富含羥基酪醇橄欖油對高血脂小鼠的影響

葉文斌，陳文東，王 昱，張 凱，黃新異，邸多隆

（1.隴南師范高等專科學校農林技術學院，甘肅 成縣 742500；2.中國科學院蘭州化學物理研究所，甘肅 蘭州 730000）

橄欖油是木犀科木犀欖屬的一種常綠經濟喬木油橄欖（Olea europaeaL.）鮮果經過冷榨離心工藝得到的產物，由于保存了天然營養成分，被譽為“液體黃金”，因其富含可降低膽固醇和血脂的油酸及人體必需的維生素和微量元素[1-4]，是世界公認營養價值最高的植物油。而且它還是一種不干性食用油，人體消化吸收率高達90%以上，是食用油脂中最有益于人體健康的植物油之一，同時橄欖油中還富含三萜類、甾醇類、多酚類、酚類化合物和類胡蘿卜素和其他色素成分[3-8]，長期食用橄欖油能增強消化系統功能、預防心腦血管疾病和神經退行性疾病、降低癌癥發生率、促進骨骼發育[9-13]，尤其在改善一些心血管風險因子如血脂、血糖代謝、內皮功能和炎癥反應方面具很好的效果[7-8,14-16]，對人體健康具有重要作用。羥基酪醇是一種存在于油橄欖葉和樹皮中的多酚類化合物，具有很強的抗氧化活性和藥學效果[17]，羥基酪醇的自由基清除能力強，表現出獨特的生物活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、改善心臟的冠脈血流[17]等，還可以通過阻滯腫瘤細胞的增殖及誘發其凋亡，起到很好的抗癌活性，同時能有效防治小鼠生殖系統的損傷[18-20]，而且無明顯毒性反應，其在醫藥與食品行業的應用前景近年來受到廣泛關注[21-22]。目前，國內外對橄欖油保健功效的研究比較深入，而對橄欖油保健食品的研究較少[14]，在國內存在一些以膠囊、片劑、粉劑為主的橄欖油保健產品，但其在保健品的市場影響都比較小。隨著我國居民對健康的重視水平不斷提高以及國內橄欖油消費量的快速攀升，國內對橄欖油保健食品功效的研究將會更加重視。

本實驗采用脂肪乳劑和體積分數為75%的蛋黃乳誘導高血脂小鼠模型，研究富含羥基酪醇橄欖油（olive oil rich in hydroxyl tyrosol，OHT）對高血脂小鼠的影響，以期為開發無毒無副作用的降脂降糖橄欖油保健食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

PFKM小鼠購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所，雌雄各半，體質量（22.00±0.45）g，生產許可證號：SCXK（甘）2020-0002。

普通橄欖油由甘肅時光油橄欖科技有限公司提供，羥基酪醇含量為0.25 mg/100 g；富含羥基酪醇橄欖油由中國科學院西北特色植物資源化學重點實驗室自制，羥基酪醇含量為20 mg/100 g。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；糖化血紅蛋白、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司；動物專用全自動生化分析儀專用綜合24 項生理指標檢查盤片 天津微納芯科技有限公司；菲勒貝特江蘇恩華藥業股份有限公司；膽固醇、膽酸鈉 美國Sigma公司；丙基硫氧嘧啶片、聚山梨酯-80、1,2-丙二醇南京天一生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-6數顯恒溫水浴鍋 上海千載科技有限公司；TGL-16G高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；UV759紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；Pointcare V3動物專用全自動生化分析儀 天津微納芯科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 富含羥基酪醇橄欖油制備

取新鮮的油橄欖果，清洗、粉碎至80 目，加入6 倍鮮果質量的45 ℃純凈水，攪拌。用高速剪切機以轉速16 000 r/min對果肉中細胞組織進一步破碎提取，提取時間為10 min，每提取2 min間隔0.5 min，再用攪拌器在45 ℃下加熱保溫攪拌形成果漿。在常溫下對果漿以20 000 r/min離心5 min后，果漿固液分離，分離果渣后，對油-水混合液進一步用400 目的濾膜過濾，在過濾后的油-水混合液中加入其質量為10%的硫酸鈉，攪拌使得硫酸鈉完全溶解。靜置25 min后油-水分離，得到富含羥基酪醇橄欖毛油和果水。富含羥基酪醇橄欖毛油靜置24 h，得富含羥基酪醇特級初榨橄欖油，即本實驗所用的實驗材料——OHT。用高效液相色譜法測定OHT中羥基酪醇的含量為20 mg/100 g。檢測條件：色譜柱：SinoChrom ODS-BP（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：0.10%甲酸溶液（溶劑為V（水）∶V（乙腈）＝86∶14），流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣體積：20 μL；二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）；檢測波長：280 nm。

