超聲處理結合pH值調控對白果分離蛋白/乳清分離蛋白復合凝膠特性的影響

尤潔瑜，唐長波，張露妍，張 薇，王耀松,*

（1.南京林業大學輕工與食品學院，江蘇 南京 210037；2.南京農業大學食品科學技術學院，肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095）

銀杏果俗稱白果，作為一種藥食同源物質，其內含豐富的生物活性物質[1]，因此逐漸進入功能性健康食品的范疇[2]。近些年，隨著銀杏樹的廣泛種植，其果實的開發利用逐漸受到重視，特別是其果實的蛋白組分引起了人們廣泛的關注[3]。在前期的研究中，有學者發現白果分離蛋白（ginkgo seed protein isolate，GSPI）具有一定的凝膠性和營養價值，然而其食品品質有待進一步提高[4]，以滿足實際食品應用體系對其感官品質及營養品質的要求[5]。

乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）作為食品工業中常見的食品配料[6]，其主要組分為各類球蛋白，具有極高的營養價值以及極好的成膠性[7-8]，已廣泛應用于各類食品體系[9]。然而在乳清蛋白生產過程中會增加溫室氣體的排放，且所需土地面積較大，成本相對較高[10]，將其引入到GSPI中可在彌補GSPI凝膠性能缺陷的同時降低食品生產成本。有研究表明，乳清蛋白無論與植物蛋白（如大豆蛋白[11-12]、菜籽蛋白[13]）還是動物蛋白[12,14]復合，其所形成復合物的凝膠性能均能得到顯著提升。

簡單地將兩種蛋白混合雖然能夠提高存在缺陷一方的蛋白性能，但復合蛋白的功能特性仍有進一步提高的空間。超聲處理作為一種簡單高效的物理加工手段被廣泛應用于蛋白改性中[15]，超聲改性蛋白主要是通過超聲產生的空化效應、剪切和液體湍流等方式，影響蛋白質分子間的疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵等作用[16]，從而改變蛋白的功能特性；在蛋白凝膠體系中，超聲處理能夠顯著改善各類蛋白的凝膠特性[17]。此外，蛋白的凝膠性受pH值的影響較大[18]。

本研究將GSPI與WPI進行復合，采用不同超聲功率處理并調控pH值，通過表征復合蛋白溶液的物化性質、蛋白分子行為及所形成熱誘導凝膠的質構、持水性及微觀結構，探究超聲處理及pH值對復合凝膠成膠性的影響，以期提升凝膠的質地性能和持水性能，為實際食品工業生產提供技術支持和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白果 徐州淳康生物有限公司；WPI（蛋白相對含量90%） 美國Hilmar公司；正己烷 上海凌峰化學試劑有限公司；其他試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SpectraMax i3x多功能酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；JY92-IIDN型超聲波細胞粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Zetasizer Nano ZS90粒徑電位分析儀 英國Malvern公司；TA.XT Plus質構儀 英國Stable Micro Systems公司；FE28 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；VERTEX 80 V傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrum，FTIR）儀 德國Bruker公司；Prisma E環境掃描電子顯微鏡 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 GSPI的提取

參照Zhang Weiwei等[19]的方法提取GSPI。將去皮的白果仁置于40 ℃烘箱中干燥72 h，用粉碎機粉碎后過80 目篩。將白果粉與正己烷按1∶9（m/V）的比例混合，脫脂2 次。采用堿溶酸沉法，將得到的脫脂粉按1∶10（m/V）溶于去離子水中，用1 mol/L NaOH溶液調節pH值至9.0，在室溫下攪拌30 min，然后在10 000×g、4 ℃的條件下離心15 min。用1 mol/L HCl溶液調節離心后的上清液至pH 4.4，在相同條件下離心15 min。將離心后的蛋白沉淀分散于5 倍質量的去離子水中，用1 mol/L NaOH溶液調至pH 7.0，冷凍干燥后備用。

1.3.2 GSPI/WPI溶膠的制備

將GSPI和WPI分別溶解在去離子水中，質量濃度均為120 g/L，室溫下攪拌4 h，然后置于4 ℃下儲存過夜，確保溶液均勻分散并完全溶解。將過夜儲存的兩種蛋白溶液按體積比1∶1混合（pH 6.7），并在200 r/min下攪拌2 h。將混合溶液分成3 份，用1 mol/L HCl溶液分別調至pH 4.0、5.0、6.0，繼續攪拌1 h。將不同pH值的混合溶液分為4 份，共12 份，每份6 mL。將質量濃度為120 g/L的GSPI/WPI蛋白溶液轉移到內徑2.0 cm、高3.5 cm的燒杯中進行超聲處理。

