體外消化對β-胡蘿卜素大豆分離蛋白納米顆粒黏液層滲透及跨膜轉運的影響機制

陳 羚，呂 園，徐菲菲，鐘 芳,*

（1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學未來食品科學中心，江蘇 無錫 214122；3.江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心，江蘇 無錫 214122；4.嘉興未來食品研究院，浙江 嘉興 314050）

蛋白質納米載體已被證實能夠有效改善脂溶性營養素（例如β-胡蘿卜素（β-carotene，BC））的生物利用率。然而，由于嚴苛的胃腸道環境、腸道黏液層屏障以及小腸上皮的跨膜限制，納米載體的口服遞送效果仍受到質疑[1]。大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）基納米顆粒被認為是包載BC的理想載體，具有良好的生物相容性和可再生性。本課題組先前的研究發現，在經口吸收過程中，蛋白質載體容易受到極端胃腸條件的影響，界面蛋白發生水解，使得BC的疏水內核暴露于水相中；同時，腸液中的膽鹽、磷脂等小分子活性劑會吸附到疏水內核表面，對BC進行再包埋，形成由蛋白水解肽、膽鹽、磷脂、BC內核共同組成的尺寸在100 nm以下的重構載體[2]。盡管這類重構載體在胃腸道中的穩定性較差，但在小鼠血漿中顯示出良好的轉運吸收效率[3]。

胃腸道消化過程中的載體結構轉變可能影響載體在小腸上皮細胞的轉運效率和轉運模式。Ma Yuhua等報道，在消化過程中與膽鹽相互作用的脂質納米粒與消化前的微粒相比，可以將水飛薊賓的生物利用度顯著提高7～8 倍[4]。Akbari等研究了從油菜籽中提取的蛋白質所制備姜黃素納米顆粒在消化前后內吞形式的變化，發現消化前細胞攝取納米顆粒的主要形式是網格蛋白依賴的內吞作用和小窩蛋白介導的內吞作用，消化后細胞攝取納米顆粒的主要形式是小窩蛋白介導的內吞作用和巨胞飲作用[5]。也有文獻報道經膽鹽修飾的納米顆粒可以促進其在黏液層的滲透性[6]。

本研究構建載有BC的SPI納米顆粒，通過透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）、納米粒度儀和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀對納米載體的形貌、粒度以及包封率等基本性質進行考察。進一步地，通過構建體外模擬消化模型，獲取消化后的重構納米載體，并對其基本結構特性進行分析。最后，采用人體結腸癌細胞系（Caco2）的分化模型與HT29細胞系共培養，模擬小腸上皮細胞的黏液層和緊密細胞膜結構，以評估消化后重構納米載體在黏液層中的滲透性以及在小腸上皮細胞中的轉運效率和轉運模式。旨在探討消化過程對蛋白質納米載體結構的影響以及重構納米載體突破黏液層和跨膜轉運雙重吸收屏障的能力及可能機制，以期為進一步明確納米載體口服遞送的有效性提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI、磷鎢酸鹽、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、二巰基蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、熒光素鈉、阿利新蘭、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.4）、無水乙醇（分析純） 中國國藥集團上?；瘜W試劑公司；BC（純度＞97%） 東京化學工業有限公司；豬胰蛋白酶（8×USP）、豬膽汁提取物（B8631）美國Sigma-Aldrich公司；人體結腸腺癌細胞（Caco2）、人體結腸腺癌杯狀細胞（HT29） 美國ATCC細胞庫；Hank’s緩沖液（Hank’s balanced salt solutions，HBSS）、高糖培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、雙抗、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、非必需氨基酸（100×） 美國GIBCO公司；奧全健腸溶空囊 山西廣生膠囊有限公司；乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、乙腈、甲基叔丁基醚（色譜級） 上海泰坦科技股份有限公司；超純水 屈臣氏有限公司；總膽汁酸（total bile acid，TBA）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

ME104E電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DF-101S恒溫式加熱磁力攪拌器 鞏義市俞華儀器有限公司；T25型高速分散機 德國IKA公司；N-EVAP-24氮吹儀 美國Organomatio公司；2695 HPLC儀、2998光電二極管陣列（photo-diode array，PDA）檢測器 美國沃特世科技有限公司；ChemiDoc XRS＋化學發光凝膠成像系統 美國伯樂公司；Zetasizer Nano ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀 英國馬爾文公司；Avanti JXN-26高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特公司；Tecnai 12 TEM 美國FEI電子光學有限公司；Millicell ERS-2細胞電阻儀 美國Millipore公司；Q700超聲波破碎儀 美國Qsonica Misonix公司；5430高速離心機、CellXpert C170二氧化碳培養箱 德國Eppendorf公司；M2全波長酶標儀 美國Molecular Devices公司；CKX53倒置顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司。

