種于6孔板中并在標準條件下連續(xù)培養(yǎng)2周,每周更換1次培養(yǎng)基。PBS清洗2次后,70%甲醇固定30 min。0.1%結(jié)晶紫在室溫下染色30 min,拍照并在光學顯微鏡下計數(shù)菌落數(shù)(>50個細胞)。

1.3.4 細胞凋亡實驗:上述轉(zhuǎn)染后細胞繼續(xù)孵育24 h,胰酶消化后獲得單細胞懸液并用PBS多次清洗。使用Annexin-V和碘化丙啶避光孵育15 min,流式細胞儀分析細胞凋亡情況并使用FlowJo V10分析各組細胞凋亡率。凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。每組實驗重復3次。

1.3.5 自噬實驗:轉(zhuǎn)染后細胞用96孔板繼續(xù)培育24 h,將細胞分為NC組和sh-CD166組,根據(jù)實驗手冊推薦量加入LC3腺病毒孵育24 h后,共聚焦顯微鏡觀察自噬小體水平并拍照。

1.3.6 皮下移植瘤模型:將BALB/c裸鼠隨機分為NC組和sh-CD166組,每組5只。以1×107個/ml細胞密度將100 μl轉(zhuǎn)染后細胞懸液(NC組和sh-CD166組)注射至小鼠背側(cè)皮下。每3天檢查腫瘤生長情況并測量大小,計算公式為:移植瘤體積(mm3)=1/2×腫瘤長徑×腫瘤短徑2。4周后,麻醉并處死小鼠。分離腫瘤組織,拍照并將其固定于多聚甲醛溶液中。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染后三組細胞增殖能力及平板克隆能力比較 見表1。為了探討CD166對MM細胞增殖的影響,我們轉(zhuǎn)染靶向CD166的shRNA并構(gòu)建CD166敲低細胞株。與NC組比較,sh-CD166-1和sh-CD166-2組細胞增殖能力和平板克隆能力下降(均P<0.05),但sh-CD166-1和sh-CD166-2組比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

表1 轉(zhuǎn)染后三組細胞增殖能力及平板克隆能力比較

2.2 轉(zhuǎn)染后三組細胞凋亡情況比較 見圖1。NC組、sh-CD166-1組以及sh-CD166-2組細胞凋亡率依次為(4.25±0.37)%、(17.18±0.96)%、(12.24±1.03)%。與NC組比較,sh-CD166-1和sh-CD166-2組細胞凋亡率升高(均P<0.05),但sh-CD166-1和sh-CD166-2組比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

圖1 轉(zhuǎn)染后三組細胞凋亡情況流式細胞儀檢測結(jié)果

2.3 轉(zhuǎn)染后兩組細胞自噬小體表達量比較 見圖2。與NC組比較,sh-CD166組細胞中自噬小體表達量明顯減少[(4.30±0.67)個與(0.19±0.02)個,P<0.05]。

圖2 兩組細胞自噬實驗結(jié)果(熒光染色,×400)

2.4 兩組裸鼠移植瘤體積比較 見圖3。為了評估CD166對裸鼠體內(nèi)腫瘤生長的影響,我們用NC及sh-CD166組細胞行裸鼠皮下成瘤實驗。與NC組比較,sh-CD166組移植瘤體積明顯減小[(0.37±0.08)g與(0.19±0.03)g,P<0.05]。

圖3 兩組裸鼠移植瘤實物標本

3 討 論

MM是一種不可治愈和生物異質(zhì)性的漿細胞疾病,伴有骨髓中單克隆漿細胞不受控制地生長,導致功能不完整的免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈異常產(chǎn)生。同時,免疫球蛋白無限制積累以及異常單克隆漿細胞與骨髓中其他細胞不斷相互作用引發(fā)一系列臨床癥狀,包括貧血、骨骼病變、感染、高鈣血癥、腎衰竭、疲勞和疼痛等[12]。化療聯(lián)合類固醇治療是新診斷患者的主要治療方法。糖皮質(zhì)激素、蛋白酶體抑制劑、免疫抑制劑以及干細胞移植等新型治療手段已證明可以顯著改善MM患者的臨床預后[13-15],然而部分患者出現(xiàn)耐藥,患者中位生存期約5年,嚴重威脅著廣大患者的生命健康[16-17]。因此,迫切需要針對MM基因改變和分子生物學的異常表達尋找合適的分子靶點。

