酵母菌及其衍生物抗菌功能研究進展

馬 悅，單嘉宇，蔣耀東，黃俊楠，王 旭，張凌魁，楊 朔，董慶利

（上海理工大學健康科學與工程學院，上海 200093）

食品中含有豐富的營養成分，在較為適宜的環境條件下，某些致腐的微生物（又稱植物病原菌）可在食品基質上大量繁殖，加速食品腐敗，嚴重影響食品質量[1]。據世界衛生組織（World Health Organization，WHO）報道，全球約25%的果蔬食品在收獲后因感染致腐微生物而腐爛變質，由此造成的經濟損失不可估量[2]。此外，食源性致病微生物的污染是造成食源性疾病頻發的重要原因之一，嚴重威脅著人們的身體健康和生命安全。據報道，我國每年由食源性致病微生物污染引發的疾病病例數約占總食源性疾病暴發病例數的50%[3]。因此，實現食品中有害微生物的有效防控對提高食品質量及保障食品微生物安全具有重要意義。

食品工業中通常應用一些理化抗菌技術抑制食品中有害微生物的生長繁殖[4-5]。然而這種抗菌處理可能會對食品品質造成不可逆的負面影響[6-7]。例如，超高溫瞬時殺菌技術可在135～150 ℃溫度環境下2～8 s內迅速消殺有害微生物，從而保障食品的微生物安全，但高溫條件也可能導致食品中的蛋白質變性，改變食品質地并造成營養損失[8]。又如，苯甲酸作為一種常用的化學抗菌劑，在酸性條件下對霉菌、細菌等多種微生物均具有抑制作用，然而過量使用化學抗菌劑會使微生物產生抗藥性，且化學試劑的殘留可能對環境造成污染[9]。近年來，利用天然溫和的生物防控方法控制食品中有害微生物污染引起了廣泛關注[10]。在真實食品環境下，利用生防菌與致腐菌或致病菌間的相互作用可以抑制體系中有害微生物的生長繁殖，延緩食品腐敗并保障食品安全，且對食品的品質及風味影響較小，因此在食品領域具有廣闊的應用前景[11-12]。

拮抗酵母菌具有來源廣泛、適應性和繁殖能力強、代謝產物無毒且無致敏性的特點，可以通過競爭營養物質和空間、分泌抗菌物質、寄生于病原菌及誘導宿主產生抗病性4 種主要的拮抗途徑抑制多種有害微生物的生長，作為生防制劑已被廣泛用于果蔬的采后保鮮[13]。除了利用拮抗酵母菌的生物活性外，利用酵母菌的細胞結構特性，將一些化學抗菌劑包裹在失活的酵母菌細胞中也可以實現酵母菌的抗菌功能化。與一般的聚合物載藥原理相同，酵母菌載體可提高化學抗菌劑的局部濃度和穩定性，從而提高抗菌效率[14]。然而目前關于酵母菌抗菌功能的綜述局限于酵母菌及其代謝產物與特定有害微生物之間的拮抗作用[15-17]，對利用失活酵母菌搭載化學抗菌劑從而實現高效抗菌效果的總結尚待完善。

本文在現有研究的基礎上，從拮抗作用及搭載抗菌藥兩個方面歸納酵母菌的抗菌功能：在拮抗作用方面，總結討論拮抗酵母菌的種類、來源、與其他抗菌技術的聯合抗菌效果及其拮抗的機制；同時分析酵母菌作為天然載體搭載多種化學抗菌劑的優勢及局限性。此外，展望未來酵母菌在抗菌領域的重點研究方向，旨在為以酵母菌為基礎的新型抗菌劑的開發提供參考，以期更好地提高食品質量，保障食品安全。

1 拮抗酵母菌的來源及種類

拮抗酵母菌廣泛存在于果實表面、葉片、根部、土壤和海水等多種自然環境中，可通過離體/體外（in vitro）或活體/體內（in vivo）篩選兩類方法實現拮抗酵母菌的篩選與分離[18-19]。其中，體外篩選是指在配制的培養基上，將潛在的拮抗酵母菌和對其敏感的植物病原菌共同培養。孵育特定時間后，通過檢測敏感植物病原菌的存活率，評價相應酵母菌的拮抗活性。體內篩選則是以真實果蔬基質作為兩者的共培養基質，通過計算果蔬的患病率來評價相應酵母菌的拮抗活性。目前，國內外研究者已經通過上述兩類方法成功地篩選分離出了多種不同來源的拮抗酵母菌。例如，Wilson等[20]早在1993年即通過體內篩選的方法將具有拮抗活性的喜橄欖假絲酵母菌（Candida oleophila）從番茄果實中篩選并分離出來，目前該酵母菌已被廣泛用于降低采后蘋果果實青霉病的發病率[21]。Qin Guozheng等[22]也通過體內篩選的方法從蘋果果實中分離出羅倫隱球菌酵母菌（Cryptococcus laurentii），該酵母菌可有效地抑制由于互生鏈格孢菌（Alternaria alterneta）、擴展青霉（Penicillium expansum）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和黑根霉（Rhizopus stilonifer）感染而導致的甜櫻桃果實腐爛，實現果蔬采后保鮮。體外篩選的方法通常可針對單一敏感菌株同時篩選多個潛在拮抗酵母菌。例如，Cabanas等[23]在配制的馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上一次性篩選出了對光滑青霉（Penicillium glabrum）具有拮抗活性的陸生畢赤酵母菌（Pichia terricola）、出芽短梗霉/黑酵母菌（Aureobasidium pullulans）和接合囊酵母菌（Zygoascus meyerae）。Chen Ou等[24]也通過體外篩選方法，從來源于柑橘園的78 株酵母菌中成功篩選出16 株對指狀青霉（Penicillium digitatum）具有抗菌性的拮抗酵母菌。