1.3.2 脂肪乳劑和體積分數75%蛋黃乳配制

參考郗艷麗等[23]的方法制備脂肪乳劑，取80 g豬油置于500 mL燒杯中加熱融化后，加入40 g膽固醇繼續溶解，再加入8 g膽酸鈉和4 g丙基硫氧嘧啶片，充分攪勻，然后加入適量的蒸餾水及聚山梨酯-80、1,2-丙二醇各80 mL，不斷攪勻加熱，再加雙蒸水至400 mL并充分混勻，即配制成含100 g/L膽固醇、200 g/L豬油、20 g/L膽酸鈉和10 g/L丙基硫氧嘧啶的脂肪乳劑，將脂肪乳劑放入4 ℃冰箱保存備用，使用時加熱融化。

取新鮮雞蛋黃用蒸餾水配制成體積分數為75%的蛋黃乳，即用即配。

1.3.3 高血脂小鼠動物模型建立

參考葉文斌等[24]的方法，將正常PFKM小鼠適應性喂養7 d，隨機取10 只小鼠作為正常對照組，將其余60 只小鼠（模型組）按10 mL/kgmb的劑量，早上灌胃脂肪乳劑，下午灌胃75%的蛋黃乳，每天1 次，連續灌服6 周，在末次灌胃后禁食12 h，不禁水后眼眶取血，模型組的總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）含量比正常對照組高3～4 倍即造模成功。

1.3.4 富含羥基酪醇橄欖油對高血脂小鼠的影響實驗

取建模成功的高血脂KM小鼠60 只，隨機分為6 組：模型組，菲勒貝特藥物對照組（philbert，PL），橄欖油（olive oil，OL）組，OHT高、中、低劑量（HOHT、MOHT和LOHT）組。PL組、OL組均按200 mg/kgmb劑量每天分別灌胃菲勒貝特藥物、橄欖油1 次；HOHT、MOHT和LOHT組，按照200、100、50 mg/kgmb的劑量每天灌胃1 次OHT。連續灌胃28 d。小鼠自由飲食和飲水，取10 只正常小鼠，以灌胃相同體積的生理鹽水為CK(0)組。灌胃期間，每7 d稱量體質量，末次給藥后12 h眼眶靜脈叢采血，用肝素抗凝管收集，4 ℃、3 000 r/min離心5 min后，收集血清，用動物專用全自動生化分析儀測定小鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、TC、TG、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、γ-氨?；D移酶（gammaammonia acyltransferase，GGT）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平；依照試劑盒方法測定糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c）相對含量及HDL和LDL濃度；解剖小鼠取心臟、腦、肝、脾、腎，稱取質量并按下式計算臟器指數。

1.3.5 小鼠毒理學分析

1.3.5.1 急性毒理實驗

選取40 只PFKM小鼠，隨機分成4 組，其中1 組小鼠喂生理鹽水（CK(0)組），剩余3 組小鼠進行OHT口服（灌胃）急性毒理實驗，分為OHT高、中、低劑量組（HOHT、MOHT、LOHT組），灌服劑量分別為30 000、25 000 mg/kgmb和20 000 mg/kgmb，給藥后每天早、中、晚各觀察1 次，連續觀察7 d，觀察小鼠皮毛是否光亮，眼角膜是否有血絲、紅腫現象，小鼠活動是否有異常行為[24]，并對小鼠稱質量。末次給藥后12 h眼眶靜脈叢采血，用肝素抗凝管收集，4 ℃、3 000 r/min離心5 min，收集血清，依照試劑盒方法測定SOD、CAT、GSH-Px活力和MAD濃度，對小鼠進行頸椎脫臼處死并解剖，對重要臟器進行病理檢查。

1.3.5.2 慢性毒理實驗

選取20 只PFKM小鼠，隨機分成2 組，其中1 組小鼠進行OHT口服（灌胃）慢性毒理實驗，具體實驗過程參考《保健食品及其原料安全性毒理學檢驗與評價技術指導原則（2020年版）》，灌服劑量為200 mg/kgmb，另外1 組小鼠灌胃等體積的生理鹽水，計為CK(0)組，每天灌胃1 次，連續灌胃90 d。每30 d對小鼠稱質量，實驗結束時進行頸椎脫臼處死，進行重要臟器病理檢查，按1.3.5.1節方法取血清，測定SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA濃度。