1.3 方法

1.3.1 BC-SPIs的制備及性質表征

1.3.1.1 載有BC的SPI納米顆粒的制備

將SPI溶于超純水中配制成質量分數2%的SPI溶液，在室溫下攪拌2 h以確保SPI完全水合，隨后在85 ℃水浴中加熱10 min促進其自組裝。然后在15 000×g下離心10 min后收集上清液，即為納米顆粒（SPIs）溶液。將BC（溶解后質量濃度為0.1 g/100 mL）溶解在乙酸乙酯中，在50 ℃水浴中攪拌20 min，同時加入二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）（每100 mL乙酸乙酯中添加0.1 g）以防止BC氧化分解，得到BC有機相溶液。使用8 000 r/min的高速分散機分散SPIs水溶液，同時將BC有機相溶液逐滴滴加到SPIs溶液中，獲得BC、納米粒子質量比為1∶200的納米顆粒溶液并繼續高速分散4 min。最后使用氮吹儀除去溶液中的乙酸乙酯，得到質量濃度為20 mg/mL的BC-SPIs顆粒分散液用于后續研究。

1.3.1.2 粒徑測定

參考Chen Ling等的方法[7]，使用納米粒度及Zeta電位分析儀測定消化前和消化期間BC-SPIs樣品的平均粒徑和粒徑分布情況。取消化前及消化期間100 μL的樣品，使用10 mL的PBS（0.02 mol/L、pH 7.0）進行稀釋。測定時設定BC-SPIs的相對折射率為1.09，所有的測試在25 ℃下進行。

1.3.1.3 Zeta電位測定

采用納米粒度及Zeta電位分析儀測定BC-SPIs消化前和消化期間的Zeta電位。使用PBS（0.005 mol/L、pH 7.0）稀釋樣品100 倍，于室溫下測定其Zeta電位。

1.3.1.4 形貌觀察

使用TEM對BC-SPIs進行形貌觀察[8]。利用去離子水將BC-SPIs和SPIs均稀釋到0.1 mg/mL，然后滴在涂有碳的300 目銅格上，靜置5 min后吸去多余液體。用磷鎢酸鹽溶液（10 mg/mL）染色樣品30 s。最后將銅網放置在干燥器中室溫干燥一夜，利用TEM在120 kV下觀察樣品。

1.3.1.5 BC-SPIs中BC的包封率測定

BC-SPIs中BC的包封率測定參考文獻[9]。取1 mL BC-SPIs顆粒分散液樣品，15 000 r/min離心20 min，除去游離的BC。轉移0.5 mL上清液到玻璃試管中，加入2 mL乙酸乙酯，渦旋1 min，確保兩相充分混合后在5 000×g下離心5 min。隨后，將含有BC的有機層轉移至10 mL容量瓶中。上述操作重復多次直至上層清液無色，再在容量瓶中加入乙酸乙酯定容至10 mL。

使用配備有2998 PDA檢測器的HPLC系統對樣品中的BC質量濃度進行定量分析。色譜柱為COSMOSIL C30柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），配備有預柱。HPLC條件如下：流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：450 nm；分析時間：28 min；流動相：A相為V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（超純水）＝84∶14∶2，B相為二氯甲烷；梯度洗脫程序：0～15 min，80% A、20% B線性變化到45% A、55% B；15～20 min，45% A、55% B；20～25 min，45% A、55% B線性變化到80% A、20% B；25～28 min，80% A、20% B。利用標準曲線方程計算BC質量濃度，按公式（1）計算BC-SPIs對BC的包封率。

1.3.2 模擬消化模型構建及性質測定

1.3.2.1 模擬小腸消化模型構建

參照Chen Ling等的方法構建模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF）消化體系[2]，并對BC-SPIs在SIF中的消化行為進行探究。

配制20 mL SIF（pH 7.0、0.1 mol/L PBS，含8 mg/mL膽鹽、1 mg/mL胰蛋白酶、5 mmol/L氯化鈣），在37 ℃酶解罐中孵育5 min。將BC-SPIs凍干為粉末，在100 mg的腸溶片空殼中加入400 mg BC-SPIs粉末，在20 mL去離子水中加入2 g BC-SPIs腸溶片，并與20 mL SIF混合，溫度設置為37 ℃，100 r/min攪拌速率下消化2 h。

對消化過程中BC-SPIs的界面蛋白組成、Zeta電位及其膽鹽吸附情況進行測定。

1.3.2.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考文獻[9]，使用質量分數12%的分離膠和5%的濃縮膠對消化過程中的BC-SPIs進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。將樣品與上樣緩沖液（含14.4 mmol/L的β-巰基乙醇）混合，使蛋白質的終質量濃度為8 mg/mL。將混合物在沸水中加熱5 min后于12 000×g離心10 min，去除沉淀。在凝膠的每孔中加入10 μL樣品，濃縮電壓和分離電壓設置為200 V。當樣品距離底面約0.5 cm時，停止反應。使用0.1 g/100 mL的考馬斯亮藍R-250溶液染色凝膠60 min，用含體積分數22.5%甲醇和5%醋酸的脫色液對凝膠脫色。使用凝膠成像系統對凝膠進行掃描。