如表1所示，體內篩選的方式可以同時監測酵母菌對病菌的抑制作用及其對食品基質理化性質的影響，現已成為拮抗酵母菌的主要篩選途徑。然而，該方法相較于體外篩選通常需要更長的篩選周期，導致篩選效率較低。未來可以將體內外篩選方法結合，通過體外篩選的方法，針對同一敏感菌同時篩選多種潛在拮抗酵母菌，再進行二次體內篩選，評價其在真實食品基質上的拮抗效率，提高拮抗酵母菌的篩選效率。

表1 典型拮抗酵母菌的來源及其篩選方法Table 1 Sources of typical antagonistic yeasts and their screening methods

2 拮抗酵母菌的抗菌作用

2.1 單一拮抗酵母菌抗菌作用

表2總結了幾種典型的拮抗酵母菌對特定致病菌或致腐菌的抑制效果。雖然抗菌效果因拮抗酵母菌的代謝活性、生命周期、繁殖能力及外部環境的不同而有所區別，但總體而言，單一酵母菌的抑菌譜較窄且拮抗效率有待提高，因此，商業化的酵母菌拮抗劑通常是多種拮抗酵母菌的組合，或與物理化學抗菌手段相結合，以滿足實際應用中對廣譜高效抗菌功能的需求[17]。

表2 典型拮抗酵母菌的抗菌效果Table 2 Antimicrobial effects of typical antagonistic yeasts

2.2 多種拮抗酵母菌聯合抗菌作用

單一拮抗酵母菌的抗菌譜較窄且容易引發有害微生物耐藥。聯合多種拮抗酵母菌可望拓寬抗菌譜并提高整體抗菌效率，由此減少酵母菌拮抗劑的使用量和使用頻率，抑制有害微生物耐藥的發生。例如，Janisiewicz等[32]的研究表明，相較于等量的單一種類拮抗酵母菌，美極梅奇酵母菌（Metschnikowia pulcherrima）和羅倫隱球酵母菌聯合使用對采后蘋果青霉菌腐爛的控制效果更佳。Guetsky等[33]發現季也蒙畢赤酵母菌（Pichia guilliermondii）與蕈狀芽鞄桿菌（Bacillus mycoides）在不同溫度和濕度條件下聯合使用，可將草莓葉片及植株中灰葡萄孢的抑制率從74.0%提高到88.0%～99.8%。

然而不同種拮抗酵母菌之間的相容性可能影響它們聯合使用時的拮抗效果。例如，相較于單一酵母菌處理組，兩種黏紅酵母菌（SL1和SL30）聯合使用對蘋果果實傷口中灰霉病的抑制效率反而下降[34]。這可能是因為不同種類拮抗酵母菌之間存在對營養和空間的競爭關系，導致其對植物病原菌的抗菌活性總體降低。因此，聯合多種拮抗酵母菌提高抗菌效率的相關研究應注重于酵母菌種的篩選，避免拮抗酵母菌之間的競爭。在同一系統共存的前提下實現協同抗菌效應的最大化。

2.3 拮抗酵母菌聯合物理抗菌方法

借助熱處理[35]、紫外線照射[36]、臭氧處理[37]和微波處理[38]等物理手段控制有害微生物的生長繁殖是食品領域中常用的抗菌方法。然而長時間、高強度的物理抗菌處理可能影響食品質地和風味。將其與拮抗酵母菌聯合使用有望提高抗菌效率，從而減少食品在苛刻物理抗菌環境下的處理時間及強度，降低食品質量及風味損失。例如，Zhou Yahan等[39]將采后受傷的柑橘果實用53 ℃的熱水處理2 min后引入膜醭畢赤酵母菌，成功提高了對意大利青霉（Penicillium italicum）和指狀青霉的抑菌效率，顯著降低了采后柑橘青霉病和綠霉病的發病率及病斑的直徑。此外，聯合作用后有效提高了系統內苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶的活性，促進了抗菌活性物質的合成。相似地，Zhao Yan等[40]用45 ℃的熱水和季也蒙畢赤酵母菌先后處理了被匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）和擴展青霉感染的桃子果實，發現聯合熱水和拮抗酵母菌處理可以提高果實真菌病害的抑制率，延緩桃子果實中抗氧化參數的下降，實現了采后桃果的保鮮。然而，拮抗酵母菌作為一種微生物，對環境壓力的耐受力有一定的閾值。當其與高強度的物理抗菌手段同時聯用時，有可能造成自身菌體的損傷失活，喪失拮抗功能。因此，針對拮抗酵母菌與物理方法聯合的開發需要注意物理抗菌手段及強度對拮抗酵母菌拮抗活性的影響。此外，應該在理解不同種抗菌手段抗菌機制的基礎上，量化各手段對抗菌效率提升的貢獻，實現聯合抗菌效率的最大化。

