干燥方式對三七葉主要活性成分、體外抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制活性、揮發性成分和代謝物的影響

李云嵌，何霞紅，吳光順，滿金花，張雪春，王振興,*

（1.西南林業大學 云南省林下資源保護與利用重點實驗室，西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224；2.西南林業大學生命科學學院，云南 昆明 650224）

三七（Panax notoginseng(Burk.) F. H. Chen）為五加科人參屬多年生草本植物，主產于云南省文山州，主要以其干燥根莖入藥，具有化瘀止血、活血鎮痛等功效，是我國傳統名貴中藥材[1]。三七葉（P. notoginsengleaves，PNL）是三七地上主要部分，也是三七生產的主要副產物，其富含皂苷、多酚、多糖、黃酮等活性成分，具有很高的食用和藥用價值[1]。云南當地一直有食用PNL的傳統，2016年云南省衛生計生委正式批復同意將其作為普通地方特色食品原料[2]。《本草綱目》記錄PNL具有“治折傷、跌撲出血，敷之即止，青腫經夜即散，余功同根”的功能，現代藥理學研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗衰老、止血等功效[1,3]。Liu Fang等[4]利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜從PNL甲醇提取物中檢測到人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3以及三七皂苷Fc、Fe、Fd。但目前大部分PNL未被利用，常被丟棄，造成PNL資源的極大浪費。三七的主要收獲季節集中在每年10月至次年1月，此間采收的大量新鮮PNL水分含量較高，采摘后容易發生萎蔫、腐爛，極大地限制了PNL的貯藏和加工利用。干燥是一種最常見的植物采摘后預處理和加工貯藏手段，對PNL進行及時的干燥處理可避免其品質劣變，有效延長其保藏時間，有利于其運輸和加工，對PNL的綜合利用有重要意義。目前已有學者利用干燥PNL開發了氣泡水飲料[5]、醋[6]、桃酥[7]等產品。

在干燥過程中，植物原料中的熱敏性成分在熱、光等作用下會發生不同程度的降解與轉化[8]。不同干燥方式的處理條件和干燥機理不一致，因此具有不同的干燥效果，使得原料的化學成分、生物活性及感官特征存在差異。此外，干燥方式也影響著原料的揮發性成分以及代謝物的種類和含量。林羨等[9]比較了熱風干燥（hot air drying，HAD）、真空微波干燥及真空冷凍干燥對辣木葉營養活性成分、抗氧化活性及色澤的影響，結果表明真空微波干燥更適合作為辣木葉的干燥方式。趙珊等[10]研究發現真空冷凍干燥和蒸干結合HAD的甘薯葉中總酚含量（total phenolic content，TPC）和總黃酮含量（total flavonoids content，TFC）較高，且具有較強的抗氧化能力。真空冷凍干燥、遠紅外干燥等新型干燥方式雖然可較好地保持樣品的品質和活性，但存在設備昂貴或加工成本高等缺點。傳統曬干處理的干燥效率較低，產品質量不佳，且受天氣影響較大。HAD、真空干燥（vacuum drying，VD）、熱泵干燥（heat pump drying，HPD）等基于熱加工的干燥處理方式憑借設備簡單、效率高、成本低等特點，仍是目前較常用的處理手段。安朝麗門等[11]研究了HAD、HPD和微波干燥對滑子蘑中滋味物質的影響；王兆凱等[12]綜述了預處理與干燥方式對枸杞干燥特性及品質的影響，結果表明HPD可同時控制干燥濕度和干燥環境氣體種類，可替代商業生產中的傳統太陽能干燥及HAD。但目前關于干燥方式尤其是熱處理對PNL的化學成分、功能活性、揮發性成分等方面的影響鮮有報道。

本研究以新鮮PNL為原料，分別采用HAD、HPD、VD對其進行干燥處理，測定不同干燥方式下PNL的主要化學成分含量、體外抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，采用高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）分析單體皂苷含量，并采用氣相色譜-離子遷移譜聯用（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）分析不同干燥方式對其揮發性成分的影響，從而篩選出PNL的最適干燥方式，然后使用基于超高效液相色譜-四極桿-軌道阱質譜聯用技術的非靶向代謝組學分析干燥前后PNL的代謝物變化情況，對差異代謝物進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，探討PNL在干燥過程中可能的代謝途徑，以期為PNL的干燥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮PNL于2021年11月采收于云南省昆明市尋甸縣羊街鎮豐樂林下三七種植基地，選擇長度范圍為5～9 cm、寬度范圍為3～4 cm的葉片用于實驗。