1.3.2.3 表面膽鹽吸附測試

參照Naumann等的方法[10]，將2 mL SIF消化液消化2 h后的樣品（1.3.2.1節制備）轉移到透析袋內（截留分子質量1 000 Da），置于48 mL的PBS（50 mmol/L、pH 7）中。在37 ℃、150 r/min條件下使用振蕩水浴透析24 h。根據總膽汁酸試劑盒說明書測定透析前消化液和透析外液中的膽鹽質量濃度，表面膽鹽吸附率按公式（2）計算。

1.3.3 消化前后BC-SPIs的細胞跨膜轉運途徑分析

1.3.3.1 細胞培養

使用人體結腸腺癌細胞（Caco2）和人體結腸腺癌杯狀細胞（HT29）第7～19代進行實驗。將細胞培養于含有10 mL完全培養基（體積分數10% FBS、1%非必需氨基酸和體積分數1%雙抗）的細胞培養瓶中，置于二氧化碳培養箱中，溫度設置為37 ℃，CO2的體積分數為5%。當細胞的匯合程度達到80%～90%時（＜4 d），使用0.25%胰蛋白酶進行細胞傳代。

1.3.3.2 Caco2細胞模型的建立

將Caco2細胞培養3～5 代后，根據文獻[11]的方法，將Caco2細胞以1×105個/cm2的密度接種到6 孔Transwell膜（直徑15 mm、孔徑0.4 μm）上，每2 d換一次培養液，培養約21 d左右分化形成細胞單層。

1.3.3.3 Caco2/HT29共培養細胞模型的建立

根據Song Hongdong等的方法[12]，將Caco2和HT29以9∶1的密度比按1×105個/cm2的密度接種到6 孔Transwell膜上，每2 d換一次培養液，培養約21 d左右形成含黏液層的細胞單層。

1.3.3.4 細胞跨膜電阻的測定

使用電阻儀測定細胞模型在21 d的培養分化過程中細胞跨膜電阻的變化[11]，在每次更換培養基后進行測定。細胞跨膜電阻按公式（3）計算。

式中：RS為Caco2細胞或Caco2/HT29共培養細胞單層模型的電阻/Ω；RB為聚碳酸酯多孔膜在培養基中的自身電阻/Ω；A為有效膜面積（4.52 cm2）。

1.3.3.5 熒光素鈉滲透實驗

以DMEM為溶劑制備2 mg/mL的熒光素鈉溶液。使用HBSS清洗Caco2或Caco2/HT29共培養21 d的細胞模型兩遍，在細胞培養室頂端（apical，AP）加入1.5 mL 2 mg/mL的熒光素鈉溶液，底端（basolateral，BL）加入2 mL DMEM，在37 ℃下孵育4 h，每隔一段時間吸取適量的BL端溶液，并補充新的DMEM溶液。使用酶標儀在激發波長440 nm、發射波長525 nm下測定BL端培養基中熒光素鈉的熒光強度。用DMEM稀釋2 mg/mL的熒光素鈉溶液并測定其熒光強度獲得標準曲線。同時，以空白聚碳酸酯多孔膜作對照，按公式（4）計算熒光素鈉透過率，并以此判斷細胞模分化后的完整性。

1.3.3.6 細胞膜分化程度的考察

細胞頂端堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活力可以表征Caco2細胞膜的分化成熟程度[11]。使用ALP試劑盒測定1～21 d內細胞培養室AP和BL培養基中的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活力，以AP、BL培養基中的ALP活力比值（AP/BL比值）判斷細胞膜的分化程度。

1.3.3.7 阿利新藍染色實驗

阿利新藍是一種對黏液中的黏蛋白具有特殊染色作用的染色劑，可用于直觀評價黏液細胞的存在情況[13]。將細胞以0.8×105個/mL的密度接種于6 孔板中。染色前使用PBS清洗細胞2 次，然后加入0.5 mL 4%（體積分數）多聚甲醛溶液固定細胞，37 ℃孵育30 min后吸出，再使用PBS清洗細胞2 次，加入含有1%（質量分數）阿利新蘭的3%（體積分數）乙酸溶液，37 ℃孵育30 min后，用PBS洗去多余的阿利新藍。用倒置顯微鏡觀察在7、14 d和21 d的黏液染色情況。

1.3.3.8 細胞毒性實驗

采用MTT法對消化前后的BC-SPIs進行細胞毒性測定[14]。用PBS配制5 mg/mL的MTT溶液。在96 孔板孔中加入100 μL濃度為5.0×105個/mL的細胞液，37 ℃孵育12 h左右，使每個孔的細胞匯合程度達到40%左右進行后續實驗。先使用PBS簡單清洗細胞兩遍，然后加入不同稀釋倍數的樣品（2、5、10、20、40、80 倍和100 倍），37 ℃孵育4 h。移去培養基，再用PBS清洗細胞，加入100 μL的MTT溶液（5 mg/mL），于37 ℃孵育2 h。移去培養基，再用PBS清洗細胞，并加入100 μL二甲基亞砜，振蕩96 孔板5 min，使MTT紫色結晶完全溶解，使用酶標儀檢測每孔細胞在490 nm波長處的光密度值（OD值），按公式（5）計算細胞存活率。