2.4 拮抗酵母菌聯合化學抗菌方法

將拮抗酵母菌與化學物質聯用是提高其抗菌效率的另一策略。根據所應用的化學試劑的類別可將其分為抗菌化學藥劑、金屬鹽以及植物激素。表3總結了典型的拮抗酵母菌與各類化學物質聯用后，針對特定植物病原菌的協同抗菌效果。不同種類的化學制劑與拮抗酵母菌之間的協同抗菌機制有所不同。例如，苯并-(1,2,3)-噻二唑-7-硫代甲酸甲酯（benzo-thiadiazole-7-carbothioic acid methyl ester，BTH）、殼聚糖及苯菌靈能夠直接抑制植物病原菌生長，與拮抗酵母菌聯合使用后的抗菌效率提升作用可能歸因于簡單的抗菌效應疊加[41-43]。然而，植物激素則是通過增加拮抗酵母菌群的數量和誘導宿主對植物病原體的抗性來提高拮抗酵母菌的抗菌效率，其協同抗菌的機制更為復雜，需要根據情況具體分析。

表3 拮抗酵母菌與典型化學制劑聯合的抗菌效果Table 3 Antimicrobial effects of antagonistic yeast in combination with typical chemical agents

拮抗酵母菌與化學物質的聯合使用因其低成本、高效率的特點已經成為食品工業中應用最為廣泛的抗菌策略之一。已有研究表明，在保證相同殺菌效果的前提下，添加拮抗酵母菌可降低化學抗菌物質的投放劑量，從而降低有害微生物對相應化學制劑的耐藥性，為此后拮抗酵母菌生防制劑的商業化推廣提供了新思路。然而，化學制劑也可能對拮抗酵母菌的抗菌活性帶來負面影響。因此，有必要系統性地量化化學制劑與酵母菌之間的相互作用，為優化抗菌劑配比提供科學依據。

3 拮抗酵母菌抗菌作用機制

如圖1所示，拮抗酵母菌的抗菌機制可分為4 個主要路徑：1）與病原菌競爭營養物質及空間；2）分泌抗菌物質；3）直接寄生在病原菌菌絲上；4）誘導宿主產生抗病性。

圖1 拮抗酵母菌的抗菌機制示意圖Fig. 1 Schematic diagram of antimicrobial mechanisms of antagonistic yeasts

3.1 與病原菌的競爭作用

拮抗酵母菌與植物病原菌競爭有限的空間和營養是實現其生防作用最主要的機制之一。相較于典型的植物致病菌，拮抗酵母菌具有適應能力強、繁殖迅速等特點，使其可以在短時間內迅速搶占果蔬傷口處的營養與空間，由此抑制植物病原菌的生長繁殖，實現果蔬的采后保鮮[17]。

3.1.1 競爭營養物質

可以根據營養物質的種類將拮抗酵母菌和植物病源菌對營養物質的競爭分為碳源營養物、氮源營養物和金屬離子。相較于碳源和氮源營養物質，參與細胞內酶代謝及合成的金屬離子在食品基質中的含量較少，是拮抗酵母菌與植物病原微生物競爭的主要營養對象[49]。拮抗酵母菌所產生的異羥肟酸鹽類物質中，N-羥基及羰基氧原子均可以作為三價鐵離子（Fe3＋）的配體，與其形成穩定的鐵離子復合物，從而減少同一營養體系下植物致病菌對Fe3＋的獲取。典型的鐵載體結構如圖2所示。例如，拮抗黏紅酵母菌可以通過產生鐵載體紅酵母菌酸提高對擴展青霉的生物防控效率[50]。此外，Saravanakumar等[51]證明了美極梅奇酵母菌和核果梅奇酵母菌可以產生Pulcherrimnic acid鐵載體，通過結合Fe3＋產生一種紅色染料Pulcherrimin，成功抑制了灰葡萄孢、互生鏈格孢菌和擴展青霉植物病原菌在采后蘋果果實上的生長繁殖。然而，一些有害微生物也可產生鐵載體，與同一營養體系下的拮抗酵母菌競爭鐵離子。例如，革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌分泌的Staphyloferrin、革蘭氏陰性菌大腸桿菌分泌的腸桿菌素、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）分泌的熒光嗜鐵素和螯鐵蛋白以及植物致病真菌粉紅鐮刀菌（Fusarium roseum）產生的一種線型鐵載體（fusarinineB）均可與環境中的鐵離子結合，為自身提供競爭性的生長優勢[52]。因此，拮抗酵母菌是否占有鐵離子的競爭優勢主要取決于競爭者所分泌的鐵載體的產量及其對Fe3＋的親和性。