1.4 數據處理與統計

實驗結果均以平均值±標準誤表示，數據分析采用SPSS 27.0軟件進行，組間數據的差異顯著性分析采用單因素方差分析（One-way ANOVA）中的Tukey’s多重比較進行，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 OHT對高血脂小鼠血糖、血脂的影響

由表1可知，給藥28 d后，模型組小鼠血清中TC、TG、FBG濃度和HbA1c相對含量極顯著高于其他6 組（P＜0.01）。HOHT對小鼠血清中TC、TG、FBG和HbA1c濃度的降低作用明顯強于OL，但與PL相比降糖降脂能力較溫和，HOHT組與PL組相比除TG濃度無顯著性差異外，TC、FBG濃度和HbA1c含量均呈極顯著或顯著差異（P＜0.01，P＜0.05）。隨OHT劑量增加，TC、TG、FBG濃度及HbA1c相對含量降低，說明OHT對高血脂小鼠降血糖、血脂的作用呈現劑量效應關系，富含高劑量的羥基酪醇橄欖油對高血脂小鼠降血糖、血脂的作用較強。綜上，OHT可以有效調節高血脂小鼠血糖血脂水平。

表1 OHT對高血脂小鼠血糖與血脂的影響Table 1 Effect of OHT on blood glucose and lipids in hyperlipemic mice

2.2 OHT對高血脂小鼠脂蛋白、膽紅素和膽汁酸的影響

如表2所示，給藥28 d后，與CK(0)組相比，高血脂模型組小鼠血清中HDL、TBIL和TBA的濃度極顯著升高（P＜0.01），LDL濃度極顯著降低（P＜0.01）；與高血脂模型組小鼠相比，PL、OL、HOHT組小鼠血清中HDL、TBIL和TBA的濃度顯著或極顯著降低（P＜0.05、P＜0.01），LDL濃度顯著或極顯著升高（P＜0.05、P＜0.01）；與HOLT組相比，PL組小鼠血清以上指標更接近CK(0)組，說明HOLT處理與PL處理相比恢復血脂能力稍弱。隨OHT劑量的增加，各OHT處理組恢復小鼠血清中HDL、LDL、TBIL和TBA濃度的能力逐漸增加，說明OHT恢復小鼠血脂指標的能力具有劑量效應關系。

表2 OHT對高血脂小鼠HDL、LDL、TBIL和TBA濃度的影響Table 2 Effect of OHT on HDL, LDL, TBIL and TBA concentrations in hyperlipemic mice

2.3 OHT對高血脂小鼠血清中4 種關鍵酶的影響

由表3可知，給藥28 d后，高血脂模型小鼠血清中ALT、AST、GGT和ALP活力極顯著高于其他6 組（P＜0.01）；HOHT組小鼠血清中ALT、AST、GGT和ALP活力極顯著低于OL組（P＜0.01），與PL組相比對高血脂小鼠4 種關鍵酶的活力降低能力較弱。與模型組相比，HOHT組在灌胃給藥28 d后小鼠血清中4 種關鍵酶的活力雖然極顯著降低（P＜0.01），但仍然極顯著高于CK(0)組（P＜0.01）。隨OHT劑量的增加，其降低高血脂小鼠血清中4 種關鍵酶活力的能力逐漸增強，說明OHT降低高血脂小鼠血清4 種關鍵酶活力具有劑量效應關系。以上結果說明OHT對高血脂小鼠的4 種關鍵酶具有很好的抑制作用，但作用效果比較溫和。

表3 OHT對高血脂小鼠4 種關鍵酶活力的影響Table 3 Effect of OHT on four key enzyme activities in hyperlipemic mice

2.4 OHT對高血脂小鼠體質量與臟器指數的影響

如表4所示，在脂肪乳劑和75%的蛋黃乳誘導高血脂小鼠模型成功后，模型組小鼠與CK(0)小鼠相比飲水和進食明顯增加，活動量減少，體質量極顯著增加（P＜0.01）。在給藥過程中，HOHT、MOHT、LOHT組小鼠體質量整體上逐漸增加，但與模型組相比增加緩慢，小鼠活動與精神狀況逐漸好轉，HOHT組與PL組相比小鼠體質量無顯著差異（P＞0.05），且低于OL組。隨著OHT劑量的增加，其降低高血脂小鼠體質量的作用也逐漸增強，說明OHT降低高血脂小鼠體質量的作用具有劑量效應關系。結果表明OHT可有效控制高血脂小鼠的體質量。如表5所示，高血脂模型小鼠心臟、腦、肝、腎、脾等重要臟器指數與其他各組相比均無顯著差異（P＞0.05），這說明用脂肪乳劑和75%的蛋黃乳誘導構建高血脂小鼠模型的方法穩定可靠。