式中：空白組為不接種細胞的空白孔；對照組為不添加BC-SPIs、僅接種細胞的孔。

1.3.3.9 兩種細胞模型對BC的轉運與吸收的考察

使用生長分化21～28 d的Caco2和Caco2/HT29共培養細胞模型對消化前后BC-SPIs的轉運與吸收進行考察[11]。方法如下：使用DMEM溶液清洗AP端細胞2 次，再在AP端加入用DMEM稀釋過的樣品1.5 mL（BC質量濃度控制在4.4 μg/mL），在BL端加入2 mL DMEM。在37 ℃下孵育，在此期間使用跨膜電阻儀定時測定AP端和BL端之間區域的電阻，確保在整個孵育過程中細胞膜能夠保證完整性（不低于250 Ω·cm2）。孵育4 h后，收集AP端DMEM溶液，加入0.5 mL 4 ℃含體積分數10%乙醇溶液的PBS終止實驗，分別收集BL端的DMEM溶液和Transwell膜上的單層細胞。使用HPLC法測定搜集的3 個部分中的BC及其代謝產物的含量。其中，BL端DMEM中BC或其代謝產物的含量是轉運量；細胞層中BC或其代謝產物的含量是積累量；求BC及其代謝產物總含量時將其均轉化為VA當量后再求和，以此表征總積累量，即積累的VA當量。

1.3.3.10 BC的代謝產物定量分析

使用細胞刮棒獲得0.5 mL細胞懸液。其中，0.4 mL用于定量BC及其代謝產物含量。剩余的0.1 mL用于使用BCA法測定蛋白質含量。

BC和視黃醇棕櫚酸酯定量的HPLC方法同1.3.1.5節。視黃醇和維生素A酸含量采用HPLC法進行定量[15]，具體條件如下：色譜柱為COSMOSIL C30柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），配備有預柱；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：450 nm或325 nm；分析時間：36 min；樣品室溫度：4 ℃；流動相：A相（70%（體積分數，下同）乙腈＋10%甲基叔丁基醚＋20%乙酸銨（80 mmol/L、pH 4.5））和B相（76%乙腈＋20%甲基叔丁基醚＋4%乙酸銨水溶液（80 mmol/L、pH 4.5））；梯度洗脫程序：0～3 min，100% A；3～10 min，從100% A、0% B線性變化到25% A、75% B；10～25 min，從25% A、75% B線性變化到0% A、100% B；25～27 min，100% B；27～29 min，從0% A、100% B線性變化到100% A，0% B；29～36 min，保持100% A。

1.3.3.11 黏液層滲透性考察

將細胞以0.8×105個/mL的密度接種于6 孔板中，使用生長分化14 d的HT29細胞模型對消化前后BC-SPIs的黏液層滲透率進行考察。方法如下：移去DMEM培養基，再向孔中加入用DMEM稀釋過的2 mL樣品（BC質量濃度控制在4.4 μg/mL）。在37 ℃下孵育4 h后，移去孔中培養基，使用4 ℃的PBS清洗黏液2 遍。使用0.5 mL 4 ℃含體積分分數10%乙醇的PBS終止實驗，收集單層細胞。使用HPLC法定量測定細胞中BC及其代謝產物的含量，求總含量時將其轉化為VA當量，即為透過黏液層的VA當量。

1.3.3.12 BC-SPIs轉運模式分析

通過將細胞與特定的內吞作用抑制劑預孵育以探究消化前后BC-SPIs的細胞膜轉運模式[5]。1.5 mL Caco2細胞以0.8×105個/mL的密度接種在6 孔板孔中，并孵育至完全匯合。去除培養基，然后加入2 mL使用完全DMEM制備的氯丙嗪（20 μg/mL）、槲皮素（20 μg/mL）、吲哚美辛（100 μg/mL）、β-環糊精（2 mg/mL）和阿米洛利（40 μg/mL）抑制劑溶液，在37 ℃孵育1 h。隨后，將2 mL消化前或消化后的BC-SPIs（以DMEM稀釋，BC質量濃度控制在4.4 μg/mL）添加到孔板中，在37 ℃下孵育4 h。同時，為研究BC-SPIs是否以主動轉運模式吸收，將上述實驗操作過程中的兩次孵育溫度均改成4 ℃。孵育后使用PBS洗滌BC-SPIs和抑制劑，加入1 mL PBS，收集細胞。使用細胞超聲破碎儀破碎細胞組織。在細胞破碎液中按體積比1∶1加入含0.1 g/100 mL BHT的四氫呋喃溶液，渦旋1 min，再加入1 mL乙酸乙酯，繼續渦旋1 min，于5 000×g離心5 min，收集上層淡黃色有機相于玻璃試管中，重復上述萃取過程至少3 次以確保BC及其相關代謝產物萃取完全。收集的有機相用氮氣吹干，再溶于200 μL含0.1 g/100 mL BHT的正己烷中。采用HPLC法測定BC及其代謝產物的含量，并將其轉化為VA當量以計算BC的相對吸收率，如式（6）所示。

