金屬抗菌肽SIF4基于胞內生物大分子靶點的大腸桿菌非膜損傷抑菌機理

李玉珍，肖懷秋,*，劉 淼，王 琳，曾夢琪，趙謀明

（1.湖南化工職業技術學院制藥與生物工程學院，湖南 株洲 412000；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510000）

大腸桿菌（Escherichia coli）是引起食品公共安全事故與食物中毒的主要病原菌，由被污染食品或人際傳播，通過產生耐藥酶或改變藥物靶點、改變膜通透性、改變外膜孔蛋白結構、構建主動外排機制或形成生物膜獲得耐藥性，多重交叉耐藥菌株的出現使食源性致病菌防控變得復雜[1]。吳萱等[2]從北京市6 個轄區大型超市和農貿市場隨機采集生鮮肉樣本259 份，大腸桿菌檢出率65.25%，分離菌株對甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲惡唑高度耐藥；李明昊等[3]從山東不同地市41 個連鎖超市采集豬肉和雞肉樣品201 份，大腸桿菌檢出率100%，雞肉源菌株對頭孢菌素類耐藥率極顯著高于豬肉源菌株（P＜0.01），有48 株菌攜帶blaCTX-M耐藥基因；唐雪林等[4]從烏魯木齊市7 區19 家超市采集畜禽肉樣品353 份，大腸桿菌檢出率71.39%，其對四環素和氨芐西林耐藥性最高，耐藥基因A檢出率高達90.4%；馬振報等[5]從廣州市不同區域零售市場和超市采集畜禽肉樣本323 份，大腸桿菌檢出率74.61%，對氨芐西林（63.07%）、多西環素（47.72%）和復方新諾明（43.15%）耐藥率位列前三。

抗菌肽具有抗菌譜廣、穩定性好、特異性強、對哺乳動物細胞毒副作用少且不易產生耐藥性等優勢，可多靶點作用于食源性致病菌，是抗生素最具潛力的替代品，特別適用多重耐藥性食源性致病菌生物防控[6]。根據抗菌肽作用靶點不同，可分為靶向作用于細胞質膜的抗菌肽和非細胞質膜抗菌肽兩類[6]。天然抗菌肽（如G1OLO-L2OL2[7]、Arg-Ser-Ser[8]和zp37[9]等）可通過破壞細胞質膜結構和擾亂其生物功能造成胞內容物外泄和菌體凋亡，細胞質膜是主要作用靶點。研究表明，部分抗菌肽并不破壞細胞質膜結構和（或）擾亂細胞質膜功能，而是透過細胞質膜并靶向作用于胞內細胞器或生物大分子，如胞內核酸、拓撲異構酶、電子傳遞酶、熱休克蛋白、微管蛋白或G蛋白、信號通路受體蛋白等，或影響基因復制、轉錄與表達調控以及摧毀細胞骨架等[10]，如Buforin II可在不破壞細胞質膜前提下特征性與胞內DNA結合[11]；Indolicidin可抑制DNA合成并影響RNA和蛋白質合成，還能引發SOS修復途徑，引起DNA降解[12]；Linezolid可特征性結合核糖體50S亞基以抑制蛋白質起始復合物形成[13]；Histatin可與細胞質膜特定受體結合并誘導胞內ATP損失，破壞細胞周期并導致活性氧簇產生[14]。部分抗菌肽具有細胞質膜/非細胞質膜雙重效應靶點，如Indolicidin[15]和β-defensin[16]等。前期研究發現，金屬抗菌肽（以下簡稱金抗肽）SIF4對大腸桿菌有較好的抑制活性，并可破壞細胞質膜結構、增強膜通透性、誘導膜去極化和膜氧化損傷，導致胞內物質泄漏[17]，或抑制糖酵解途徑已糖激酶活性從而調控糖氧化效率[18]，或影響呼吸代謝、削弱細胞質膜離子通道ATP酶活性和抑制胞內ATP合成從而抑制菌體呼吸與能量代謝[19]，或破壞菌體細胞壁結構和改變菌體形貌[20]；綜上，金抗肽SIF4可基于細胞質膜/非細胞質膜對大腸桿菌實施抑菌，但基于大腸桿菌胞內生物大分子靶點的非細胞質膜抑菌機理尚不明晰，為揭示SIF4對大腸桿菌基于胞內生物大分子的非細胞質膜損傷機理，本實驗對SIF4作用下胞內核酸與蛋白質合成抑制情況和SIF4與胞內核酸靶點作用情況進行分析，以期為將SIF4應用于食源性大腸桿菌的生物防控提供理論與實踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金抗肽SIF4由本課題組前期研究獲得，對大腸桿菌ATCC25922的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）為0.4 mg/L[17]；大腸桿菌ATCC25922 上海保藏生物技術中心；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI） 美國Sigma-Aldrich公司；ATP、pBR322DNA、蛋白酶K、溶菌酶、RNase和溴化乙錠（ethidium bromide，EB）上海生工生物工程（上海）股份有限公司；牛肉膏、蛋白胨、NaCl 國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2550紫外分光光度計、RF-5301PC熒光分光光度計日本島津公司；JASCO J-810圓二色光譜儀 日本分光株式會社；H1850R高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；JY98-IIIDN超聲波細胞粉碎機寧波新芝生物有限公司；YXQ-LS-70A立式高壓滅菌鍋上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；瓊脂糖凝膠電泳裝置 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SIF4處理下胞內核酸生物合成情況分析