1.3.3 超聲處理及GSPI/WPI復合蛋白凝膠的制備

參照Zhao Ruixuan等[20]的方法，在冰水浴條件下，用直徑為6 mm的探頭浸入溶液中，超聲處理時間為5 min，其中超聲時間5 s、間隔時間5 s。超聲總功率為900 W，設置輸出功率分別為總功率的25%、45%、65%，未超聲處理的樣品作為對照組（即輸出功率為0 W）。用塑料薄膜將所有樣品密封并在膜上扎孔，置于90 ℃水浴鍋中加熱30 min，將樣品冷卻至室溫后在4 ℃下儲存12 h以形成熱誘導凝膠。測試前，使凝膠樣品于室溫下平衡2 h。

1.3.4 蛋白質溶解度測定

參照Wang Yaosong等[21]的方法測定超聲處理后不同pH值條件下的蛋白溶解度。超聲處理后的GSPI/WPI復合溶膠用相應pH值的檸檬酸磷酸鹽緩沖液（citratephosphate buffer，CPB）稀釋至10 mg/mL。在5 000×g、25 ℃條件下離心10 min后，采用雙縮脲試劑測定上清液中的蛋白質量濃度。蛋白質溶解度以上清液中的蛋白質量濃度占初始總蛋白質量濃度（10 mg/mL）的比例表示。

1.3.5 蛋白表面疏水性和表面巰基含量測定

參考Shi Ruijie等[22]的方法稍加改動，用1-苯氨基萘-8-磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）作為熒光探針，對超聲處理后GSPI/WPI復合溶膠的疏水性進行測定。將各復合溶膠樣品分別稀釋至0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL。隨后將20 μL ANS溶液與2 mL稀釋的樣品溶液充分混合，在黑暗中反應15 min。使用熒光分光光度計在365 nm激發波長和484 nm發射波長下測定熒光強度。表面疏水性用熒光強度和蛋白質量濃度之間線性回歸方程的初始斜率表示。

巰基含量的測定參照Beveridge等[23]的方法并進行一些修改。超聲處理后的樣品用相同pH值的CPB稀釋到2 mg/mL；取2 mL稀釋液加入50 μL 5,5’-二硫代二硝基苯甲酸鹽（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）溶液（現配現用，濃度為10 mmol/L），混合均勻后避光反應15 min，在412 nm波長處測定樣品溶液的吸光度。巰基含量按下式計算。

式中：A412nm為溶液在412 nm波長處的吸光度；ρ為稀釋后的蛋白質量濃度/（mg/mL）；ε為摩爾消光系數（13 600 L/（mol·cm））。

1.3.6 溶膠粒徑測定

分析前將超聲后的樣品溶液稀釋到2 mg/mL，避免高質量濃度引起多重散射。粒徑分布主要基于動態光散射表征，使用粒徑電位儀測定樣品溶液的粒度，上樣量為1 mL，折射率和吸收參數分別設置為1.33和0.1。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

根據Laemmli[24]的方法，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析不同pH值條件下超聲功率對GSPI/WPI的影響。將超聲處理后的GSPI/WPI復合溶液稀釋至2 mg/mL，分別加入等體積的還原劑（體積分數5%β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME））或非還原劑（0.5 mmol/LN-乙基順丁烯二酰亞胺），混合均勻。將混合溶液煮沸3 min，冷卻至室溫備用。SDS-PAGE在5%（體積分數，下同）濃縮膠和12%分離膠中進行，每孔的上樣量均為15 μg。

1.3.8 質構特性測定

參照He Zhendong等[25]的方法進行修改，從燒杯中取出制備的GSPI/WPI復合凝膠（高1.8 cm、直徑2.0 cm），選擇P/0.5的圓柱形探頭測試凝膠的紋理特性。參數設定：實驗前、后速率均為5.0 mm/s，測試速率為2.0 mm/s，壓縮距離為7 mm，觸發力為5 g，進行2 個循環的壓縮實驗。

1.3.9 持水性測定

參照Wang Yaosong等[26]的方法，將超聲處理后的GSPI/WPI凝膠從燒杯中取出，在3 000×g、20 ℃條件下離心20 min。仔細排除上清液，記錄凝膠離心前后的質量。持水性以離心后剩余凝膠質量與離心前樣品初始質量的百分比表示。

1.3.10 FTIR測定

分析前，對超聲處理后不同pH值的凝膠樣品進行冷凍干燥。取約1 mg干燥后的樣品加入100 mg溴化鉀中，研磨成均勻的粉末并進行壓片。用FTIR儀掃描4 000～400 cm－1范圍內的FTIR光譜，分辨率設置為4 cm－1，掃描背景吸收進行基線校正。