通過改變SIF中膽鹽和胰蛋白酶的添加情況，探究模擬腸消化中不同消化條件因素對BC-SPIs轉運模式的影響。具體條件如下：1）不消化，直接考察Caco2細胞對BC-SPIs的轉運途徑（消化前組）；2）考察SIF消化對Caco2細胞轉運BC-SPIs方式的影響（消化后組）；3）考察腸消化過程中胰蛋白酶對Caco2細胞轉運BC-SPIs方式的影響：SIF中不添加膽鹽（胰蛋白酶組）；4）考察腸消化過程中膽鹽對Caco2細胞轉運BC-SPIs方式的影響：在SIF中不添加胰蛋白酶（膽鹽組）。

收集上述消化條件下的BC-SPIs，依照1.3.3.12節的方法對其轉運模式進行考察。

1.4 數據處理與分析

所有實驗至少重復3 次，數據結果表示為平均值±標準差，使用SPSS Statistics Version 22.0軟件對數據進行單因素方差分析（ANOVA），以Duncan檢驗法進行顯著性分析（P＜0.05表示差異顯著）。采用Graphpad 9.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 BC-SPIs結構特性表征

如表1所示，SPIs的多分散系數（polydispersity index，PDI）為0.39，粒徑分布較為均一，其電位低于－20 mV，表明其顆粒穩定性較高。包封BC后，平均粒徑較包封前有所增大，可能是因為BC被包埋進入到顆粒內部，使顆粒膨脹。Chen Feiping等的研究中也觀察到BC-SPIs在與姜黃素絡合后粒徑增大的現象[16]。BC-SPIs電位的絕對值較包封前有所提高，說明載入BC后納米顆粒整體穩定性有了進一步提高。BC-SPIs中BC的包封率為40.21%，與其他報道結果相比有所提高，李炳章等采用真空冷凍干燥技術制備出以SPI為載體的姜黃素納米顆粒，包封率僅為33.90%[17]。

表1 BC-SPIs的平均粒度、PDI、Zeta電位和包封率Table 1 Average diameter, polymer dispersity index (PDI), zeta potential and encapsulation efficiency of BC-SPIs

使用TEM進一步觀察BC-SPIs的形貌結構，結果如圖1所示。BC-SPIs形態呈球形顆粒。比較發現，利用納米粒度及Zeta電位分析儀測得的BC-SPIs平均粒徑比TEM圖像中觀察到的更大，這是因為TEM觀察的是干燥狀態下的顆粒形貌，而米粒度及Zeta電位分析測量的是顆粒在溶液中的尺寸[18]。在水溶液中，顆粒的表面存在水化層，在TEM干燥制樣的過程中，水分蒸發會破壞水化層，使顆粒失水皺縮，導致尺寸變小[19]。

圖1 SPIs（A）及BC-SPIs（B）的TEM圖像Fig. 1 Transmission electron microscopic image of SPIs (A) and BC-SPIs (B) nanoparticles

2.2 BC-SPIs在消化過程中的結構特性變化

2.2.1 消化過程中BC-SPIs的粒徑變化

如圖2所示，在SIF消化的整個過程中，BC-SPIs粒徑逐漸增大，這是因為SIF消化液中存在的胰蛋白酶使BC-SPIs界面蛋白上的賴氨酸殘基、精氨酸殘基等被切斷，界面蛋白層被破壞，使疏水基團暴露，分子發生聚集，形成大的聚集體，導致粒徑上升，并在隨后的消化過程中結構繼續展開，使顆粒不斷聚集，粒徑持續增大[20]。同時，BC-SPIs在與SIF消化液混合0 min時的粒徑明顯增大，這是因為消化液的高離子濃度造成納米顆粒表面電荷降低，從而發生了顆粒的部分聚集。

圖2 消化過程中BC-SPIs的平均粒徑變化Fig. 2 Changes in average diameter of BC-SPIs during digestion

2.2.2 消化過程中BC-SPIs的界面蛋白組成、Zeta電位及其膽鹽吸附情況

如圖3A所示，在SIF消化的過程中，BC-SPIs的界面蛋白在消化的前5 min內，蛋白條帶密度明顯下降，降解后的條帶主要集中在分子質量低于37 kDa的區域內，印證了2.2.1節中顆粒粒徑的增大。消化后的蛋白水解產物易與膽鹽發生疏水相互作用，結合水相中的游離膽鹽[21]，而帶不同負電的膽鹽在顆粒表面的吸附會改變顆粒的表面電荷[22]。如圖3B所示，經過SIF消化后，BC-SPIs的表面Zeta電位絕對值增加，電位變化越大，說明界面蛋白被膽鹽取代的程度越高。通過透析法測定了消化后膽鹽在BC-SPIs表面上的吸附情況，結果表明消化液中有56.37%的膽鹽吸附于BC-SPIs消化2 h后的顆粒表面。