胞內核酸生物合成分析參考Li Lirong等[21]的方法并略作修改。離心收集對數生長期菌體并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.2 mol/L、pH 7.2）洗滌3 次，用LB培養基重懸至1×108CFU/mL，加入SIF4至終質量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC，以未添加SIF4為對照組（0 MIC，下同），37 ℃、120 r/min培養24 h，每4 h取2 mL培養液，4 000 r/min離心10 min，菌體沉淀用PBS洗滌3 次并重懸，取重懸液9.85 mL加入0.15 mL DAPI染色液（終質量濃度為15 μg/mL），避光振蕩培養10 min，測定DAPI-DNA熒光強度（λex＝364 nm，λem＝460 nm）和DAPI-RNA熒光強度（λex＝400 nm，λem＝460 nm）。

1.3.2 菌體基因組DNA的制備

菌體基因組DNA制備參考李婷等[22]的方法并略作修改。將大腸桿菌接種至LB培養基，于37 ℃、120 r/min條件下培養12 h。取10 mL菌懸液5 000 r/min離心10 min，用TE溶液洗滌菌體2 次，5 000 r/min離心10 min，菌體沉淀重懸于4 mL TE緩沖液。加入8 μL 50 mg/mL溶菌酶并于37 ℃溫育30 min；加入10 μL 10 mg/mL RNase和0.5 mL質量分數10% SDS溶液，37 ℃溫育30 min；加入10 μL 20 mg/mL蛋白酶K，37 ℃溫育90 min；加入等體積苯酚-氯仿-異戊醇混合液（25∶24∶1，V/V）混勻，8 000 r/min離心5 min；上清液轉入另一支離心管，加入1.8 mL 3 mol/L醋酸鈉、18 mL冰無水乙醇，12 000 r/min離心2 min，重復抽提2 次，所獲沉淀即基因組DNA。沉淀用體積分數70%乙醇溶液洗滌一次，室溫干燥。加入0.5 mL TE緩沖液溶解并測定OD260nm和OD280nm以評價DNA含量和純度，－20 ℃保藏備用。

1.3.3 SIF4與EB競爭性結合DNA熒光光譜分析

傳統上，對于無線點數較少，覆蓋范圍不廣的區域，一般會采用胖無線接入點AP(Access Point)，如圖1所示。這種方式需要對逐臺設備進行配置和管理，無法形成一個整體，無法實現無線網絡中的漫游服務功能。這種方式在校園內無線點數比較密集，用戶移動性比較頻繁的情況下，是不適合的。