纖維素酶（50 U/mg） 山東西亞化學工業有限公司；沒食子酸 天津市大茂化學試劑廠；果膠酶（500 U/mg）、D(＋)-無水葡萄糖（純度≥98%）、2,2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、阿卡波糖、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenylα-D-glucopyranoside，PNPG）、VC、三七總皂苷（P. notoginsengleaves saponins，PNLS）（純度≥90%）、人參皂苷Rb1（純度≥98%）、人參皂苷Rb3（純度≥97%）、三七皂苷Fc（純度≥98%）、三七皂苷Fe（純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（700 000 U/mL） 北京索萊寶科技有限公司；蘆丁（純度≥95%）、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪（2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine，TPTZ） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；2,6-二叔丁基對甲酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT） 上海麥克林生化科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；FD-304真空冷凍干燥機 濟南駿德儀器有限公司；DNF-4K智能熱泵烘干設備 北京東南風科技有限公司；DZF-6090真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；SB-400DTY超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-D（III）循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；旋轉蒸發儀 艾卡（廣州）儀器設備有限公司；Infinite F50酶標儀 帝肯（上海）貿易有限公司；SC-80色差計 北京康光光學儀器有限公司；DZKW-4電熱恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司；1260 HPLC儀 安捷倫科技（中國）有限公司；Flavour Spec?風味分析儀 德國G.A.S.公司；Nexera X2 LC-30AD超高壓液相色譜儀 日本島津公司；Q Exactive Plus高分辨質譜儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Concentrator plus真空離心濃縮儀 艾本德中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PNL的不同干燥處理

分別稱取150 g左右的新鮮PNL，將其平鋪于不銹鋼托盤內進行不同干燥處理，厚度約為0.3 cm，干燥至水分質量分數10%以下，為保證干燥充分和統一干燥條件，所有干燥處理均在50 ℃下進行24 h，為排除各樣品組之間因水分質量分數不同造成的差異，后續所有計算均以樣品的干質量計。樣品分組如下：1）新鮮（fresh，F）組，新鮮未經處理的PNL；2）VD組，將PNL置于真空干燥箱中，溫度50 ℃，真空度65 Pa，干燥時間24 h，粉碎并過60 目篩后備用；3）HPD組，將PNL置于智能熱泵烘干設備中，溫度50 ℃，相對濕度0～5%，風速0.8 m/s，干燥時間24 h，粉碎并過60 目篩后備用；4）HAD組，將PNL置于電熱鼓風干燥箱中，溫度50 ℃，干燥時間24 h，風速0.8 m/s，粉碎并過60 目篩后備用。

1.3.2 水分質量分數的測定

采用GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》[13]中的直接干燥法測定水分質量分數。

1.3.3 色澤的測定

使用色差儀分別測定新鮮PNL和干燥PNL的色澤（L*值（亮度）、a*值（紅綠度）、b*值（黃藍度）），按式（1）計算色差ΔE。

式中：L*、a*、b*值分別為PNL干燥處理后的亮度、紅綠度、黃藍度；值分別為新鮮PNL的亮度、紅綠度、黃藍度。

1.3.4 PNL提取物的制備

采用超聲波輔助復合酶解法提取PNL中的活性成分[14]。將不同處理組的PNL粉末按料液比1∶8（m/V）加入蒸餾水，使用1 mol/L的鹽酸調節pH值至4.5后加入質量分數為0.03%的纖維素酶和質量分數為0.028%的果膠酶，50 ℃水浴超聲（160 W、40 kHz）酶解2 h，然后按料液比1∶32（m/V）加入無水乙醇，同樣條件下超聲提取1 h，抽濾后濾渣按料液比1∶40（m/V）加入體積分數80%的乙醇溶液，重復提取1 次。合并2 次濾液，于50 ℃下真空濃縮至浸膏，凍干，即得到PNL提取物，使用時用體積分數80%乙醇溶液配制成合適的質量濃度。

1.3.5 PNLS含量的測定

采用香草醛-高氯酸-冰乙酸法測定PNLS含量[15]。取40 μL樣品溶液置于80 ℃水浴鍋恒溫加熱，蒸干溶劑后加入20 μL 50 g/L香草醛-冰乙酸溶液和80 μL高氯酸，60 ℃水浴恒溫15 min，冰浴5 min后加入200 μL冰乙酸停止反應，在540 nm波長處測定吸光度。在同等條件下測定質量濃度分別為10、50、100、150、200、250、300 μg/mL PNLS溶液的吸光度，以PNLS質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線方程Y＝2.525 2X＋0.003 4（R2＝0.996 6），根據標準曲線方程計算PNLS含量。

1.3.6 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定PNL多糖（P. notoginsengleaves polysaccharide，PNLP）含量[16]。取50 μL樣品溶液，加入50 μL 50 g/L苯酚溶液，隨后緩慢加入250 μL濃硫酸，于40 ℃恒溫水浴10 min，冷卻后于490 nm波長處測定吸光度。在同等條件下測定質量濃度分別為20、40、60、80、100 μg/mLD(＋)-無水葡萄糖溶液的吸光度，以D(＋)-無水葡萄糖質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線方程Y＝3.981 3X＋0.029 8（R2＝0.995 9），根據標準曲線方程計算PNLP含量。