圖3 消化過程中BC-SPIs的SDS-PAGE（A）以及Zeta電位（B）的變化Fig. 3 Changes in SDS-PAGE (A) and zeta potential (B) of BC-SPIs during digestion

2.3 消化前后BC-SPIs的黏液層滲透及細胞跨膜轉運的考察結果

2.3.1 利用Caco2單層細胞模轉運模型考察的結果

2.3.1.1 細胞跨膜電阻和熒光素鈉滲透性

細胞跨膜電阻反映的是細胞模型在分化時細胞間連接的緊密程度，可用于表征細胞膜的完整性，電阻高于250 Ω·cm2代表細胞膜緊密程度良好。如圖4A所示，Caco2細胞模型在培養分化21 d后跨膜電阻達到890.44 Ω·cm2，說明細胞膜緊密程度高，適用于吸收轉運實驗[23]。

圖4 孵育21 d內Caco2細胞跨膜電阻（A）以及熒光素鈉透過率（B）的變化Fig. 4 Changes in trans-epithelial electrical resistance (TEER) (A) and fluorescein sodium transport rate (B) of Caco2 monolayer during 21 days of incubation

熒光素鈉（分子質量為376 Da）滲透性可用以表征單層細胞膜的緊密連接程度。如圖4B所示，在前15 min內就已有大量熒光素鈉穿透空白膜（對照），而Caco2細胞模型在孵育4 h后也僅有2.59%的熒光素鈉通過細胞膜，說明細胞膜致密程度良好。

2.3.1.2 細胞膜的分化程度

除了單層膜的緊密程度和完整性，其頂端功能酶系的發育程度也是考察單層膜是否適合評價化合物轉運吸收的另一項重要指標[11]。在孵育分化過程中，Caco2單層細胞膜AP端酶系會逐漸成熟，直至酶活力不變。盡管平行樣品間酶活力的基礎值有所差異，但由于BL端的酶活力在孵育期間相對穩定，故可用AP端與BL端ALP活力的比值（AP/BL比值）來評價單層細胞膜的分化程度。如圖5所示，在培養分化的過程中，AP/BL比值隨著培養時間的延長逐漸增加，在19 d時達到比較穩定的狀態，表明單層細胞膜頂端酶系的生長已經成熟，頂端酶系不再發生變化。

圖5 孵育21 d內Caco2細胞膜頂端ALP活力的變化Fig. 5 Changes in alkaline phosphatase activity of Caco2 monolayer during 21 days of incubation

2.3.1.3 BC-SPIs細胞毒性考察

Narain等報道膽鹽分子在胃腸道中作為陰離子表面活性劑，某些濃度下會表現出細胞毒性[24]，說明消化液中膽鹽的存在會提高消化產物的細胞毒性，而本實驗消化后樣品中含有游離的膽鹽分子，因此有必要先進行安全實驗再進行后續實驗。如圖6所示，以細胞存活率不低于75%作為標準，確定未被消化的BC-SPIs安全的最低稀釋倍數為5 倍，消化后產物安全的最低稀釋倍數為10 倍。消化液中BC質量濃度經HPLC定量為44 μg/mL，根據消化后產物的安全稀釋倍數確定Caco2細胞模型中BC最高添加量為4.4 μg/mL。

圖6 BC-SPIs在消化前（A）、后（B）的Caco2細胞毒性Fig. 6 Cytotoxicity of BC-SPIs before (A) and after (B) digestion to Caco2 cells

2.3.2 利用Caco2-HT29共培養細胞模型的考察結果

2.3.2.1 細胞跨膜電阻和熒光素鈉滲透性

如圖7A所示，Caco2/HT29共培養的細胞模型在21 d后細胞跨膜電阻為720.44 Ω·cm2，低于Caco2細胞跨膜電阻。這是因為Caco2細胞之間能非常緊密地連接，而HT29細胞會改變細胞的連接程度導致跨膜電阻降低[25]。Caco2/HT29細胞跨膜電阻大于130 Ω·cm2，被認為細胞單層連接較為緊密，能夠形成致密的單層細胞模型[22]。

如圖7B所示，Caco2/HT29共培養細胞模型在孵育4 h后，僅有3.38%的熒光素鈉通過細胞膜，遠低于空白的聚碳酸酯膜（對照），這說明經過Caco2/HT29共培養細胞模型細胞膜致密，可用于后續研究。

2.3.2.2 細胞膜頂端ALP活力

由圖8可知，在21 d的培養過程中，AP/BL比值在17 d時達到穩定，表明在共培養細胞模型的頂端酶系已經成熟，未受到黏液層的影響。

圖8 孵育21 d內Caco2-HT29共培養模型頂端ALP活力的變化Fig. 8 Changes in alkaline phosphatase activity of Caco2-HT29 co-culture during 21 days of incubation

