血清微小RNA-4731-5p和間皮素水平與需治療原發(fā)免疫性血小板減少癥發(fā)生相關(guān)性研究

陳 哲,袁小飛,康虹陽,張 斌,佟長青,高炳華

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科,河北 張家口 075061)

原發(fā)免疫性血小板減少癥(Primary immune thrombocytopenia,ITP)是一種常見的自身免疫性疾病,特點為自身免疫紊亂介導(dǎo)血小板(Platelet,PLT)破壞加速和巨核細胞生成血小板PLT不足,主要臨床癥狀為黏膜出血、皮膚淤點淤斑,嚴重者可能發(fā)生內(nèi)臟、顱內(nèi)出血,對患者生命健康構(gòu)成嚴重威脅[1-2]。目前ITP常用治療方法為糖皮質(zhì)激素治療,然而此方法治療效果個體化差異較大,復(fù)發(fā)率較高,且易發(fā)生不良反應(yīng)[3]。因此,發(fā)掘與ITP有關(guān)的生物學(xué)標志物,對ITP的預(yù)防及早期診斷具有重要意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類高度保守的非編碼小RNA,長度約20～25個核苷酸,研究[4-5]發(fā)現(xiàn)其參與調(diào)控免疫細胞的生長、分化及凋亡,進而影響機體免疫平衡。既往研究[6]顯示,微小RNA-4731-5p(miR-4731-5p)在急性髓系白血病患者血清中呈低表達,且可作為治療靶點影響急性髓系白血病的預(yù)后和進展。目前已知miRNA多是通過調(diào)控其靶基因在疾病中發(fā)揮調(diào)控功能的。于是,本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)間皮素(Mesothelin,MSLN)是其潛在的靶標基因之一。MSLN是一種細胞膜糖蛋白,正常情況下在胸膜、心包和腹膜內(nèi)壁的間皮細胞中呈低表達,但在急性髓系白血病患者中呈高表達[7]。急性髓系白血病存在造血功能異常使PLT減少,血清miR-4731-5p、MSLN均參與急性髓系白血病的發(fā)生與進展,因此推測血清miR-4731-5p、MSLN可能與ITP存在一定聯(lián)系。基于此,本研究探討血清miR-4731-5p、MSLN表達與ITP的相關(guān)性,以期為ITP的診治提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020年5月至2023年6月本院診治的ITP患者118例為研究對象,其中男性53例,女性65例;年齡18～65歲,平均(44.25±6.55)歲。根據(jù)PLT計數(shù)將ITP患者分為需治療組(62例,PLT<30×109/L,伴或不伴出血)和需觀察組(56例,PLT≥30×109/L,近期無出血)。病例納入標準:符合成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國指南(2020年版)[8]中ITP相關(guān)診斷標準;病歷資料完整;入組前未接受過ITP相關(guān)治療。排除標準:合并惡性腫瘤;繼發(fā)性PLT減少癥;存在內(nèi)分泌障礙;重要臟器功能不全;存在精神疾病;妊娠。另選取同期體檢健康者60例為對照組。三組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,受試對象均簽署知情同意書。

表1 三組一般資料比較

1.2 研究方法

1.2.1 血常規(guī)測定:入院后抽取受試者空腹肘靜脈血8 ml,分成兩份。一份血液樣本采用全自動血液分析儀(美國貝克曼庫爾特公司,型號LH750)對白細胞計數(shù)、血紅蛋白、PLT及平均血小板體積(MPV)進行測定。另一份血液樣本高速(4170 r/min)離心10 min分離上清,保存于-70 ℃。