DNA熒光光譜分析參考陳旋等[23]的方法并略作修改。將1 mL 50 μg/mL基因組DNA與15 μL 100 μg/mL EB溶液混勻，37 ℃避光溫育10 min。加入SIF4至終質量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC，以等體積無菌蒸餾水代替SIF4為對照組。振蕩混勻，37 ℃避光溫育30 min。用熒光分光光度計檢測反應液在550～750 nm波長范圍內的熒光強度（λex＝535 nm，λem＝550 nm）。

1.3.4 紫外吸收光譜分析

紫外吸收光譜分析參考Tang Yali等[24]的方法并略作修改。將50 μg/mL基因組DNA與SIF4混合，使SIF4終質量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC，以等體積蒸餾水代替SIF4為對照組，振蕩混勻，37 ℃孵育30 min，于220～320 nm區間進行紫外掃描。

1.3.5 圓二色光譜分析

圓二色光譜分析參考郝剛等[25]的方法并略作修改。移取100 μL 50 μg/ml基因組DNA與SIF4混合，使SIF4終質量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2MIC，以未添加抗菌肽的為對照組，37 ℃溫育10 min，室溫條件下進行圓二色光譜掃描（220～320 nm）。

1.3.6 SIF4處理下胞內蛋白質生物合成情況分析

SIF4處理下胞內蛋白質生物合成情況分析參考郭娟等[26]的方法并略作修改。離心收集對數生長期菌體并用PBS洗滌3 次，用LB培養基重懸至1×108CFU/mL，加入SIF4至終質量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC，以未添加SIF4為對照組，37 ℃、120 r/min培養24 h，每4 h移取2 mL培養液于4 000 r/min離心10 min，菌體沉淀用PBS洗滌3 次，用50 μL TE緩沖液和50 μL溶菌酶重懸，37 ℃溫育10 min；取出置冰浴中并加入500 μL冰純水和500 μL預冷20%（質量分數，下同）三氯乙酸溶液，混勻后冰浴10 min，離心棄上清液，加入1 mL預冷10%三氯乙酸溶液懸浮，離心棄上清液。將沉淀轉移至干凈試管并加入500 μL 0.15 mol/L的NaCl和5 mL考馬斯亮藍染色液，混勻后于595 nm波長處測定吸光度。

1.4 數據處理與分析

實驗結果表示為平均值±標準偏差（n＝3），采用SPSS Statistic 25軟件對平均值進行方差分析檢驗，僅進行組內平均值差異多重比較。方差齊性時采用最小顯著性差異法進行事后多重比較，否則采用塔姆黑尼（T2）進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 SIF4對胞內核酸生物合成的影響

圖1 SIF4對胞內核酸生物合成的影響Fig. 1 Effect of SIF4 on intracellular nucleic acid biosynthesis

由圖1可看出，各實驗組熒光強度均低于對照組，表明經SIF4處理后，大腸桿菌胞內核酸的生物合成均受到不同程度抑制，熒光強度下降與處理劑量和處理時間呈正相關；由圖1A可看出，培養4～16 h時，1/2 MIC與對照組熒光強度無顯著性差異（P＞0.05），繼續培養則呈現顯著性差異（P＜0.05）；MIC和2MIC組與對照組均有顯著性差異（P＜0.05），培養20 h時，相比對照組，1/2 MIC、MIC和2 MIC組DAPI-DNA復合物熒光強度分別下降5.37%、17.43%和47.52%，而培養24 h時，1/2 MIC、MIC和2 MIC組所形成的DAPI-DNA復合物熒光強度相比對照組則分別下降5.96%、20.24%和53.39%，DAPI-DNA復合物熒光強度明顯下降說明SIF4能夠競爭DAPI和基因組DNA的結合位點，即推斷金抗肽SIF4與基因組DNA的結合方式也為溝槽結合，且溝槽結合程度存在劑量效應關系；由圖1B可知，實驗組DAPI-RNA熒光強度與對照組均有顯著性差異（P＜0.05）。培養20 h時，相比對照組，1/2 MIC、MIC和2 MIC組DAPI-RNA復合物熒光強度分別下降38.24%、50.04%和52.44%，而培養24 h時，各實驗組所形成的DAPI-RNA復合物熒光強度相比對照組則分別下降41.72%、55.79%和57.07%，DAPI-RNA熒光強度顯著降低說明金抗肽SIF4可與RNA進行結合。由圖1A和圖1B可看出，金抗肽SIF4對DAPI-DNA和DAPI-RNA復合物結合的抑制趨勢基本相似，推測SIF4可能通過抑制DNA生物合成來影響RNA轉錄生物量[22]，金抗肽SIF4與基因組DNA的結合方式仍需進一步確認。