2.3.2.3 黏液層染色實驗結果

為了確認HT29細胞在共培養細胞模型黏液層中的形成，使用阿利新藍對不同生長階段的單層細胞表面進行染色。如圖9所示，Caco2細胞中只能檢測到極為少量的黏蛋白。而對于HT29細胞，無論是單獨培養還是和Caco2細胞共培養，都可以分泌大量的黏蛋白。在HT29細胞單獨培養時，培養14 d時黏液的分布就已經很均勻，而共培養模型則在21 d時黏液量最多，形成了含有黏液層的小腸上皮細胞跨膜模型。

圖9 孵育21 d內Caco2、HT29以及Caco2-HT29共培養細胞的黏液分泌情況Fig. 9 Mucus secretion of Caco2, HT29 and Caco2-HT29 co-culture during 21 days of incubation

2.3.2.4 BC-SPIs細胞毒性考察

如圖10所示，其結果與Caco2細胞毒性實驗結果一致，以細胞存活率不低于75%作為標準，確定未被消化的BC-SPIs安全的最低稀釋倍數為5，消化后產物安全的最低稀釋倍數為10。最終確定后續實驗時Caco2-HT29共培養模型中的BC添加量統一為4.4 μg/mL。

2.3.3 利用Caco2-HT29共培養細胞對BC-SPIs的吸收、轉運效率考察結果

2.3.3.1 BC-SPIs的細胞吸收

如表2所示，細胞內BC的代謝產物主要是視黃醇和視黃醇棕櫚酸酯，而維生素A酸和BC只占很少一部分。消化后BC-SPIs在Caco2-HT29共培養細胞內的BC及其代謝產物積累量顯著高于消化前顆粒。2.2.2節中已證實BC-SPIs在消化后表面上吸附了大量的膽鹽分子。有研究表明膽鹽修飾可以通過降低腸道黏液層的黏度和彈性促進顆粒的黏液層滲透性[26]；同時有研究表明，還可通過增強生物膜流動性和通透性、降低細胞間緊密連接程度、抑制其外排作用等特性促進攜帶營養素的納米顆粒在小腸上皮細胞膜的吸收[27]。

表2 消化前后BC-SPIs中BC及其代謝產物在Caco2-HT29共培養細胞中的積累量Table 2 Cellular accumulation in Caco2-HT29 co-culture of BC from BC-SPIs and its metabolites before and after digestion

2.3.3.2 BC-SPIs的轉運

表3所示的是消化前后的BC-SPIs在Caco2-HT29共培養模型中的轉運情況，整體來看，經過細胞代謝進入體循環的BC及其代謝產物的分布規律與細胞中積累的規律基本一致，代謝產物仍主要為視黃醇和視黃醇棕櫚酸酯。對比未被消化的BC-SPIs，消化后在細胞中以及BL端檢測到的BC及其代謝產物更多（表2、3）。上述研究結果表明BC-SPIs在消化過程中發生的結構轉化改善了轉運吸收效率，一方面可能是因為膽鹽在顆粒表面的吸附突破了黏液層屏障，增加了顆粒的黏液層滲透性；另一方面也可能是因顆粒結構改變引起轉運模式的變化，從而提高了其轉運效率。為了驗證上述假設，通過后續實驗進行了進一步考察。

表3 BC-SPIs中BC及其代謝產物在Caco2-HT29共培養細胞中的轉運量Table 3 Cellular transport in Caco2-HT29 co-culture of BC from BC-SPIs and its metabolites before and after digestion

2.3.4 消化前后BC-SPIs的黏液層滲透性及轉運模式的考察結果

2.3.4.1 消化前后BC-SPIs的黏液層滲透性

為進一步探究消化改善BC-SPIs轉運吸收特性的機制，分別對消化前后BC-SPIs的黏液層滲透性和跨膜轉運模式進行考察。盡管BC-SPIs在消化后具有更大的粒徑和更多的負電荷，但能夠穿透細胞模型黏液層的整體VA當量較消化前有所增加（表4）。負電荷數量的增加和尺寸的增大會阻礙顆粒在黏液層中的遷移，而膽鹽吸附則能增強顆粒在黏液層的滲透性，綜合來看，表面膽鹽的修飾作用要大于表面電荷和粒徑變化帶來的影響。結合表3和表4中所述BC及其代謝產物的胞內積累量和轉運量，發現消化后的BC-SPIs跨越黏液層屏障的能力提高了0.48 倍。

表4 消化前后BC-SPIs的HT29黏液層滲透性Table 4 Permeability through HT29 mucus layer of BC-SPIs before and after digestion

2.3.4.2 消化前后BC-SPIs在Caco2細胞中的吸收、轉運效率

從表5可看出，消化后的BC-SPIs除了黏液層滲透性得到了提高，其跨膜吸收量也有所提升。與Caco2/HT29共培養模型對比來看，Caco2細胞中所積累的BC及其代謝產物含量更高，這可能是由于共培養模型中的黏液層會阻礙了BC-SPIs與Caco2細胞的接觸，導致BC-SPIs穿透黏膜層進入到小腸上皮細胞中效率變慢，積累量降低。