1.2.2 血清miR-4731-5p測定:采用實時熒光定量PCR法對血清miR-4731-5p水平進行測定。血清解凍后,應(yīng)用TRIzol試劑(批號:IH51641,威海威高生物公司)提取總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:IH19152,威海威高生物公司)說明書操作反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,隨后使用PCR儀進行擴增(美國伯樂公司,型號FQD-16B),以U6為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性180 s;95 ℃ 變性15 s,61 ℃退火28 s,73 ℃延伸19 s,共38個循環(huán)。miR-4731-5p正向引物序列為5’-GCTGGGGGCCACATACGGTTAGCA-3’,反向引物序列為5’-CTCTACAGCTATATTGCCAGCCAC-3’。U6正向引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACAC-3’,反向引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGGT-3’。根據(jù)2-ΔΔCt法計算miR-4731-5p相對表達量,每個樣本重復(fù)3次,取平均值。

1.2.3 血清MSLN測定:采用酶聯(lián)免疫吸附法,根據(jù)試劑盒(批號:BSD-1931,武漢博士德生物公司)說明書對血清MSLN水平進行測定。

2 結(jié) 果

2.1 三組血常規(guī)比較 見表2。對照組、需觀察組、需治療組性別、年齡、BMI、過敏史、白細胞計數(shù)、血紅蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);對照組、需觀察組、需治療組PLT水平依次降低,MPV水平依次升高(均P<0.05)。

表2 三組血常規(guī)比較

2.2 三組血清miR-4731-5p和MSLN水平比較 見表3。對照組、需觀察組、需治療組血清miR-4731-5p水平依次降低,MSLN水平依次升高(均P<0.05)。

表3 三組血清miR-4731-5p和MSLN水平比較

2.3 ITP患者血清miR-4731-5p、MSLN、PLT、MPV間的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示,ITP患者血清miR-4731-5p與MSLN呈負相關(guān)(r=-0.683,P<0.05);miR-4731-5p與PLT呈正相關(guān),與MPV呈負相關(guān)(r=0.401、-0.564,均P<0.05);MSLN與PLT呈負相關(guān),與MPV呈正相關(guān)(r=-0.429、0.460,均P<0.05)。

2.4 需治療ITP發(fā)生的影響因素分析 見表4。以需治療ITP是否發(fā)生為因變量(否=0,是=1),以PLT(≥54.81×109/L=0,<54.81×109/L=1)、MPV(<11.26 fl=0,≥11.26 fl=1)、miR-4731-5p(≥0.72=0,<0.72=1)、MSLN(<5.22 μg/L=0,≥5.22 μg/L=1)為自變量進行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),低水平PLT、高水平MPV、低水平miR-4731-5p、高水平MSLN是需治療ITP發(fā)生的獨立危險因素(均P<0.05)。

表4 需治療ITP發(fā)生的影響因素Logistic分析

2.5 血清miR-4731-5p、MSLN對需治療ITP發(fā)生的預(yù)測價值 見表5(圖1)。ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清miR-4731-5p、MSLN、兩者聯(lián)合預(yù)測需治療ITP發(fā)生的AUC分別為0.861、0.850、0.927,兩者聯(lián)合預(yù)測的AUC顯著大于miR-4731-5p單獨預(yù)測的AUC(Z=1.999,P=0.046)和MSLN單獨預(yù)測的AUC(Z=2.221,P=0.026)。

圖1 血清miR-4731-5p、MSLN預(yù)測

表5 血清miR-4731-5p、MSLN對需治療ITP發(fā)生的預(yù)測價值

3 討 論

ITP是一種出血性疾病,為血液科常見疾病之一,具有較高的發(fā)病率[9-10]。ITP主要由于PLT自身抗原免疫耐受性丟失,從而體液及細胞免疫共同作用導(dǎo)致PLT數(shù)量減少[11-12]。PLT減少極易導(dǎo)致患者皮膚黏膜出血、關(guān)節(jié)出血、牙齦出血、消化道出血等,嚴重者可能發(fā)生腦出血甚至死亡,對患者生活質(zhì)量和生命安全產(chǎn)生極大影響[13-14]。目前,針對ITP首選治療藥物為糖皮質(zhì)激素,雖然療效顯著,可快速緩解癥狀,但使用時間過長患者易形成激素依賴,且可能會出現(xiàn)高血糖、睡眠障礙、情緒不穩(wěn)定等多種不良反應(yīng)[15]。因此,探尋與ITP有關(guān)的標志物,對于尋找診治ITP的治療靶點和改善ITP患者預(yù)后具有重要意義。