1.3.7 TPC的測定

采用福林-酚法測定TPC[17]。取50 μL樣品溶液，加入125 μL 0.1 mol/L福林-酚溶液，最后加入100 μL 75 g/L Na2CO3溶液，避光反應30 min后于765 nm波長處測定吸光度，以100 μL蒸餾水代替Na2CO3溶液作為樣品對照組。在同等條件下測定質量濃度分別為20、40、60、80、100 μg/mL沒食子酸溶液的吸光度，以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線方程Y＝0.010 7X＋0.003（R2＝0.997 5），根據標準曲線方程計算TPC。

1.3.8 TFC的測定

采用NaNO2-Al(NO3)3法測定TFC[18]。取40 μL樣品溶液，加入20 μL 50 g/L NaNO2溶液，室溫反應6 min，加入20 μL 100 g/L Al(NO3)3溶液，室溫反應6 min，加入140 μL 40 g/L NaOH溶液，室溫反應15 min，于510 nm波長處測定吸光度。以體積分數80%乙醇溶液代替同樣體積的NaNO2溶液、Al(NO3)3溶液和NaOH溶液作為樣品對照組。在同等條件下測定質量濃度分別為10、20、40、60、80、100 μg/mL蘆丁溶液的吸光度，以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線方程Y＝0.001 3X－0.005 4（R2＝0.99），根據標準曲線方程計算TFC。

1.3.9 HPLC分析

1.3.9.1 標準品及樣品溶液的制備

精準稱取人參皂苷Rb1、Rb3和三七皂苷Fc、Fe標準品各1 mg，使用色譜級甲醇配制成質量濃度為500 μg/mL的混合標準品母液，再稀釋成質量濃度分別為50、100、200、300、400 μg/mL的標準品溶液，備用。分別稱取不同方式干燥PNL提取物20 mg，使用色譜級甲醇配制質量濃度為20 mg/mL的樣品溶液，備用。

1.3.9.2 HPLC條件

按照1.3.9.1節方法配制標準品溶液和PNL提取物溶液，過0.22 μm有機系濾膜，采用HPLC法分析不同處理組PNL中皂苷的分布情況。色譜柱為Silgreen C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）和體積分數0.1%甲酸溶液（B）；檢測波長為203 nm；質量分數10%以下，為保證干燥充分和統一干燥條件，所有干燥處理均在50 ℃下進行24 h，為排除各樣品組之間因水分質量分數不同造成的差異，后續所有計算均以樣品的干質量計。樣品分組如下：1）新鮮（fresh，F）組，新鮮未經處理的PNL；2）VD組，將PNL置于真空干燥箱中，溫度50 ℃，真空度65 Pa，干燥時間24 h，粉碎并過60 目篩后備用；3）HPD組，將PNL置于智能熱泵烘干設備中，溫度50 ℃，相對濕度0～5%，風速0.8 m/s，干燥時間24 h，粉碎并過60 目篩后備用；4）HAD組，將PNL置于電熱鼓風干燥箱中，溫度50 ℃，干燥時間24 h，風速0.8 m/s，粉碎并過60 目篩后備用。

1.3.2 水分質量分數的測定

采用GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》[13]中的直接干燥法測定水分質量分數。

1.3.3 色澤的測定

使用色差儀分別測定新鮮PNL和干燥PNL的色澤（L*值（亮度）、a*值（紅綠度）、b*值（黃藍度）），按式（1）計算色差ΔE。

式中：L*、a*、b*值分別為PNL干燥處理后的亮度、紅綠度、黃藍度；值分別為新鮮PNL的亮度、紅綠度、黃藍度。

1.3.4 PNL提取物的制備

采用超聲波輔助復合酶解法提取PNL中的活性成分[14]。將不同處理組的PNL粉末按料液比1∶8（m/V）加入蒸餾水，使用1 mol/L的鹽酸調節pH值至4.5后加入質量分數為0.03%的纖維素酶和質量分數為0.028%的果膠酶，50 ℃水浴超聲（160 W、40 kHz）酶解2 h，然后按料液比1∶32（m/V）加入無水乙醇，同樣條件下超聲提取1 h，抽濾后濾渣按料液比1∶40（m/V）加入體積分數80%的乙醇溶液，重復提取1 次。合并2 次濾液，于50 ℃下真空濃縮至浸膏，凍干，即得到PNL提取物，使用時用體積分數80%乙醇溶液配制成合適的質量濃度。

1.3.5 PNLS含量的測定

采用香草醛-高氯酸-冰乙酸法測定PNLS含量[15]。取40 μL樣品溶液置于80 ℃水浴鍋恒溫加熱，蒸干溶劑后加入20 μL 50 g/L香草醛-冰乙酸溶液和80 μL高氯酸，60 ℃水浴恒溫15 min，冰浴5 min后加入200 μL冰乙酸停止反應，在540 nm波長處測定吸光度。在同等條件下測定質量濃度分別為10、50、100、150、200、250、300 μg/mL PNLS溶液的吸光度，以PNLS質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線方程Y＝2.525 2X＋0.003 4（R2＝0.996 6），根據標準曲線方程計算PNLS含量。