圖2 拮抗酵母菌和有害微生物產生的鐵載體結構Fig. 2 Chemical structures of siderophores produced by antagonistic yeasts and harmful microorganisms

除金屬離子外，對碳源和氮源營養物質的競爭也是拮抗酵母菌抑制有害微生物的重要拮抗途徑。早在1996年，Filonow等[53]利用13C標記法發現等量接種的羅倫隱球酵母菌和粉紅擲抱酵母菌（Sporobolomyces roseus）在蘋果果實傷口處培養48 h后，所利用葡萄糖、果糖和蔗糖的量遠高于灰霉病菌灰葡萄孢。相較于對照組，接種拮抗酵母菌的蘋果果實灰霉病的發病率降低了約80%。由此可知，在有限的營養條件下，拮抗酵母菌可通過迅速地搶奪植物致病菌的碳源營養而抑制同一體系下有害微生物的生長繁殖，從而減少采后果蔬腐敗病的發病率，提高采后果蔬質量。然而在含糖量較高的果蔬體系中，果實中所富含的D-葡萄糖、D-果糖和蔗糖等可以同時為拮抗酵母菌及病原體提供足量的碳源營養。此時對碳源營養的競爭不太可能發揮重要作用[54]。除了碳源營養外，果蔬中含有的氨基酸、胺類、多肽、蛋白質和核酸是微生物生長繁殖所需氮源營養物的主要來源。Liu Pu等[55]在含有檸檬形克勒克酵母菌（Kloeckera apiculata）和意大利青霉菌的柑橘傷口處添加氨基酸后，削弱了兩者對氮源營養的競爭，導致拮抗酵母菌的生防效果顯著下降，證明了競爭氮源營養是拮抗酵母菌發揮生防功能的另一重要途徑。

3.1.2 競爭生存空間

微生物的生長繁殖除了對營養物質的需求外，還需要一定的生存空間。對生存空間的競爭是酵母菌抑制植物病原菌的另一個關鍵拮抗途徑。在真實食品基質中，可用的定植空間十分有限，一些拮抗酵母菌通過在傷口處迅速繁殖并形成生物被膜占據有限的生存空間，從而抑制其他有害微生物的繁殖[56]。例如，只有具有強定植能力的生物被膜狀態下的釀酒酵母菌M25才能夠有效地抑制擴展青霉在蘋果傷口處的感染，證明了拮抗酵母菌可能是通過形成酵母菌生物被膜占據定植空間，實現對植物病原體的抑制[57]。然而有些可以生成生物被膜的酵母菌，在定植過程中會轉化為菌絲形式，攻擊宿主細胞，即使在沒有植物病原菌的條件下仍會導致采后果蔬的病變。例如，發酵畢赤酵母（Pichia fermentans）DISAABA 726是一種可以形成生物被膜的酵母菌，對由念珠菌屬（Moniliniaspp.）病原菌引起的蘋果褐腐病具有出色的拮抗活性。然而當其接種在桃果中，發酵畢赤酵母菌會轉變為假菌絲狀態，加速桃組織的腐爛[58]。由此可見，不同的宿主環境可能誘導酵母菌狀態的改變，導致其拮抗功能的下降甚至使之具有致病性。因此，對酵母菌拮抗功能的研究必須限定在特定的應用環境下才具有參考意義。

總之，競爭有限的營養物質及空間是酵母菌拮抗作用的重要機制之一。然而只有當酵母菌對營養和空間的競爭能力強于植物病原體的時候，才能發揮其生防作用，減少采后果蔬的病發率，提高食品質量。此外還需要考慮酵母菌在不同宿主環境下因狀態改變而導致的對宿主的致病性。

3.2 分泌抗菌物質

拮抗酵母菌可能通過分泌抗菌物質抑制植物病原體的生長繁殖[59]。根據抗菌物質的化學結構可將其分為嗜殺毒素、裂解酶類和揮發性VOCs。

3.2.1 嗜殺毒素

某些酵母菌具有嗜殺活性，即能分泌蛋白質類的殺手毒素殺死其他菌株，而其自身則對殺手毒素具有免疫力[60]。通常嗜殺酵母菌所分泌的殺手毒素被糖基化后會與目標微生物細胞壁上的一級受體（β-1,3-D-葡聚糖、β-1,6-D-葡聚糖、β-1,3-甘露糖蛋白和幾丁質）結合。隨后被轉運到細胞質膜上，與二級受體結合并最終通過水解細胞壁、破壞細胞膜、阻斷細胞周期、攻擊tRNA、破壞DNA或阻斷鈣的攝取，導致敏感病原體失活[61]。