1.3.11 微觀結構觀察

使用Prisma E環境掃描電子顯微鏡觀察凝膠的微觀結構。將超聲處理后不同pH值的蛋白凝膠從玻璃杯中取出并切片，用雙面膠固定凝膠樣品，對其橫截面進行噴金處理。將樣品置于20 kV電子加速電壓的掃描電子顯微鏡下觀察，放大倍數為10 000 倍，觀察尺度為10 μm。

1.4 數據統計與分析

所有實驗重復測定3 次，用最小顯著性差異法進行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著，使用Statistix 9軟件通過方差分析（ANOVA）對實驗數據進行分析，采用Sigmaplot 10.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 復合蛋白的溶解度、表面疏水性、表面巰基含量和粒徑

溶解度是影響蛋白質功能特性的一個重要參數，受到pH值的影響。如圖1A所示，GSPI/WPI樣品在pH 6.0條件下的溶解度整體較高，這是因為遠離白果蛋白等電點（pI 4.4）后，復合蛋白帶有更多負電荷，靜電排斥較強，有助于蛋白質的溶解；而pH 4.0和pH 5.0更靠近等電點，靜電排斥較弱，導致蛋白質溶解度降低[27]。經過超聲處理后，超聲波產生的空化作用可能會影響蛋白質的三級結構，使蛋白質分子展開或折疊聚集，但對于GSPI/WPI復合蛋白的溶解度影響較弱，相同pH值下超聲處理樣品的溶解度沒有顯著差異。

圖1 超聲對不同pH值GSPI/WPI溶解度（A）、表面疏水性（B）、表面巰基含量（C）和粒徑（D）的影響Fig. 1 Effect of ultrasonic treatment on the solubility (A), surface hydrophobicity (B), surface sulfhydryl group content (C) and particle size (D)of GSPI/WPI at different pH levels

表面疏水性與蛋白質的構象、大小、氨基酸組成和序列以及分子內和分子間連接有關[28]，可用于研究蛋白質三級結構的變化。如圖1B所示，GSPI/WPI的表面疏水性隨著pH值的升高而降低。有研究表明，酸性環境更有利于疏水氨基酸殘基的暴露，從而導致親水基團的嵌入[29]。pH值的增加使GSPI/WPI表面帶有更多負電荷，這可能會引起蛋白質的自聚集，從而降低其表面疏水性。超聲處理后的GSPI/WPI疏水性隨著超聲功率的增大而減弱，這可能是因為超聲使GSPI和WPI蛋白結構展開并產生新的交聯，從而使蛋白顆粒重新聚集，進而減少了疏水基團的暴露。

表面巰基對蛋白質的結構穩定性起重要的作用，可通過測定巰基含量研究蛋白的結構變化，在過氧化條件下巰基易形成二硫鍵，從而改善蛋白的凝膠網絡結構[30]。如圖1C所示，隨著pH值的增加，蛋白的表面巰基含量減少，這可能是因為靜電斥力的作用使蛋白結構展開、亞基解聚，蛋白內包裹的巰基被氧化為二硫鍵[31]。隨著超聲功率的增強，蛋白的表面巰基含量也隨之增加，這可能是因為超聲處理降低了蛋白的聚集程度，超聲波空化效應沖擊波破壞了GSPI/WPI復合蛋白聚集體之間的二硫鍵，使其斷裂并形成—SH基團[20]。在超聲過程中，蛋白分子的破碎、重排和聚合可能會同時發生，高強度的超聲環境可能會產生新的自由基和超氧化物，從而影響表面巰基的含量。

如圖1D所示，在等電點附近，蛋白質分子間的靜電作用較弱，更易形成粒徑較大的聚集體。而在pH 6.0時，靜電斥力占主導，疏水作用較弱[32-33]，使蛋白質顆粒分散且尺寸較小。隨著超聲功率的升高，GSPI/WPI的粒徑呈現先減小后增大的趨勢。在較低功率下，超聲波的高剪切力和空化作用破壞了蛋白質分子間的聚集，形成粒徑較小的蛋白顆粒[34]。隨著超聲功率的增加，GSPI/WPI的粒徑增大，高功率的超聲可能會加速GSPI/WPI蛋白分子互相碰撞，促進蛋白分子間的相互作用，形成分子質量較大的聚集體。這與Jiang Lianzhou等[35]的研究中超聲對黑豆分離蛋白粒徑影響的結果一致，他們發現高功率的超聲處理使黑豆分離蛋白聚集體重組，從而導致顆粒尺寸增加。Zhang Tiehua等[36]的研究表明，經高功率的超聲處理后，轉谷氨酰胺酶交聯乳清蛋白的粒徑明顯增加，這可能是因為超聲破壞了相關的非共價相互作用。