1.3.6 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定PNL多糖（P. notoginsengleaves polysaccharide，PNLP）含量[16]。取50 μL樣品溶液，加入50 μL 50 g/L苯酚溶液，隨后緩慢加入250 μL濃硫酸，于40 ℃恒溫水浴10 min，冷卻后于490 nm波長處測定吸光度。在同等條件下測定質量濃度分別為20、40、60、80、100 μg/mLD(＋)-無水葡萄糖溶液的吸光度，以D(＋)-無水葡萄糖質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線方程Y＝3.981 3X＋0.029 8（R2＝0.995 9），根據標準曲線方程計算PNLP含量。

1.3.7 TPC的測定

采用福林-酚法測定TPC[17]。取50 μL樣品溶液，加入125 μL 0.1 mol/L福林-酚溶液，最后加入100 μL 75 g/L Na2CO3溶液，避光反應30 min后于765 nm波長處測定吸光度，以100 μL蒸餾水代替Na2CO3溶液作為樣品對照組。在同等條件下測定質量濃度分別為20、40、60、80、100 μg/mL沒食子酸溶液的吸光度，以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線方程Y＝0.010 7X＋0.003（R2＝0.997 5），根據標準曲線方程計算TPC。

1.3.8 TFC的測定

采用NaNO2-Al(NO3)3法測定TFC[18]。取40 μL樣品溶液，加入20 μL 50 g/L NaNO2溶液，室溫反應6 min，加入20 μL 100 g/L Al(NO3)3溶液，室溫反應6 min，加入140 μL 40 g/L NaOH溶液，室溫反應15 min，于510 nm波長處測定吸光度。以體積分數80%乙醇溶液代替同樣體積的NaNO2溶液、Al(NO3)3溶液和NaOH溶液作為樣品對照組。在同等條件下測定質量濃度分別為10、20、40、60、80、100 μg/mL蘆丁溶液的吸光度，以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線方程Y＝0.001 3X－0.005 4（R2＝0.99），根據標準曲線方程計算TFC。

1.3.9 HPLC分析

1.3.9.1 標準品及樣品溶液的制備

精準稱取人參皂苷Rb1、Rb3和三七皂苷Fc、Fe標準品各1 mg，使用色譜級甲醇配制成質量濃度為500 μg/mL的混合標準品母液，再稀釋成質量濃度分別為50、100、200、300、400 μg/mL的標準品溶液，備用。分別稱取不同方式干燥PNL提取物20 mg，使用色譜級甲醇配制質量濃度為20 mg/mL的樣品溶液，備用。

1.3.9.2 HPLC條件

按照1.3.9.1節方法配制標準品溶液和PNL提取物溶液，過0.22 μm有機系濾膜，采用HPLC法分析不同處理組PNL中皂苷的分布情況。色譜柱為Silgreen C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）和體積分數0.1%甲酸溶液（B）；檢測波長為203 nm；體積分數80%甲醇溶液，冰浴超聲30 min后－20 ℃靜置2 h，然后在4 ℃環境下離心（16 000×g、20 min）取上清液。將上清液在高速真空濃縮離心機中揮發蒸干，加入100 μL體積分數50%甲醇溶液復溶，在4 ℃環境下離心（20 000×g、20 min）取上清液用于質譜分析，同時從每個樣品中取等體積樣品混勻制備質量控制（quality control，QC）樣品，以驗證系統的穩定性和可重復性。

超高效液相色譜條件：ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫程序如下：0～2 min，0 B；2～6 min，0～48% B；6～10 min，48%～100% B；10～12 min，100% B；12～12.1 min，100%～0 B；12.1～15 min，0 B；流速0.3 mL/min；進樣量6 μL。整個分析過程中樣品一直置于4 ℃自動進樣器中。

質譜條件：樣品采用電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）進行正離子和負離子模式檢測。正離子模式噴霧電壓為3 800 V，負離子模式為3 200 V；離子傳輸管溫度為320 ℃；母離子掃描范圍為m/z70～1 050 。

數據處理：原始數據采用MSDIAL軟件進行峰對齊、保留時間校正和峰面積提取。代謝物結構鑒定采用精確質量數匹配（質量偏差小于20×10－6Da）和二級譜圖匹配（質量偏差小于0.02 Da）的方式，檢索HMDB、MassBank等公共數據庫及自建數據庫。對提取得到的數據，刪除組內缺失值超過50%的離子峰；對正、負離子數據分別進行總峰面積歸一化，整合正、負離子峰并應用R軟件進行模式識別，數據經方差縮放（unit variance scaling）預處理后進行后續數據分析。

1.4 數據統計與分析

所有實驗重復3 次，結果表示為平均值±標準偏差。使用Origin 2018和GraphPad Prism 8軟件對數據進行計算和繪圖，使用SPSS 25.0軟件中的單因素方差進行差異顯著性分析，以P＜0.05表示樣品間差異顯著。使用OmicStudio云平臺（https://www.omicstudio.cn/tool）和歐易集團云平臺（https://cloud.oebiotech.cn/task/）進行熱圖、火山圖、相關性以及主坐標分析。