CD166位于人類3q13.1-q13.2染色體,由16個外顯子組成。同時,CD166是一種細胞黏附分子,作為淋巴細胞CD6抗原的配體,廣泛表達于各種組織,如神經(jīng)元、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、角質(zhì)形成細胞等[17]。除細胞黏附之外,CD166還具有其他重要功能,如血管生成、單核細胞轉(zhuǎn)運、白細胞通過血腦屏障內(nèi)滲、T細胞激活、造血、神經(jīng)軸突延伸、成骨等[18]。隨著基礎(chǔ)研究的深入,越來越多的證據(jù)表明CD166與腫瘤發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。多項研究[15,17-18]表明,CD166通過激活金屬蛋白酶信號級聯(lián)促進細胞-細胞和(或)細胞-基質(zhì)相互作用,進而參與腫瘤細胞的侵襲過程。同時,CD166已成為一種腫瘤進展的介導者,主要調(diào)節(jié)細胞的增殖、黏附、遷移和侵襲[19]。超微結(jié)構(gòu)研究表明,CD166與MUC18/MEL-CAM/CD146黑色素瘤細胞的表面的黏附分子存在27%的同源性,能夠促進黑色素瘤進展并形成局部和遠處轉(zhuǎn)移。CD166的表達與前列腺癌的轉(zhuǎn)移能力、膽管癌的侵入性以及乳腺癌凋亡的逃避有關(guān)[20]。然而,CD166在MM中的作用及其具體分子機制尚不清楚。

近年研究[21]發(fā)現(xiàn),腫瘤的發(fā)生和發(fā)展可能是由于細胞信號傳導異常激活、細胞異常增殖和腫瘤相關(guān)基因異常表達等原因?qū)е隆ijima等[17]研究發(fā)現(xiàn),CD166在膠質(zhì)母細胞瘤中表達增高。在結(jié)直腸癌組織中,CD166+CSCs陽性表達率均高于癌旁正常組織[22]。Fujiwara等[23]探究CD166對胰腺癌細胞致瘤性和侵襲遷移活性的特征,通過免疫組化分析檢測發(fā)現(xiàn)CD166在胰腺癌組織中表達,但在正常細胞中不表達。

腫瘤細胞異常增殖是腫瘤無法控制的主要原因。Kijima等[17]研究發(fā)現(xiàn),將CD166小干擾RNA或小發(fā)夾RNA轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)母細胞瘤中可促進細胞侵襲而不影響細胞增殖。此外,Fujiwara等[23]研究發(fā)現(xiàn),CD166可以提高胰腺癌細胞克隆形成能力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾CD166表達可以抑制MM細胞增殖和克隆形成,說明CD166具有促進MM細胞增殖的作用。

細胞凋亡作為一種由基因控制自主的、有序的細胞死亡過程,在維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。因此,激活或抑制細胞凋亡被認為是抗腫瘤或促腫瘤的策略。近年來,已有多個研究報道CD166對人腫瘤細胞凋亡具有誘導作用。例如,Jezierska等[9]探究CD166對乳腺癌細胞凋亡和自噬的影響,在乳腺癌細胞中CD166基因沉默后降低B淋巴細胞瘤-2濃度,凋亡率明顯升高。Hansen等[20]研究發(fā)現(xiàn),CD166翻譯后修飾可以作為前列腺癌進展的標志且敲低CD166表達可促進前列腺癌細胞中促凋亡蛋白半胱天冬酶3表達。本研究發(fā)現(xiàn),抑制CD166表達后,MM細胞凋亡率明顯上升。

小鼠皮下移植瘤模型被廣泛用于腫瘤微環(huán)境和藥物療效方面的研究。這種模型目的是為腫瘤生長提供合適的生存條件,以便于它們能夠正常生長并與宿主建立類似于在供體觀察到的相互作用。于是,我們利用裸鼠皮下成瘤模型對體外實驗結(jié)果進行驗證。Yan等[24]通過腫瘤球質(zhì)膜蛋白組學鑒定CD166是否能夠成為頭頸部鱗狀細胞癌中腫瘤干細胞的標記物,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與鱗癌惡性生物學行為顯著相關(guān)的是CD166表達情況,而非已經(jīng)明確的鱗癌干細胞標記物CD44,且相較于CD166(低)頭頸部鱗狀細胞癌細胞,CD166(高)頭頸部鱗狀細胞癌細胞在體外具有更強的成球能力,在體內(nèi)具有更強的成瘤能力。Fujiwara等[23]研究表明,在皮下和原位小鼠腫瘤模型中,CD166+胰腺癌細胞比CD166-胰腺癌細胞引起的腫瘤生長明顯且體積更大。本研究結(jié)果表明,干擾CD166表達可以抑制MM細胞皮下成瘤。

綜上所述,CD166能促進MM細胞 RPMI-8226增殖,抑制細胞凋亡,并促進皮下成瘤。