表4 OHT對高血脂小鼠體質量的影響Table 4 Effect of OHT on body mass of hyperlipemic mice g

表5 OHT對高血脂小鼠重要臟器指數的影響Table 5 Effect of OHT on major organ coefficients of hyperlipemic mice

2.5 小鼠OHT急性毒理實驗結果

小鼠口服（灌胃）急性毒性實驗中，一次性灌服OHT劑量分別為20 000、25 000 mg/kgmb和30 000 mg/kgmb，給藥后依據葉文斌等[24]的方法籠邊觀察7 d，發現給藥后各組小鼠外觀毛色光亮，無竄動跳躍、豎毛扭體等異常反應現象，小鼠活動自如，攝食、進水、大小便正常，未出現死亡，半數致死量（median lethal dose，LD50）未檢出，根據毒理學評價標準，LD50＞10 000 mg/kgmb屬于無毒性物質[24-25]，本研究中一次性灌服OHT的最大劑量為30 000 mg/kgmb，結果說明OHT對小鼠無急性毒性。如圖1所示，各組小鼠體質量無顯著差異（P＞0.05）。對小鼠進行頸椎脫臼處死，進行重要臟器病理檢查，均未觀察到明顯病理變化。對于SOD、CAT、GSH-Px活力及MDA濃度，HOHT組與CK(0)組有顯著性差異（P＜0.05、P＜0.01），MOHT組、LOHT組與CK(0)組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 OHT對小鼠急性毒理生理指標的影響Fig. 1 Effect of OHT on acute toxicological physiological indexes in mice

2.6 小鼠OHT慢性毒理實驗結果

OHT對小鼠口服（灌胃）慢性毒理實驗中，連續灌胃90 d后小鼠外觀毛色正常，無異常反應，攝食、進水、大小便等均無明顯異常，小鼠活動自如。在灌胃過程中，小鼠重要臟器均無明顯病理變化。由圖2可知，2 組小鼠體質量均隨時間的延長而增長，但CK(0)組小鼠體質量均顯著或極顯著高于OHT組（P＜0.05、P＜0.01），說明OHT具有降低體質量的功效。隨時間延長，2 組小鼠血清中SOD、CAT和GSH-Px的活力均升高，且CK(0)組小鼠血清中以上指標均高于OHT組，其中在60 d時兩組差異顯著（P＜0.05），90 d時差異極顯著（P＜0.01），說明OHT具有提高小鼠血清中SOD、CAT和GSH-Px活力的功能，能夠提高小鼠的抗氧化能力。隨著時間的延長，2 組小鼠血清中的MDA濃度均升高，CK(0)組小鼠體內血清中的MDA濃度高于OHT組，30 d時兩組MDA濃度無顯著性差異（P＞0.05），60、90 d時差異極顯著（P＜0.01），說明OHT具有降低小鼠體內血清中MDA濃度的作用。綜上，OHT屬于慢性無毒性物質，而且具有一定的降低體質量、提高抗氧化能力的功效。

圖2 OHT對小鼠慢性毒理生理指標的影響Fig. 2 Effect of OHT on chronic toxicological physiological indexes in mice

3 討 論

高血脂主要是由脂代謝紊亂引起，會引發高血糖和高血壓，還可導致脂肪肝、心血管疾病、冠心病、胰腺炎及動脈粥樣硬化等疾病，是對人體生命健康產生威脅的主要原因之一[26]，降脂藥物主要包括他汀和貝特類，長期口服具有肝損害等不良反應[23]。而橄欖油具有很好的預防心腦血管疾病作用，尤其在改善心血管風險因子如血脂、血糖代謝、內皮功能和炎癥反應方面具有很好的效果[7-15]，有關羥基酪醇的生物功能研究很多[17-22]，但是有關OHT對高血脂小鼠的血糖血脂代謝影響的報道較少。高血脂是以TC、TG、LDL濃度升高，HDL濃度降低為主要臨床特征的一類疾病[27]，本研究發現，OHT能降低高血脂小鼠的TC、TG、LDL水平，提高HDL水平，對高血脂小鼠的代謝紊亂有較好的調節與治療作用，其中HOHT作用顯著。