2 結果與分析

2.1 不同干燥方式對PNL色澤和水分質量分數的影響

L*值表示明亮度（0～100表示由黑色到白色），a*值表示紅綠度（正值表示紅色，負值表示綠色）、b*值表示黃藍度（正值表示黃色，負值表示藍色），ΔE表示色差值，其值越小，說明樣品的色澤與對照組的色澤越接近。由表1可知，干燥對PNL的色澤具有顯著影響（P＜0.05），相較于F組，3 種干燥方式均顯著降低了PNL的L*值，說明干燥后PNL亮度降低；VD組的a*值與F組接近，其余兩組顯著降低；3 種干燥方式下b*值均顯著升高。ΔE從大到小依次為HPD組＞HAD組＞VD組，說明相較于F組，HPD組和HAD組PNL色澤變化更為明顯，而VD組色澤變化相對較小。PNL色澤的變化與干燥過程中溫度、氧氣濃度等因素密切相關，3 種干燥方式均在50 ℃下進行，在此溫度下，樣品容易發生美拉德反應及焦糖化反應等，從而導致樣品色澤變得暗淡，L*值降低。此外，溫度、氧氣濃度等因素也會影響葉綠素的分解，從而改變樣品色澤[24]。干燥可降低葉片等原料的水分質量分數，從而降低其酶活力，抑制微生物繁殖，因此可在一定程度上緩解葉片的腐敗變質問題，延長其貯存期[25]。如表1所示，F組水分質量分數為84.15%，說明PNL水分質量分數較高，不利于貯藏。經干燥后，各組水分質量分數均降至10%以下，其中HAD組的水分質量分數最低。

表1 不同干燥方式對PNL色澤和水分質量分數的影響Table 1 Effects of different drying methods on the color and moisture content of PNL

2.2 不同干燥方式對PNL主要化學成分的影響

如表2所示，干燥方式對PNLS、PNLP含量及TPC、TFC均有較大影響。與F組相比，干燥組的PNLS含量更高，這是因為PNL中皂苷類成分復雜多樣，而溫度、酶活性等因素會促使皂苷發生脫羧、脫糖、脫水反應而發生轉化，最終導致PNLS含量發生變化。王紅等[26]采用超高效液相色譜-四極桿-軌道阱質譜技術研究發現人參在烘干或凍干后部分皂苷含量明顯上升，但也有部分皂苷含量降低。干燥后各組PNLP含量均升高，PNLP含量依次為HPD組＞HAD組＞VD組，這與干燥過程中濕度、氧氣濃度等因素發生變化，進而導致其溶出程度改變有關。陳璁等[27]研究發現HPD雙孢蘑菇粗多糖溶出量高于HAD。相比F組，VD組的TPC顯著降低（P＜0.05），而HAD組和HPD組無顯著變化；干燥后VD組、HAD組和HPD組的TFC均顯著降低（P＜0.05），其中VD組最低，可能是因為在干燥過程中，總酚、總黃酮等功能成分會受到溫度、氧分壓、水分活度等因素的影響，發生氧化、聚合或分解等反應[28-30]。

表2 不同干燥方式對PNL中主要化學成分的影響Table 2 Effects of different drying methods on major chemical components of PNL

2.3 不同干燥方式對PNL單體皂苷含量和功能活性的影響

皂苷是苷元為三萜或者螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，具有抗炎、抗氧化、抗衰老、止血等多種功效[31]。前人研究表明PNL中含有人參皂苷Rb1、Rb3和三七皂苷Fc、Fe等多種皂苷[4]。混合標準品和不同處理組樣品的HPLC圖譜見附圖1，通過比對峰形和保留時間，共鑒定出4 種皂苷類化合物，分別為人參皂苷Rb1、Rb3和三七皂苷Fc、Fe。如圖1A、B所示，相比于F組，三七皂苷Fc、Fe含量在VD組中分別顯著增加至46.40 mg/g和32.44 mg/g，在HAD組中無顯著變化，但在HPD組中分別顯著降低至32.41 mg/g和22.04 mg/g；此外，由圖1C、D可知，3 種干燥方式對人參皂苷Rb1、Rb3的含量無顯著影響。

圖1 不同干燥方式對PNL中皂苷含量及功能活性的影響Fig. 1 Effects of different drying methods on saponin contents and functional activities of PNL

由于抗氧化作用機理復雜，因此可選擇多種不同作用原理的抗氧化方法對PNL的抗氧化能力進行綜合評價[32]。由圖1E、F、G可知，經干燥處理后，PNL的抗氧化能力均有不同程度的下降，其中，HPD組和VD組的DPPH自由基清除能力與F組無顯著差異，HAD組顯著下降，HPD組表現出最強的DPPH自由基清除能力（IC50為1 098.96 μg/mL）。此外，VD組表現出最強的ABTS陽離子自由基清除能力（IC50為1 071.65 μg/mL），與F組相當（P＞0.05）；HPD組ABTS陽離子自由基清除能力僅次于VD組，兩者之間無顯著差異，但均弱于F組；而HAD組的ABTS陽離子自由基清除能力最弱。3 個干燥組的FRAP均顯著弱于F組，其中HPD組FRAP最高（29.39 mg/g）。陳璁等[27]研究表明，HPD處理的雙孢蘑菇提取液的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力以及FRAP均顯著高于HAD組，本研究結果與之類似。α-葡萄糖苷酶是2型糖尿病的重要靶標[33]，尋找天然高效、無毒副作用的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有重要意義。由圖1H可知，HAD和VD處理均使PNL的α-葡萄糖苷酶抑制能力顯著下降，而HPD組的α-葡萄糖苷酶抑制能力（IC50為6 542.38 μg/mL）與F組無顯著差異。綜合以上結果，HPD對PNL功能活性的保持效果最好。