2.2 復合蛋白SDS-PAGE分析結果

如圖2所示，在非還原條件下（不添加β-ME），主要條帶包括GSPI中的G1和G2以及WPI中的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。其中G1和G2條帶蛋白可能分別是銀杏種子中的11S豆蛋白Ginnacin和7S類豌豆球蛋白[36-37]。超聲處理后條帶位置未受影響，條帶強度無明顯變化。在不添加β-ME的條件下，觀察到電泳條帶的頂部出現了高分子質量的蛋白聚集體。當加入β-ME后，G1和G2條帶蛋白降解，并出現低分子質量的多肽，其中G1條帶蛋白分裂成G4和G5條帶蛋白。Ginnacin是一種六聚體蛋白，類似于其他豆科蛋白，每個亞基由一個酸性多肽（G5）和一個堿性多肽（G4）組成，兩者通過二硫鍵形成共價連接。在非還原條件下，Ginnacin在SDS-PAGE中的分子質量為49 kDa，而還原后其酸性亞基和堿性亞基分子質量分別為約28 kDa和約20 kDa[19]。G2條帶蛋白在還原條件下（添加β-ME）也產生了酸誘導降解，電泳條帶頂部的大分子聚集體消失，可能是二硫鍵被氧化后斷裂，大分子降解成低分子質量多肽所致。

圖2 超聲處理及不同pH值條件下GSPI/WPI的SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE patterns of ultrasound-treated GSPI/WPI at different pH levels

2.3 復合蛋白凝膠的質構特性

通過單軸雙壓縮實驗研究不同超聲功率處理下不同pH值GSPI/WPI凝膠的質地屬性（包括硬度、彈性、黏聚性、膠黏性、咀嚼性和回復性）（圖3）。凝膠的硬度是指在第一次壓縮循環期間測得的最大阻力，pH 4.0條件下的GSPI/WPI凝膠強度明顯弱于pH 5.0、6.0。超聲處理后，不同pH值條件下蛋白凝膠的強度隨超聲功率的增加而增強。超聲功率為65%時，pH 5.0的凝膠硬度從83 g增加到164 g，pH 4.0的凝膠硬度是未超聲組的2.7 倍。凝膠的口感與嚼勁反映了其食品性能，因此與硬度高度相關。彈性為凝膠在減壓后恢復其原始形狀的能力。pH 4.0條件下的蛋白凝膠彈性較差，但隨著超聲功率的增加，其彈性明顯增大。黏聚性為凝膠在兩次連續壓縮期間保持其整體網絡結構的能力[38]。GSPI/WPI蛋白凝膠的回復性和黏聚性也隨超聲功率的增大而呈現增大趨勢。

圖3 超聲對不同pH值條件下GSPI/WPI熱誘導凝膠質構特性的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic treatment on texture properties of heat-induced GSPI/WPI gel at different pH levels

GSPI/WPI熱誘導凝膠特性受pH值影響的原因是凝膠內部網絡結構的改變。有研究表明，WPI在低pH值條件下會形成剛性的細股網絡，在高pH值條件下則會形成柔性的彎曲股網絡[39]。當溶液的pH值接近蛋白等電點時，弱的靜電斥力會使其形成顆粒凝膠，與細鏈凝膠相比，松散的顆粒凝膠間連接較少，形成的凝膠硬度和彈性較差。超聲處理有效提高了GSPI/WPI復合凝膠的硬度、彈性和咀嚼性。超聲波帶來的空化作用使復合凝膠形成了更加緊密均勻的凝膠網絡，暴露的疏水殘基有利于蛋白質分子間的相互作用，從而提高了其凝膠強度[40]。Alting等[41]的研究表明，巰基含量在決定葡萄糖酸內酯誘導的WPI凝膠強度中起主導作用。本研究發現，隨著超聲功率的增大，游離巰基的含量增加，與凝膠強度的變化趨勢相印證。綜上，超聲影響了GSPI/WPI間的分子結構，從而改善了復合蛋白凝膠的質構特性。