BIL和TBA濃度的升高是臨床上判斷肝膽功能異常和肝細胞病變的重要現象，TBIL是亞鐵血紅素的分解終產物，絕大多數來源于紅細胞血紅蛋白的分解[28]，其異常會引發膽紅素代謝障礙性肝病，影響肝細胞對膽紅素的攝取、運輸、酯化及排泄等過程[29]，過多的膽紅素還會擴散進入組織、大部分內臟器官和體液，引發Dubin-Johnson綜合征、Rotor綜合征、Gilbert綜合征和Crigler-Najjar綜合征[29-31]。TBA由肝臟產生后進入腸道，作為激活法尼醇X受體（farnesoid X receptor，FXR）和G蛋白偶聯膽汁酸受體5（the G-proteincoupled bile acid receptor-5，TGR5）的信號分子可影響腸道激素的合成與分泌，并參與葡萄糖代謝的調節，TBA異常會加劇動物的糖脂代謝紊亂[32-33]，本研究發現，OHT能降低高血脂小鼠的TBIL和TBA濃度，降低糖脂代謝紊亂，且HOLT作用效果顯著。

高血脂模型小鼠血清中的ALT和AST活力水平與脂肪在肝臟表面堆積有關，高脂影響了肝細胞的正常代謝、導致肝細胞損害，是反映肝臟損傷程度的敏感指標[34]，本研究表明在OHT灌胃治療28 d后，高血脂小鼠血清ALT和AST活力極顯著降低，這說明OHT可清除高血脂小鼠堆積在肝臟的脂肪，減輕其對肝臟的損傷。GGT是γ-谷氨酰循環的關鍵酶，既能夠分解谷胱甘肽及其S結合物，又能夠促進細胞內谷胱甘肽的重新合成，GGT還能氧化谷胱甘肽產生一系列自由基，誘導脂質過氧化和氧化損傷，促進細胞病變[35]。ALP是在人與動物組織中廣泛表達的一種胞外核苷酸酶，其水平是用于診斷肝癌、肝硬化及其他肝膽系統疾病的重要指標，與ALT、AST活力可共同反映肝細胞的受損程度[36]。本研究中，低、中、高劑量的OHT對高血脂小鼠的ALT、AST、GGT和ALP水平均具有極顯著的抑制作用，可降低肝細胞的脂質過氧化和氧化損傷，對肝臟起到很好的保護作用。

SOD是細胞內負責清除超氧陰離子自由基的重要內源性抗氧化劑，其活力是反映機體抗氧化能力的敏感指標[23,37]，H2O2在細胞內大量存在時也會對細胞造成損傷，CAT可以將H2O2分解成氧和水，降低細胞內的H2O2水平[23,38]。GSH-Px可以清除由活性氧和自由基誘發的脂質過氧化物，保護細胞膜結構和功能的完整性[23,39]，過多的活性氧會導致脂質過氧化產生MDA，因此MDA濃度可以直接反映機體脂質過氧化和組織過氧化損傷程度[23,40-41]。對正常小鼠進行急慢性毒理學分析發現，OHT能提升小鼠血清中的SOD、CAT和GSH-Px的活力，降低MDA水平，證明OHT可以通過調節氧化酶活力和降低脂質過氧化，進而維持氧化和抗氧化之間的平衡，改善小鼠肝組織的氧化損傷程度，且具有一定的控制體質量的作用。

與CK(0)組相比，高血脂模型小鼠血清的FBG、TC、TG、LDL、TBIL、TBA濃度，HbA1c相對含量，ALT、AST、GGT、ALP活力極顯著增加，HDL濃度極顯著降低，經過28 d的HOHT、MOHT和LOHT灌胃治療，小鼠血清中以上指標得到不同程度恢復，其中HOHT的效果最顯著，其以上作用效果不如PL治療組，但卻強于OL組。在小鼠急慢性毒理研究中一次性灌服OHT最大劑量為30 000 mg/kgmb，遠遠大于毒理學評價標準，說明OHT對小鼠屬于急性無毒物質；在小鼠慢性毒理研究中，連續灌胃OHT 90 d后進行重要臟器病理檢查，均無明顯病理變化，且OHT能提高小鼠血清中SOD、CAT和GSH-Px活力，降低MDA濃度，提高小鼠的抗氧化能力和降低體質量，所以OHT對小鼠屬于慢性無毒性物質。雖然OHT的降血糖血脂作用不如口服降血脂藥物菲勒貝特強烈，但其作用比較溫和、無副作用，是具有很好輔助治療作用的橄欖油保健食品。