為進一步闡明PNL中化學成分含量與功能活性之間的關系，本研究對各指標進行了相關性分析。如圖2A所示，抗氧化指標與TFC之間相關性較高，說明黃酮類化合物是PNL抗氧化活性的主要貢獻者；而α-葡萄糖苷酶抑制能力受到TFC、PNLP含量的影響，但不完全由它們決定。綜合來看，PNL的功能活性是其各種成分綜合作用的結果，并非主要由單一類型成分決定，這也體現了PNL多成分、多作用靶點的特點。此外，為探討干燥方式與PNL中化學成分含量和功能活性的聯系，本研究進行了主坐標分析，如圖2B所示，HPD組、VD組與F組在PC1上距離較相近，其中HPD組與F組最為接近，而HAD組距離F組最遠，這也進一步說明HPD和VD處理對PNL的化學成分及其功能活性可以起到較好的保護作用。

圖2 各測定指標間的相關性熱圖和各樣品組間的主坐標分析Fig. 2 Heatmap showing correlation between measured indexes and principal coordinate analysis plot of fresh and dried samples

2.4 不同干燥方式對PNL揮發性成分的影響

采用GC-IMS從PNL中一共檢測出85 種揮發性化合物，包括19 種醛類、22 種醇類、17 種酮類、5 種酯類、3 種呋喃類、2 種酸類以及17 種數據庫中未匹配到的物質，其中在F、HAD、HPD、VD組中分別檢測到80、79、80、78 種揮發性成分，各組樣品的揮發性成分基本一致（附表1）。

整體來看，新鮮的PNL中揮發性成分主要以醛、醇和酮類化合物為主，其分別約占總揮發性化合物的18%、33%和30%。其中醛類化合物主要來源于氨基酸及脂肪酸的代謝[34-35]，包括青葉醛、己醛、反式-2-戊烯醛等，其中青葉醛呈現強烈的青草氣味，己醛則呈現葉香、水果香、木香[36]。醇類化合物主要來源于萜類化合物、苯丙氨酸和脂肪酸的代謝[34]，包括正己醇、正戊醇等，其中正己醇具有嫩枝葉氣味，而正戊醇則呈現出雜醇油的氣味，對風味有不利影響[37]。酮類化合物中的短鏈酮類具有脂香和焦香香氣，長鏈酮類則呈現出花香氣息[38]。PNL中的酮類化合物主要為乙偶姻、丙酮等，其中乙偶姻具有甜味及奶油香味。經過干燥處理后，PNL中醛類化合物的相對含量明顯增加，而醇類和酮類化合物的相對含量明顯下降。同時，酯類化合物相對含量明顯下降，而酸類化合物相對含量明顯提高。不同處理組之間的差異圖譜（圖3A）和指紋圖譜（圖3C）清楚地展示了這些變化，圖3A中，相比于未經處理的F組，3 個處理組部分揮發性成分相對含量升高，部分揮發性成分相對含量降低，且變化趨勢類似。對所測得的揮發性成分進行定性分析（圖3B）。將每組中所有揮發性成分的含量變化進行可視化分析（圖3C），區域a中的物質干燥后相對含量大幅降低；區域b中大部分揮發性成分相對含量降低，其中異戊醇、正丙醇、正戊醇等在干燥后相對含量明顯降低；區域c中揮發性成分在干燥后相對含量明顯升高，包括異丁酸、正庚醛、正戊醛、醋酸等。造成這些變化的主要原因是干燥過程中溫度、氧氣濃度、光照等因素導致PNL發生美拉德反應、脂質氧化反應以及前體物質的降解和轉化，使原料中的揮發性成分種類和含量發生變化[39]。馬琦等[40]發現杏鮑菇經不同干燥處理后醛類化合物含量有所升高。此外，干燥過程中酶失活以及香氣前體物質的損失也會導致醇類化合物含量的降低[41]。

圖3 不同干燥方式下PNL揮發性成分的定性分析及差異分析Fig. 3 Qualitative analysis and difference analysis of volatile components in PNL dried by different methods