表5 消化前后BC-SPIs中BC及其代謝產物在Caco2細胞中的積累量Table 5 Cellular accumulation in Caco2 cells of BC from BC-SPIs and its metabolites before and after digestion

如表6所示，與胞內吸收的結果類似，相比Caco2/HT29共培養模型，Caco2模型中所轉運的BC及其代謝產物含量更多，代謝規律趨勢與共培養模型類似。結合表5和表6中所述胞內積累和轉運BC含量，發現消化后的BC-SPIs跨膜轉運量提高了0.56 倍。

表6 消化前后BC-SPIs中BC及其代謝產物在Caco2細胞中的轉運量Table 6 Cellular transport in Caco2 cells of BC from BC-SPIs and its metabolites before and after digestion

2.3.4.3 消化前后BC-SPIs的單層細胞膜轉運模式

目前的觀點認為大部分BC-SPIs是通過內吞作用進入到細胞內部。內吞作用途徑包括網格蛋白依賴的內吞作用、小窩蛋白依賴的內吞作用、非網格蛋白和小窩蛋白依賴的內吞作用、巨胞飲作用、小窩/脂閥依賴的內吞作用，分別可以通過使用內吞作用抑制劑（氯丙嗪、吲哚美辛、槲皮素、β-環糊精和阿米洛利排除特定的內吞作用，闡釋轉運BC-SPIs的內吞作用機制[5]。

如圖11所示，當用不同的抑制劑處理細胞時，細胞對BC-SPIs的相對吸收率有不同程度的降低。與37 ℃正常溫度的轉運相比，細胞轉運在4 ℃時受到明顯的抑制。說明BC-SPIs的轉運方式主要是需要能量的主動內吞作用。使用氯丙嗪和吲哚美辛處理細胞時，BC-SPIs的相對吸收率減少50%左右，說明網格蛋白依賴的內吞作用和小窩蛋白依賴的內吞作用對BC-SPIs的轉運起重要作用。

而當BC-SPIs經過消化后轉運時，不僅是吲哚美辛和氯丙嗪能夠抑制其內吞作用，阿米洛利也顯著影響了顆粒的轉運，說明消化后顆粒的轉運模式主要為網格蛋白依賴的內吞作用、小窩蛋白依賴的內吞作用和巨胞飲作用。

為了進一步明確消化后顆粒轉運模式發生變化的原因，對可能的消化條件影響因素進行了驗證。如圖12所示，在4 種消化模式中，僅添加膽鹽促進了小窩蛋白和網格蛋白依賴的內吞作用，并不會引發巨胞飲；而僅添加胰蛋白酶則會促進巨飽飲作用。產生這種差異的原因，可能在于在不同消化條件影響下，BC-SPIs結構產生了不同程度的變化。據報道，當BC-SPIs的尺寸為120～150 nm時，顆粒主要通過網格蛋白依賴的內吞作用進入細胞，在200 nm以下的粒子主要是以小窩蛋白依賴的內吞作用進行轉運[28]。而巨胞飲則可以將亞微米和更大尺寸的大顆粒內化在細胞中[29]。帶負電荷的BC-SPIs更有可能利用小窩蛋白依賴的內吞作用[29]。在消化前，由于BC-SPIs的粒徑（＜200 nm）以及顆粒帶負電的原因，導致細胞轉運納米顆粒的主要方式是網格蛋白以及小窩蛋白依賴的內吞作用。經過消化后，由于胰蛋白酶的作用，顆粒在消化過程中發生絮凝，導致顆粒的粒徑增加，從而促進巨飽飲作用的產生，而膽鹽與顆粒的相互結合導致顆粒帶有更多的負電，影響了小窩蛋白依賴的內吞作用。而在消化前后溶液中都存在200 nm以下的顆粒，因此對網格蛋白依賴的內吞作用影響不大。

圖12 消化條件因素對 BC-SPIs網格蛋白依賴內吞作用（A）、小窩蛋白依賴內吞作用（B）和巨胞飲（C）的影響Fig. 12 Effects of digestion conditions on clathrin-mediated endocytosis (A),caveolin-mediated endocytosis (B), and macropinocytosis (C) of BC-SPIs

3 結 論

BC-SPIs經消化后界面蛋白水解、顆粒尺寸增加，且一定量的膽鹽分子吸附于表面。消化后的顆粒在小腸上皮細胞膜的吸收轉運量較初始顆粒有所增加，一方面是因為表面吸附的膽鹽促進了消化后的顆粒在黏液層的滲透，提高了小腸上皮細胞膜的跨膜轉運量；另一方面則是因為顆粒結構變化帶來的轉運途徑的增加，在小窩蛋白和網格蛋白依賴的內吞作用基礎上，增加了巨胞飲轉運途徑，減少了黏液層和跨膜轉運雙重吸收屏障的限制，促進了細胞對BC的吸收和利用。