目前研究較多的嗜殺酵母菌是釀酒酵母菌，它可以產生3 種典型的嗜殺毒素——K1、K2和K28。K1毒素首先與目標微生物細胞壁中的一級受體β-1,6-D-葡聚糖進行特異性結合，改變細胞通透性，然后由附著在細胞質膜上的細胞壁蛋白Kre1p介導，將含有大量疏水氨基酸結構的K1毒素遞送到細胞質膜上，形成陽離子通道，導致鉀離子大量泄漏并最終造成目標微生物死亡[52]。K2毒素與K1毒素具有相似的前軀體結構，因此兩者的結合受體及作用途徑相同[62]。K28毒素的一級受體是則是細胞壁上的β-1,3-甘露糖蛋白，而細胞內質網中的Erd2p則可能作為K28毒素的二級受體。K28毒素的毒素信號最終被傳導到目標微生物的細胞核內，通過抑制其DNA的合成阻斷細胞生命周期，導致細胞凋亡[63]。除了釀酒酵母菌外，膜醭畢赤酵母菌可以產生PMKT和PMKT2兩種嗜殺毒素，從而抑制其他致病菌甚至其他種類拮抗酵母菌的生長[64]。

針對嗜殺毒素未來的研究方向可以分為3 類：1）合成機制及受體結構探究。除釀酒酵母菌外，膜醭畢赤酵母菌，土星擬威爾酵母菌（Williopsis saturnus）、威客漢姆酵母菌（Wickerhamomyces anomalus）和乳酸克魯維酵母菌（Kluyveromyces lactis）等其他嗜殺酵母菌的嗜殺毒素的合成路線及其受體結構的研究較為罕見，有待進一步完善。2）嗜殺毒素的活性評估。絕大多數嗜殺毒素的化學本質是蛋白質，受pH值、溫度和水分活度等環境因素的影響較大。因此嗜殺酵母菌應用于真實食品基質時，應該系統評估不同食品基質及加工環境對嗜殺酵母菌所產生的嗜殺毒素活性的影響。3）嗜殺毒素的靶向改性。除有害微生物外，一些益生菌或拮抗酵母菌的細胞結構中也具有嗜殺毒素的結合受體，因此可能被嗜殺毒素滅活。對此可以通過基因工程或者化學修飾技術，賦予嗜殺毒素針對有害微生物的靶向特性，提高對有害微生物的防控效率。

3.2.2 裂解酶類

幾丁質、葡聚糖和蛋白質是組成微生物細胞的重要組成成分，某些拮抗酵母菌可以通過分泌相應的裂解酶破壞特定微生物的細胞結構，從而抑制其生長繁殖[17]。

根據幾丁質酶作用時的切割位點，可以將其分為內切酶和外切酶兩大類。其中內切酶可以作用于幾丁質中的β-1,4糖苷鍵，在幾丁質長鏈中隨機切割，形成二乙酰殼二糖及低分子殼寡糖。外切幾丁質酶再細分為兩類：催化幾丁質從非還原性末端釋放二乙酰殼二糖的外切幾丁質水解酶以及可以分解低分子殼寡糖，生成N-乙酰葡萄糖胺的N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶[65]。一般情況下，拮抗酵母菌會同時產生多種幾丁質酶，共同作用實現抗菌功能。例如，美極梅奇酵母菌和羅倫隱球菌酵母菌均可以同時分泌出內切和外切幾丁質酶，減少了由于蘋果中灰葡萄孢及梨中擴展青霉感染而導致的水果采后腐爛[66-67]。與幾丁質酶相似，葡聚糖酶通過破壞β-1,4糖苷鍵裂解有害微生物細胞結構中的葡聚糖致其死亡。同理，葡聚糖酶也可以分為內切酶和外切酶兩類。前者是在葡聚糖的隨機位點水解β-1,4糖苷鍵，生成聚合度較小的寡糖及單體葡萄糖，而后者則是從葡聚糖的非還原端依次切割葡萄糖單元的殘基，破壞葡聚糖結構，實現葡聚糖的結構裂解[68]。例如季也蒙畢赤酵母菌分泌的外切葡聚糖酶可有效抑制蘋果果實中灰葡萄孢的感染。然而上調或下調拮抗酵母菌中編碼該葡聚糖酶的基因雖然能夠影響酶的表達量，但是對其抗菌效果影響甚微。這可能是由于細胞膜結構中葡聚糖層外部的酵母菌甘露糖蛋白的空間阻隔效應，使得只有少量的葡聚糖酶進入葡聚糖層催化水解反應[69]。此外，這些進入內部的葡聚糖酶也難以擴散出去，從而被周圍的葡聚糖重復利用。因此，在不存在蛋白酶的條件下，水解葡聚糖對酶的需求量極低，調控拮抗酵母菌內葡聚糖酶的表達量對其生防效率影響較小。在此后的研究中，可通過添加蛋白酶驗證上述假說。