2.2 DNA熒光光譜分析結果

EB是一種靈敏度高、選擇性強的DNA熒光探針，結構中含有一個可嵌入DNA堿基平面的三環平面基團，可通過靜電吸附與DNA磷酸骨架結合，或以嵌入方式插入雙鏈DNA堿基平面[21]。當抗菌肽與EB競爭性共存并結合DNA時，EB-DNA體系熒光強度會減弱，說明抗菌肽以類似EB嵌插方式與DNA結合。SIF4與EB競爭性結合DNA熒光光譜如圖2所示。

圖2 SIF4與EB競爭性結合DNA熒光光譜Fig. 2 Fluorescence spectra of competitive binding of SIF4 and EB to genomic DNA

由圖2可看出，EB-DNA復合物的特征性熒光吸收峰在590 nm波長處，隨著SIF4質量濃度增加，基因組DNAEB熒光強度存在不同程度衰減，且組間存在顯著性差異（P＜0.05）。本研究還發現，隨著抗菌肽濃度增加，EB-DNA復合物熒光強度雖有不同程度衰減，但復合物發射峰特征性光譜位置并沒有發生明顯紅移或藍移，說明SIF4添加后并未對EB-DNA體系微環境造成顯著影響，只是競爭性地將EB從基因組DNA堿基平面替換下來，從而表現為EB-DNA熒光強度衰減。由此可說明，SIF4可與基因組DNA以嵌插的方式結合。此外，SIF4為陽離子金屬抗菌肽[27]，結構中正電荷的堿性氨基酸殘基可與DNA酸性磷酸基團靜電吸附，C-端的兩親α-螺旋疏水基團嵌插至DNA內部疏水溝槽中，從而減弱了EB-DNA體系熒光強度[21]。

2.3 SIF4與基因組DNA互作紫外光譜吸收分析結果

DNA可通過嵌插結合、靜電結合及溝槽結合的方式與小分子物質互作并引起吸收光譜紅（藍）移或增（減）色效應，是小分子物質與DNA堿基間π-π體系、偶極-偶極互作及疏水相互作用綜合結果[28]。DNA由于含有嘌呤和嘧啶等共軛雙鍵芳香堿基及磷酸生色基團，在近紫外區有強的π→π*電子躍遷，在260 nm波長處呈現強吸收峰，若抗菌肽以靜電吸附的方式結合到DNA磷酸骨架，或嵌入到DNA堿基平面，可改變DNA構象并產生減色效應或紅移現象，而DNA雙螺旋結構若破壞則會產生增色效應，嵌插作用強弱與減色效應呈正相關[15]。SIF4與基因組DNA結合紫外光譜如圖3所示。

圖3 SIF4與基因組DNA結合紫外吸收光譜Fig. 3 UV spectra of SIF4 binding to genomic DNA

由圖3可看出，基因組DNA在約260 nm波長處有特征性吸收光譜，各實驗組最大吸光度隨SIF4處理劑量的增加而呈遞減趨勢，說明抗菌肽SIF4可與基因組DNA以靜電吸附或嵌插的方式結合，使DNA分子構象發生改變并引起減色效應[15]。本研究還發現，隨著抗菌肽的加入，SIF4與基因組DNA結合后最大吸收紫外光譜峰由260 nm藍移至255 nm左右，藍移了5 nm，說明金抗肽SIF4可能以嵌插方式與基因組DNA結合[29]。由于SIF4與基因組DNA結合并未引起增色效應，說明SIF4與基因組DNA結合并不會導致基因組雙螺旋DNA結構斷裂，而是通過靜電結合或嵌插至DNA堿基平面引起DNA結構的改變，從而影響基因組DNA的紫外吸收光譜[30]。