PLT計數(shù)是PLT生成及衰老的主要指標,PLT水平下降是造成出血的重要原因[16]。MPV反映PLT體積大小,與PLT密切相關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn),對照組、需觀察組、需治療組PLT水平依次降低,MPV水平依次升高,表明ITP患者存在著凝血功能異常。據(jù)報道,PLT數(shù)量及MPV可反映PLT功能狀況和患者病情程度,結(jié)合以往研究得出,在ITP疾病進展過程中,PLT破壞過多,骨髓巨核細胞增生活躍,PLT代謝旺盛,進而導(dǎo)致MPV迅速增大[18]。MPV水平升高,進而激活機體炎癥和凝血系統(tǒng),使出血風(fēng)險增加[19]。

既往研究[20-21]發(fā)現(xiàn),多種miRNA在自身免疫性疾病中異常表達,且不同出血分級、類型患者之間也存在顯著性差異,提示miRNA可能與ITP的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。miR-4731-5p為miRNA家族成員之一,研究[22]發(fā)現(xiàn)miR-4731-5p異常表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Han等[6]研究顯示,miR-4731-5p在急性髓系白血病患者中呈低表達,且參與急性髓系白血病的發(fā)生與發(fā)展。本研究結(jié)果顯示,需觀察組和需治療組ITP患者血清miR-4731-5p水平顯著低于對照組,且需治療組ITP患者血清miR-4731-5p水平低于需觀察組ITP患者,提示miR-4731-5p可能參與ITP的發(fā)生,并且會影響ITP的疾病進展。相關(guān)性分析顯示,ITP患者血清miR-4731-5p與PLT呈正相關(guān),與MPV呈負相關(guān),表明miR-4731-5p水平與PLT和MPV可能存在相互作用,影響ITP的發(fā)病。

MSLN是一種細胞表面分化抗原,在胸膜、心包間皮細胞和腹膜內(nèi)壁間皮細胞中呈低表達,在多種惡性腫瘤如肺癌、卵巢癌中呈高表達[23-25]。Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn),MSLN在急性髓系白血病患者中呈高表達,減少MSLN的水平可降低急性髓系白血病的嚴重程度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組、需觀察組、需治療組血清MSLN水平依次升高,提示MSLN可能在ITP的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。相關(guān)性分析顯示,ITP患者血清MSLN與PLT呈負相關(guān),與MPV呈正相關(guān),且血清miR-4731-5p與MSLN呈負相關(guān),表明miR-4731-5p和MSLN可能存在調(diào)控關(guān)系,參與ITP的發(fā)病過程,然而其具體作用機制尚需深入探究。本研究還發(fā)現(xiàn),低水平PLT、高水平MPV、低水平miR-4731-5p、高水平MSLN是需治療ITP發(fā)生的獨立危險因素。以上結(jié)果提示,臨床上要重點關(guān)注ITP患者PLT、MPV、miR-4731-5p、MSLN水平變化,及時給予干預(yù)以預(yù)防需治療ITP的發(fā)生。ROC曲線分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),血清miR-4731-5p和MSLN聯(lián)合預(yù)測需治療ITP發(fā)生的AUC顯著大于miR-4731-5p單獨預(yù)測的AUC以及MSLN單獨預(yù)測的AUC,提示miR-4731-5p、MSLN兩者聯(lián)合預(yù)測需治療ITP的發(fā)生有較高價值,有望成為預(yù)測需治療ITP發(fā)生的生物學(xué)指標。

綜上所述,ITP患者血清miR-4731-5p水平降低,MSLN水平升高,且兩者與PLT、MPV密切相關(guān),對需治療ITP的發(fā)生有較高預(yù)測價值。然而,本研究納入的病例數(shù)較少,且未深入探究miR-4731-5p、MSLN導(dǎo)致PLT破壞增加及生成不足的具體作用機制,未來將擴大樣本量深入探究兩者引起PLT減少的作用機制。