某些拮抗酵母菌可以分泌蛋白酶，通過催化有害微生物中蛋白質分子的酰胺鍵水解實現對其生長繁殖的控制。根據催化位點的特性和作用條件的不同，將蛋白酶分為絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸（硫醇）蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶4 類[70]。例如，拮抗黑酵母菌通過分泌堿性絲氨酸蛋白酶可以有效抑制灰葡萄孢、核果褐腐病菌（Monilinia laxa）和擴展青霉的菌絲生長，表現出優異的抗菌性能[71-72]。將該拮抗酵母菌中控制堿性絲氨酸蛋白酶的相關基因整合到大腸桿菌BL21后，大腸桿菌也可以有效抑制相關植物致病菌的生長，充分證明了拮抗酵母菌分泌的蛋白酶是其實現抗菌功能的重要途徑之一[73]。

3.2.3 揮發性有機化合物

VOCs是由某些拮抗酵母菌在其代謝過程中產生的具有一定抗菌活性的醇類、酯類等小分子物質（分子質量小于300 Da）[74]。例如，Zhou Yi等[75]利用固相微萃取法結合氣相色譜-質譜技術，發現尼泊爾德巴利酵母菌（Debaryomyces nepalensis）可以通過分泌苯乙醇減少芒果果實中約40%的盤長孢狀刺盤孢（Colletotrichum gloeosporioides）的菌絲生長。異常畢赤酵母菌（Pichia anomala）所分泌2-苯基乙酸乙酯可有效抑制赭曲霉菌（Aspergillus ochraceus）的生長[76]。然而在實際情況下，拮抗酵母菌可以產生多種VOCs協同抑制病菌生長繁殖。因此，純化后的單一VOC對特定病原菌的體外抑制效果不能直接反應該拮抗酵母菌在真實食品基質中的拮抗效果。

拮抗酵母菌的衍生物VOCs有望作為一種新的生防制劑應用于果蔬采后病原菌的控制[77]。當VOCs用作生防劑時，通常需要在密閉的條件下才能維持足夠高的濃度實現有效的抑菌活性。然而，果蔬的呼吸作用會迅速消耗掉該密閉環境中的氧氣，迫使果蔬細胞進行無氧呼吸，將果蔬中的糖和有機酸等營養物質分解成乙醇和乙醛等不完全氧化產物，對果蔬的感官特性造成負面影響，降低食品質量。對此，可以在密閉體系中充入大量氧氣來避免無氧呼吸，然而果蔬在有氧呼吸條件下可能釋放大量的熱能，導致果蔬附近的溫度上升，增加病菌的繁殖活性，降低VOCs的抗菌效率[78]。原位富集拮抗酵母菌產生的抗菌VOCs是突破此類生物防治劑應用限制的關鍵。例如，Parafati等[77]將可產生VOCs的拮抗酵母菌固定在水凝膠顆粒中，利用水凝膠材料中多孔結構對VOCs的富集性能，實現了在開放環境下VOCs對采后草莓和柑橘中灰色、綠色和藍色霉菌的長效抑制，為酵母菌基VOCs生防制劑的產業化提供了新思路。

3.3 直接寄生作用

直接的寄生效應是指拮抗酵母菌依附在病原菌的菌絲結構中，通過從病原菌細胞中汲取營養或釋放相關裂解酶破壞病原菌細胞結構，抑制其生長繁殖，從而減少由病原菌感染而引發的果蔬采后病變，提高果蔬質量[17]。例如，Liu Ye等[29]通過電子顯微鏡觀察發現桔梅奇酵母菌（Metschnikowia citriensis）會寄生在指狀青霉的菌絲上，通過奪取原本由青霉菌獲得的鐵離子，減少了71.22%的致病菌菌絲生長。而扣囊復膜孢酵母菌（Saccharomycopsis schoenii）則是通過寄生在耳念珠菌（Candida auris）中獲得蛋氨酸，一方面可作為自身的氮源營養，另一方面也可刺激扣囊復膜孢酵母菌中天冬氨酸蛋白酶基因的高表達，所產生的天冬氨酸蛋白酶可破壞耳念珠菌的細胞壁，使其失活[79]。除蛋白酶外，拮抗酵母菌產生的其他裂解酶，如β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶也可能導致病原體的分解，已在3.2.1節進行系統性總結，這里不作贅述。