2.4 SIF4與基因組DNA結合方式的圓二色光譜分析

由于脫氧核糖具有不對稱碳原子，其偶極能和堿基不對稱地發生互作并顯示圓二色性，嘧啶核苷表征正康普頓效應（正圓二色光譜），嘌呤核苷表征負康普頓效應（負圓二色光譜）[31]。小分子物質與DNA互作可干擾螺旋度和堿基堆積的DNA結構，DNA圓二色光譜特征峰常位于230～300 nm。當DNA發生變性時只在約270 nm波長處出現正峰，240 nm波長處峰消失；DNA由B構型向C構型轉變時，雙螺旋結構變得松散，堿基間堆積力變弱，負峰發生紅移[31]。SIF4與基因組DNA互作的圓二色光譜如圖4所示。

圖4 SIF4與基因組DNA互作的圓二色光譜Fig. 4 CS spectra of interaction between SIF4 and genomic DNA

由圖4可看出，大腸桿菌基因組DNA呈典型B-DNA結構，270 nm和240 nm波長處出現特征正峰和負峰，270 nm波長處正峰是由堿基堆積力作用形成，240 nm波長處負峰是由雙螺旋B型構象形成，與右手螺旋有關[25]。當基因組DNA與SIF4結合后，270 nm波長處正峰強度明顯降低，說明基因組DNA與SIF4結合后構象發生改變，削弱了堿基間π-π堆積效應，抗菌肽還與DNA堿基發生溝槽結合，且隨著質量濃度增加，溝槽結合互作效果更明顯，雙螺旋結構變得松散[25]。同時還發現，SIF4與基因組DNA結合后沒有引起增色效應，說明SIF4加入只影響DNA二級結構，并未引起雙螺旋解鏈[25]；此外，各實驗組240 nm波長處負峰強度相比對照組均有一定衰減并發生輕微紅移（243 nm），可能是DNA結構由B構型向C型轉變以及DNA雙螺旋結構疏松導致[25]，從而對DNA復制、mRNA轉錄和蛋白質翻譯等產生不同程度的影響。

2.5 SIF4對胞內蛋白質生物合成的影響

胞內物質與能量代謝關鍵酶、組織蛋白、細胞質膜蛋白及受體蛋白等的主要化學組成為蛋白質，胞內蛋白質合成水平關系著菌體細胞健康狀態，監測胞內蛋白質合成水平可表征菌體生存狀態。SIF4對胞內蛋白質合成的影響如圖5所示。

圖5 SIF4對胞內蛋白質生物合成的影響Fig. 5 Effect of SIF4 on intracellular protein biosynthesis

由圖5可看出，對照組胞內蛋白質水平隨培養時間延長而增加，特別是0～16 h內，胞內蛋白質增幅明顯，表明菌體蛋白質轉錄和翻譯進程正常；由圖5還可看出，在培養4～8 h時，1/2 MIC和MIC組與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），可能是由于抗菌肽作用于菌體時間較短，短時間內細胞膜結構受損較輕，故對胞內蛋白質生物合成影響較少，這與郭娟等[26]的研究結論基本一致；2 MIC組與對照組均存在顯著性差異（P＜0.05），培養4、8、12、16、20 h和24 h時，相比對照組，2 MIC組胞內蛋白質含量分別下降19.43%、11.62%、48.84%、63.89%、65.73%和69.23%，由此可說明，SIF4對胞內蛋白質合成的抑制效應與處理時間存在明顯關系，提示SIF4可能結合DNA和（或）RNA，在轉錄水平或翻譯水平抑制蛋白質生物合成，本課題組前期研究還發現，SIF4可破壞細胞質膜結構并使胞內蛋白質泄漏，從而降低胞內蛋白質含量[17]。