對各組樣品揮發性成分的相對含量分布、差異物質進行分析，如圖4所示，不同干燥方式下PNL揮發性成分的相對含量不同。對3 種主要揮發性成分（醇類、醛類和酮類）進行比較分析，發現HPD組的醇類和醛類化合物相對含量最高，而酮類化合物最低，說明經HPD處理的PNL草木香味最濃、焦香味最淡，有利于加工成PNL食品。主坐標分析顯示F組在PC1上與各干燥樣品組距離較遠，說明干燥使PNL中揮發性成分的相對含量發生明顯改變，其中HPD組與F組揮發性成分的相對含量較為接近。選擇PNL揮發性成分中相對含量具有顯著變化的物質進行熱圖分析，發現干燥后PNL中大部分揮發性成分相對含量顯著降低，主要包括醇類、酮類、酯類，而部分醛類、酸類、呋喃類成分相對含量顯著增加。

圖4 不同干燥方式下PNL揮發性成分組成及差異物質分析Fig. 4 Analysis of volatile components and differential substances of PNL dried by different methods

2.5 代謝組學分析

基于2.2、2.3、2.4節的實驗結果進行綜合分析，發現HPD組對PNL的化學成分和功能活性保持最好，因此選擇HPD作為本研究中PNL的最佳干燥方式。為進一步闡明PNL在干燥過程中的代謝物變化和代謝機制，采用基于超高效液相色譜-四極桿-軌道阱質譜的非靶向代謝組學對干燥前后的PNL（F組和HPD組）進行分析。一共從PNL中鑒定出659 種代謝物，其中正離子模式下檢測到409 種，負離子模式下250 種。這可能是因為在質譜檢測中，堿性化合物對正離子模式更敏感，而負離子模式更適合檢測酸性化合物[42]。為了更直觀地展示這些代謝物的組成和分類，繪制了相應的餅狀圖。如圖5所示，餅狀圖中不同顏色代表不同分類，面積代表分類中代謝物所占比例。PNL中的代謝物在超類水平上主要包括脂質和類脂分子、有機酸及其衍生物、有機雜環化合物；在類水平上主要包括羧酸及其衍生物、異戊烯醇脂；在亞類水平上以氨基酸、肽和肽類似物為主。

圖5 PNL代謝物分類Fig. 5 Metabolite classification of PNL

對這些代謝物進行主坐標分析（圖6A、B），F組和HPD組在正、負離子模式下均可明顯區分，說明干燥后PNL的代謝物表達量發生了明顯變化。對PNL干燥前后的差異代謝物進行進一步分析，并根據P＜0.05和│log2差異倍數（fold change，FC）│≥2構建火山圖（圖6C、D）。結果表明，正離子模式下有113 種代謝物表達顯著上調，98 種表達顯著下調；負離子模式下有68 種代謝物表達顯著上調，31 種表達顯著下調，這些差異代謝物主要為脂質和類脂分子、有機雜環化合物、有機酸及其衍生物等，正、負離子模式下干燥后表達上調的代謝物均明顯多于表達下調的代謝物，說明HPD處理能夠轉化PNL中的非揮發性代謝物，這可能是因為在干燥過程中適度的熱處理會促進PNL中這些非揮發性代謝物的水解、取代、異構化、氧化還原以及其他熱物理和化學反應[43]。根據正交偏最小二乘法判別分析獲得的投影中變量重要性（variable important in projection，VIP）值，選擇VIP值排在前50 位的代謝物繪制聚類熱圖（圖6E、F），發現干燥前后發生變化的代謝物主要集中在一些氨基酸、生物堿、碳水化合物、酶、脂類、黃酮類化合物以及萜類化合物等。在干燥過程中，PNL中的蛋白質發生部分水解，促進氨基酸形成。而氨基酸又與可溶性糖等產生反應，進而產生美拉德反應產物；同時，PNL中的黃酮苷也可以被降解成黃酮苷元和葡萄糖配基，從而降低其苦澀味。這也進一步解釋了干燥后PNL化學成分和風味變化的原因。

圖6 PNL干燥前后代謝物的變化Fig. 6 Changes in metabolite composition of PNL before and after drying

此外，在主要差異代謝物中發現了人參皂苷CK、人參皂苷Re等皂苷類化合物。由于皂苷被認為是三七中最主要的活性成分，因此針對代謝物中的所有皂苷類化合物進行檢索。一共鑒定到24 種皂苷類化合物（附表2），其中正離子模式下鑒定到13 種，負離子模式下鑒定到11 種，并發現其中8 種皂苷類化合物經干燥后相對含量發生了顯著變化（圖7）。由圖7可知，只有人參皂苷CK相對含量顯著降低，而人參皂苷Re、人參皂苷F1、5,6-脫氫人參皂苷Rd等7 種皂苷相對含量均顯著降低，這與HPLC的分析結果相印證。人參皂苷CK屬二醇型皂苷，雖然在天然人參、三七等藥材中的含量極低，但其具有良好的水溶性，是其他含量較高的人參皂苷（如Rb1和Rb2等）在人體腸道內的主要降解產物和最終吸收形式，具有很高的抗腫瘤、降血糖、增強免疫等生物活性[44]。已有研究報道熱處理可以將普通皂苷轉化為稀有皂苷，從而使其具有更好的藥理活性[45-46]。余瀟苓等[47]報道人參皂苷在受熱后會發生不同程度的降解，其中三醇類皂苷較二醇類皂苷對熱更為敏感。由表2可知，經干燥后PNL中PNLS含量總體顯著提高，因此，在PNL的HPD過程中同樣存在著皂苷類物質的轉化。