3.4 誘導寄主產生抗病性

果蔬植物具有先天免疫系統，可識別并響應病原菌的存在，但如果該響應效果不足，植物就可能被植物病原菌侵害，加速病變腐敗。某些拮抗酵母菌能夠強化植物宿主對病原菌的響應，誘導宿主通過一系列的超敏反應（hypersensitivity reactions，HR）生成與致病相關的蛋白（pathogenesis-related protein，PR）、裂解酶、抗氧化酶和植物抗毒素等物質抑制植物病原菌的生長繁殖，減少果蔬的真菌病變，從而提高食品質量[80]。例如，在喜橄欖假絲酵母菌的刺激下，果蔬宿主組織中致病相關蛋白（PR-8）的表達顯著上調，分泌產生了更多的PR-8蛋白，增強了宿主對灰霉病菌的抗性[81]。然而，有研究發現，即使是失活的酵母菌也可以上調宿主PR蛋白相關基因的表達，刺激PR蛋白的分泌，抑制擴展青霉在宿主上的繁殖[82]。顯然，PR蛋白在宿主抗病機制中發揮著重要的作用，但是酵母菌細胞如何介導宿主調控PR蛋白相關基因的分子機制尚未可知。

除PR蛋白外，拮抗酵母菌也可誘導宿主提高多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）等多種抗氧化酶的活性，增強宿主對由植物病原菌感染而引發的氧化應激反應的抗性[83]。此外，一些酵母菌可以誘導宿主產生植物抗毒素，從而抑制植物病原體的污染。例如，擬南芥經過釀酒酵母菌處理后，產生大量植物抗毒素Camalexin，顯著提高了擬南芥對由丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）和灰葡萄孢引起的灰霉病菌的抗性[84]。然而，許多植物抗毒素的化學結構尚未確定。液相色譜-質譜分析和全基因組分析等多種技術的結合可能有助于發現更多的植物抗毒素，闡明植物抗毒素的合成途徑，更好地解析植物抗毒素對宿主抗性的誘導機制。

綜上，盡管大量的研究已經證明了拮抗酵母菌可以通過誘發宿主產生對植物病原體的抗性從而實現抗菌效果，但兩者間的劑量關系尚不明確。此外，宿主在酵母菌刺激下的抗性形成機制難以從分子水平解析。未來可結合蛋白組學及基因工程技術進一步研究。

4 酵母菌微膠囊搭載抗菌劑

拮抗酵母菌的抗菌效率通常較低且抗菌譜相對較窄，難以滿足特定應用場景下對快速、高效且廣譜抗菌功能的需求。通過真空高壓或化學水解法去除酵母菌內部的細胞器，可使之成為其他化學抗菌劑的天然載體，將其與不同種化學抗菌劑結合即可重新賦予酵母菌顆粒抗菌活性[85]。相較于其他藥物遞送載體，酵母菌及其衍生微粒具有大小可控、成本低的優點。此外，酵母菌外壁中的β-1,3-D-葡萄糖可與有害微生物細胞上的Dectin-1受體（C型凝集素受體）進行特異性結合，從而實現靶向抗菌，提高抗菌效率[86]。本文根據酵母菌微膠囊所搭載的化學抗菌劑種類分以下3 個方面討論。

4.1 酵母菌搭載氯基抗菌劑

常見的氯基抗菌劑有次氯酸鈉（NaClO）、次氯酸（HClO）以及鹵胺類。因其具有高效廣譜的殺菌特性而被廣泛應用于食品加工環節。然而氯基抗菌劑穩定性較差，在熱或光照條件下容易水解從而失去抗菌活性[87]。將氯基抗菌劑載入酵母菌微膠囊可有效提高其抗菌功能穩定性。例如，將一種鹵胺聚合物（即氯化后的聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI））封裝于酵母菌微膠囊中，鹵胺聚合物中具有抗菌功能的有效氯通過蛋白質之間的傳質作用緩慢擴散至酵母菌微膠囊外壁，當有害微生物與其接觸后迅速失活，在5 min內即可殺死5 種典型的細菌和真菌。另一方面，大量搭載有效氯的PEI被包裹在酵母菌的有限細胞空間內，可有效減少鹵胺鍵的水解，在水溶液中存放28 d后，活性氯含量未見降低[88]。由此可見，將酵母菌作為載藥微膠囊可有效提高氯基抗菌劑的抗菌速率并提高其抗菌功能的穩定性。然而，酵母菌細胞結構可能被高濃度的活性氯破壞，造成酵母菌微膠囊的結構裂解。因此，此后的研究應注重酵母菌微膠囊中氯基抗菌劑的載藥率，以期在實現高效穩定殺菌功能的同時保證酵母菌細胞結構的完整性。