3 結 論

DAPI熒光光譜分析結果表明，SIF4處理后可不同程度地抑制胞內核酸生物合成，抑制效果與SIF4處理劑量和處理時間密切相關。培養4～16 h，低質量濃度（1/2 MIC）SIF4處理對菌體胞內DNA合成影響不顯著（P＞0.05），MIC和2 MIC組與對照組DNA合成均有顯著差異（P＜0.05），培養24 h時，1/2 MIC、MIC和2 MIC組DAPI-DNA復合物熒光強度相比對照組分別下降5.96%、20.24%和53.39%，表明SIF4存在競爭DAPI和基因組DNA的結合位點，結合方式為溝槽結合；各實驗組DAPIRNA熒光強度與對照組均有顯著差異（P＜0.05），表明SIF4可競爭性結合DAPI-RNA結合位點，推測SIF4可能通過抑制DNA生物合成影響RNA轉錄生物量；EB競爭性結合DNA熒光光譜分析結果表明，隨著SIF4質量濃度的增加，基因組DNA-EB熒光強度存在不同程度衰減，且組間存在顯著差異（P＜0.05），基因組DNA-EB復合物特征光譜位置沒有發生明顯位移，說明SIF4可以通過嵌插方式競爭性替換EB與基因組DNA結合[21]；SIF4與基因組DNA互作紫外光譜分析結果表明，SIF4可與基因組DNA發生靜電吸附或嵌插結合，使DNA分子構象發生改變并引起減色效應[15,29]。SIF4與基因組DNA結合未觀察到增色效應，說明基因組DNA沒有發生結構斷裂，SIF4只通過靜電結合或嵌插至DNA堿基平面引起DNA結構的改變并影響基因組DNA紫外吸收光譜；圓二色光譜分析結果表明，基因組DNA與SIF4溝槽結合后，雙螺旋結構未斷裂，但構象發生改變，堿基間π-π堆積力減弱[25]。240 nm波長處負峰不同程度衰減并發生輕微紅移，提示DNA結構由B構型向C型轉變，雙螺旋結構變得疏松[25]；短時間培養（4～8 h），1/2 MIC和MIC組與對照組胞內蛋白質含量差異不顯著（P＞0.05），但2 MIC組與對照組均存在顯著性差異（P＜0.05）。總體來說，SIF4可通過與基因組DNA進行靜電吸附或嵌插結合進入到DNA溝槽，影響DNA復制、RNA轉錄生物量以及蛋白質翻譯，實現大腸桿菌非膜損傷抑制。

本課題組前期研究發現，SIF4可破壞細胞質膜結構、細胞質膜通透性與膜生物功能，影響菌體糖代謝、能量代謝及細胞結構與形貌[17-20]，其可能是通過破壞菌體細胞壁和細胞膜結構后進入胞內，并影響胞內生物大分子結構與功能從而實現協同抑菌，抑菌作用是否存在先后尚不清楚，需進一步研究確認。為更好地全面解析金抗肽SIF4對大腸桿菌的抑菌機理，本課題組下一步擬在分子生物學層面、轉錄組學與蛋白質組學層面開展抑菌機理的深層次探究，具體包括：1）研究金抗肽SIF4不同作用劑量條件下對DNA復制相關的rnhA、ssb、dnaG、ligB等基因及DNA損傷修復相關的recA、recN等基因表達水平的影響并進行基因表達分析；同時，采用流式細胞術分析金抗肽SIF4對大腸桿菌細胞周期的影響；2）采用轉錄組學RNA-seq技術研究金抗肽SIF4作用下菌體胞內mRNA轉錄調控狀態和差異基因，篩選重要差異表達基因，注釋這些差異表達基因參與的代謝途徑，同時，結合菌體代謝途徑驗證其基因表達相關功能，理清SIF4處理對菌體代謝相關基因正/負調控機理；3）采用代謝組學技術對金抗肽SIF4處理后菌體內部代謝物種類和含量變化規律進行解析，篩選差異代謝物并進行通路注釋分析，結合轉錄組學結果構建菌體基因-代謝物調控網絡圖，在代謝組學層面解析菌體內部物質變化、流向及調控規律。