2.4 復合蛋白凝膠的持水性

如圖4所示，超聲處理后，不同pH值條件下GSPI/WPI凝膠的持水性差異較大。有研究表明，蛋白質在等電點處形成的顆粒凝膠孔隙較大，截留水的能力較弱，而細鏈凝膠結構更均勻，所以擁有更好的持水性[42]。隨著超聲功率的增加，GSPI/WPI凝膠的持水性也有所提升，超聲波帶來的空化效應使蛋白結構產生改變。加熱過程中，蛋白質的共價鍵與非共價鍵共同作用，形成具有一定三維網絡結構的體系，而超聲引起巰基含量的增加，更有利于蛋白質間的相互作用。加熱過程中，游離巰基形成新的二硫鍵，也因此增強了復合凝膠的硬度[43]。

圖4 超聲對不同pH值條件下GSPI/WPI復合凝膠持水性的影響Fig. 4 Effect of ultrasonic treatment on water-holding capacity of GSPI/WPI composite gel at different pH levels

2.5 復合蛋白凝膠的FTIR分析

如圖5所示，超聲沒有使GSPI/WPI光譜圖引入新的峰，這意味著復合凝膠中沒有形成新的共價鍵。3 600～3 100 cm－1處有較寬的吸收峰，對應羥基—OH鍵和氫鍵的伸縮振動。2 960 cm－1附近的峰反映C—H基團的伸縮振動。此外，還可以觀察到1 640、1 530 cm－1和1 230 cm－1處的典型蛋白質吸收峰，分別對應蛋白質的酰胺I帶、酰胺II帶和酰胺III帶[44]，這可以用來表征蛋白質中氫鍵的強度和所形成二級結構的類型。經過高功率的超聲處理后，—OH伸縮振動的吸收帶向較低的波數（約3 300 cm－1）轉移，這表明超聲使兩種蛋白分子之間的羥基相互作用增強，從而形成氫鍵，與2.3節復合凝膠質構特性的變化相符合，即超聲使凝膠硬度增加。在pH 5.0條件下，相比于沒有經過超聲處理的GSPI/WPI復合凝膠，超聲導致FTIR圖譜中酰胺I帶（1 640 cm－1）強度增大，且向更高的波數（1 644 cm－1）移動，表明超聲改變了蛋白的空間結構，使蛋白的二級結構發生改變，從而使其交聯程度提高[45-46]。

圖5 超聲處理及不同pH值條件下GSPI/WPI凝膠的FTIR圖譜Fig. 5 FTIR spectra of GSPI/WPI gel formed with ultrasonic treatment at different pH levels

2.6 復合蛋白凝膠的微觀結構分析

如圖6所示，通過掃描電子顯微鏡可以觀察超聲處理后不同pH值條件下GSPI/WPI復合凝膠放大后的微觀結構，從微觀水平上表征蛋白質凝膠的形貌。pH 4.0條件下的GSPI/WPI復合凝膠展現出較為光滑的凝膠網絡結構，這是因為靜電斥力的作用促進了蛋白質的展開。而pH 5.0、6.0條件下GSPI/WPI復合凝膠更靠近等電點，呈現出明顯的顆粒結構，由粗聚集體球形顆粒組成。超聲處理后，復合凝膠的蛋白結構因為超聲波的空化作用而展開，因此分布得更加緊密均勻，孔隙更小，這有助于凝膠中蛋白質對水分子的捕捉，也解釋了其持水性增加的原因。pH 5.0條件下的復合凝膠在超聲作用下呈現出明顯的網絡聚集，蛋白質之間的相互作用增強，隨著超聲功率的增加，蛋白質形成分子質量更大的聚集體，這與超聲后復合蛋白粒徑增大的現象相印證。

圖6 超聲處理及不同pH值條件下GSPI/WPI凝膠的微觀結構Fig. 6 Microstructure of GSPI/WPI gel formed with ultrasonic treatments at different pH levels

3 結 論

GSPI/WPI復合物在超聲處理后蛋白結構及溶膠的物化特性和凝膠性均有較為明顯的變化，這些變化與復合物的pH值也有一定的關聯。在較低的pH值條件下（pH 4.0），超聲處理顯著降低了蛋白疏水性，提高了其表面巰基含量，促進了蛋白聚集，在此pH值條件下所形成的凝膠質地均勻細膩且持水性得到顯著提升，但成膠性較差。在較高的pH值條件下（pH 5.0和pH 6.0），超聲處理對蛋白復合物的溶解度、表面疏水性無顯著影響，但顯著提高了復合物的表面巰基含量和粒徑，所形成的凝膠質地粗糙，但pH 5.0時凝膠具有較好的質構特性和較高的持水性。GSPI/WPI復合物的物性（表面巰基含量和粒徑）和凝膠功能性隨著超聲強度的增加而顯著提升。綜上，將超聲處理與pH值調控結合可有效調控復合蛋白的凝膠特性，本研究可為其功能性的改造提供技術支持和理論依據。