4.2 酵母菌搭載抗菌光敏劑

抗菌光敏劑通常具有共軛化學結構，通過吸收特定波長的光源，將光敏分子從基態激發至激發態后，再與氧氣和水分反應生成多種具有抗菌活性的活性氧（reactive oxygen species，ROS），從而實現抗菌功能[89]。由于其獨特的化學結構，抗菌光敏劑通常在水環境中的溶解度有限且與有害微生物間的親和性較差，導致抗菌效率較低[90]。因此，將光敏劑包裹在酵母菌微膠囊中，可提高抗菌顆粒整體的親水性及與有害微生物間的親和性，實現抗菌效率的提高。例如，姜黃素作為一種天然光敏抗菌劑，將其封裝在酵母菌微膠囊中，在紫外光照射30 min后，可殺死約99%生物被膜狀態下的單核細胞增生李斯特菌。而未封裝的姜黃素在相同條件下，細菌數量未見顯著變化[91]。值得注意的是，封裝后的光敏劑必須從酵母菌微膠囊中釋放并暴露在特定波長光源后才能產生抗菌功能的ROS。過快釋放可能導致大量光敏劑聚集在一起，短時間內產生的大量ROS相互猝滅，抗菌效率降低；而釋放速率過慢可能只造成有害微生物的可逆損傷而非徹底殺滅。因此，實現光敏劑從酵母菌微膠囊體系中的可控釋放是提高其抗菌效果的關鍵。

4.3 酵母菌搭載抗菌精油

相較于氯基及光敏抗菌劑，抗菌精油可從天然植物中提取，相對毒性較低，可作為添加劑應用在食品中[92]。然而抗菌精油因穩定性差、揮發性和氣味性強和有效劑量濃度高等問題限制了其應用范圍。將抗菌精油搭載在酵母菌微膠囊中，可有效保護精油成分、遮掩氣味且通過靶向遞送提高目標范圍內的精油濃度，在不影響食品質地的前提下，實現高效穩定且持久的抗菌效果。例如，Liu Shanshan等[93]將Manuka抗菌精油（Manuka essential oil，MEO）封裝于酵母菌微膠囊后，可顯著提高精油的熱穩定性及抗菌效率。在70 ℃下處理30 min后，封裝后的MEO保留率達65%。而在相同處理條件下，未封裝的MEO保留率僅為22%。此外，在化學需氧量為1 000 mg/L的條件下，封裝后的MEO對芽孢桿菌的抗菌效率遠高于未封裝組。這是由于酵母菌微膠囊可保護抗菌精油免于環境中有機污染物的非特異性消耗而提高精油的抗菌效率。

抗菌精油是一種小分子混合物，其抗菌效果可能是多種活性成分共同作用的結果。在利用酵母菌封裝抗菌精油時，不同化學結構的小分子與酵母菌微膠囊間的相互作用強度不同，可能導致緩釋速度差異，使得協同抗菌的效率降低。因此，之后的研究應傾向于各種抗菌精油成分與酵母菌膠囊之間相互作用的定量化研究，并通過調整各抗菌成分的配比，實現抗菌精油的協同抗菌效果最大化。

5 結 語

致腐和致病的微生物污染食品可能會影響食品質量，造成食品安全隱患。利用某些酵母菌的拮抗作用或者載藥功能可以抑制有害微生物在果蔬等食品基質中的生長繁殖，提高食品質量并保障食品安全。近年來，開發與酵母菌相關的抗菌制劑已經成為有害微生物防控領域的研究熱點。本文在現有研究的基礎上，從拮抗作用及載藥抗菌兩個方面，系統性地歸納總結酵母菌的抗菌功能。在拮抗作用方面，從拮抗酵母菌的種類、篩選方法、與其他抗菌技術的聯合抗菌效果及其拮抗機制多個角度，總結與拮抗酵母菌相關的生防劑開發存在的主要問題及改進方向；在載藥抗菌方面，分析酵母菌作為天然藥物載體與多種化學抗菌劑組合的優勢及局限性。

未來針對酵母菌抗菌功能的研究展望：第一，結合體外和體內酵母菌篩選方法的優勢，提高拮抗酵母菌的篩選效率。首先通過體外篩選的方法，針對同一敏感菌同時篩選多種潛在拮抗酵母菌，從其中選擇拮抗效果最佳的酵母菌株，再利用真實食品基質進行二次體內篩選，考察拮抗效果的同時評估拮抗酵母菌對食品基質的影響，提高拮抗酵母菌篩選效率。第二，從分子水平探討拮抗酵母菌的作用機制。目前酵母菌拮抗機制的研究多止步于對所分泌的鐵載體、裂解酶等抗菌化合物的檢測，但在其產生過程中，酵母菌分子水平上的代謝機制尚不清晰。此外，不同種酵母菌在分子水平上的拮抗機制不盡相同，系統性地總結和歸納拮抗酵母菌在分子水平上的最新研究動態，能夠進一步揭示拮抗酵母菌的拮抗機制并為基因工程改性高活性拮抗酵母菌提供科學參考。第三，實現載藥酵母菌微膠囊的可控釋放。首先定量評估酵母菌微膠囊與所搭載的化學抗菌劑兩者間的相互作用，在此基礎上通過對酵母菌細胞結構進行物化改性，實現載藥酵母菌微膠囊的可控釋放從而提高抗菌效率。以希望實現利用酵母菌及其衍生物的抗菌功能提高食品質量，保障食品安全。