圖7 PNL干燥前后的差異性皂苷類化合物Fig. 7 Differential saponin compounds in PNL before and after drying

進一步對PNL的功能活性與代謝物進行Spearman相關性分析（圖8），由圖8C、D可知，沒有代謝物與DPPH自由基清除能力顯著相關，只有少量代謝物與ABTS陽離子自由基清除能力、FRAP和α-葡萄糖苷酶抑制能力顯著相關，且這些相關代謝物的種類多樣，這說明PNL的功能活性是由不同化合物綜合決定的。

圖8 PNL功能活性與代謝物之間的相關性分析以及PNL中差異代謝物的富集途徑分析Fig. 8 Correlation analysis between functional activities and metabolites of PNL and pathway enrichment of differential metabolites in PNL

對差異代謝物參與的通路進行KEGG富集分析，結果如圖8E所示。由于本研究主要關注的是PNL在干燥過程中代謝物的變化，因此，針對代謝（M）類型進行分析。由圖8E可知，氨基酸的生物合成、2-氧羧酸代謝、輔助因子的生物合成等是PNL在HPD過程中最可能的代謝通路，其富集到的代謝物數目分別為11、10、12 個。其中，氨基酸的生物合成涉及到氨基酸的合成；2-氧羧酸代謝通過氨基酸和糖類的代謝來完成；輔助因子是一類對細胞代謝和生理功能有重要影響的生物分子，對氨基酸代謝、脂類代謝、植物次生代謝等有重要作用。KEGG富集結果充分解釋了PNL在干燥后的代謝物變化情況，并揭示了其代謝途徑。

3 結 論

本研究以PNL為原料，分別采用HAD、HPD、VD對其進行干燥處理，研究不同干燥方式對PNL化學成分、功能活性和揮發性成分的影響，確定適宜的PNL干燥方法，并采用非靶向代謝組學技術揭示干燥前后的代謝物變化情況，闡明代謝機制。結果表明：3 種干燥方式均可明顯提高PNLS和PNLP含量，降低TPC和TFC，其中HPD組的PNLS和PNLP含量最高，而HAD組的TPC和TFC較高；采用HPLC法從PNL中共檢測出4 種皂苷，分別為三七皂苷Fc和Fe以及人參皂苷Rb1和Rb3，其中HPD顯著降低了三七皂苷Fc、Fe的含量，而VD與之相反；3 種干燥方式對人參皂苷Rb1和Rb3含量均無顯著影響。抗氧化活性測定結果表明，經干燥后，PNL的功能活性均發生了不同程度的下降。其中，HPD組清除DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的IC50分別為1 098.96 μg/mL和1 091.49 μg/mL，優于HAD組，與VD組無顯著差異。HPD組的FRAP最強，為29.39 mg/g。HPD組還具有最強的α-葡萄糖苷酶抑制能力，其IC50為6 542.38 μg/mL，與新鮮PNL無顯著差異。因此，本研究中，HPD處理對于PNL的主要化學成分含量和功能活性具有最好的保持效果。采用GC-IMS在PNL中共檢測出85 種揮發性成分，3 種干燥方式均對PNL中揮發性成分的相對含量有明顯影響，且不同處理組之間有明顯區別。其中，HPD組的醇類和醛類化合物相對含量最高，而酮類化合物最低，說明其能較好地保留PNL的草木味，產生的焦香味最淡，有利于PNL的進一步加工利用。非靶向代謝組學分析揭示了PNL在干燥過程中的代謝物變化，干燥后表達上調的代謝物數量明顯多于表達下調的代謝物，主要集中于氨基酸、生物堿、碳水化合物、酶、脂類、黃酮類化合物以及萜類化合物等，說明HPD過程中PNL中產生了大量上述非揮發性代謝物，導致其化學成分和揮發性風味成分發生變化。針對PNL中皂苷類化合物的相對含量進行進一步分析，結果也證明了人參皂苷Re、人參皂苷F1、5,6-脫氫人參皂苷Rd等皂苷類化合物發生了轉化。KEGG富集分析表明，氨基酸的生物合成、2-氧羧酸代謝、輔助因子的生物合成是PNL在HPD過程中主要的代謝途徑。

綜上，HPD在本研究所選3 種干燥方式中對PNL的化學成分和功能活性具有最好的保持效果，可以作為PNL在加工應用中的優選干燥方式。在干燥過程中，其可通過多個作用途徑改變PNL的代謝物組成，并影響其揮發性成分含量。在今后的工作中，可以針對干燥過程中代謝物的變化，尤其是常見皂苷轉化為稀有皂苷進行深入研究，并運用細胞、動物模型對其生理活性進行更多地探討。本研究結果可為PNL的采后干燥加工提供科學依據，對于PNL的開發利用、促進三七產業發展具有一定意義。