獼猴桃軟化過程中細胞壁修飾酶活性與果膠理化特性

古佩嫻，劉聲鵬，黃 超，陳 云，胡 勇，吳小勇，胡 坤,*，伍芳芳,*

（1.廣東藥科大學公共衛生學院，廣東 廣州 510220；2.廣東藥科大學食品科學學院，廣東 中山 528458）

獼猴桃（Actinidiaspp.）又名奇異果，屬于獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）。獼猴桃原產于中國，享有“水果之王”的美譽，是富含多種活性化合物的高營養水果，VC含量尤為顯著。因其具有很高的營養價值、經濟價值和醫療保健作用，而成為產業迅速發展的一種新興水果。但獼猴桃是典型的呼吸躍變型水果，通常情況下其貯藏期和貨架期短，不耐貯運，從而嚴重制約著獼猴桃的經濟發展[1]。研究表明獼猴桃硬度的軟化、營養物質的改變與細胞壁修飾酶、細胞壁多糖的結構變化緊密相關[2]。有學者指出，薄壁組織細胞壁的機械性能、相鄰細胞之間黏附區域的強度和延伸性以及細胞膨脹程度是肉質果實硬度的主要決定因素[3]。

果膠是一種結構復雜的聚合物，自然存在于初生細胞壁和中片層，有助于增強細胞間的黏附力和細胞的機械強度，其復雜性、長度等與果實硬度緊密相關[4-5]。后熟水果在軟化過程中會經歷細胞壁的修飾，其中涉及果膠和部分半纖維素的廣泛解聚、果膠的溶解和果膠側鏈中性糖的損失[6]。常見的細胞壁修飾酶包括果膠酶如多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）、果膠裂解酶（pectate lyases，PL）和糖苷水解酶如β-半乳糖苷酶（β-D-galaetosidase，β-Gal）等[7-10]。為了探索果實質地變化的內在原因，研究者們對不同種類水果細胞壁修飾酶的作用模式進行了廣泛的研究，如冬棗[7]、杏[11]、番荔枝[12]、藍莓[13]等。然而目前對獼猴桃果實在貯藏過程中果膠理化特性與細胞壁修飾酶的綜合研究較少。因此，本實驗以‘亞特’獼猴桃果實為研究對象，探究其軟化過程的果膠結構變化與細胞壁修飾關鍵酶包括PG、PME、PL和β-Gal等的活力變化，分析獼猴桃后熟軟化過程中的細胞壁變化機制。同時，對細胞壁果膠多糖組分進行分離，得到水溶性多糖（water soluble polysaccharide，WSP）、反式-1,2-環己烷二胺四乙酸（trans-1,2-cyclohexanediaminetetraacetic acid，CDTA）溶性多糖（CDTA-soluble polysaccharide，CSP）和Na2CO3溶性多糖（Na2CO3-soluble polysaccharide，NSP），并對其理化特性進行進一步研究，為果實軟化的機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮‘亞特’獼猴桃（Actinidia deliciosa‘Yate’）采集自中國陜西省周至縣，選擇成熟度一致（可溶性固形物含量為（10.0±0.2）oBrix）、大小均一的果實作為實驗樣品。

PL活性檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白質定量試劑盒 上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜、氯仿、甲醇、濃硫酸（均為分析純）廣東廣試試劑科技有限公司；果膠（半乳糖醛酸質量分數大于74.0%）、溴化鉀（色譜純） 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TA-XT plus物性測試儀 英國Stable Micro Systems公司；RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；UV-1800紫外分光光度計 日本島津公司；Synergy H1多功能微孔版檢測儀 美國Biotek儀器公司；Nicolet IS50傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；Nano-ZS激光粒度分析儀 英國Malvern儀器有限公司；1525高效凝膠滲透色譜儀（配備2414示差檢測器） 美國Waters科技公司；SDT 650熱分析儀 美國TA儀器公司；EVO-18掃描電子顯微鏡德國ZEISS公司。

1.3 方法

1.3.1 獼猴桃樣品的處理

將獼猴桃樣品隨機分成4 組，每組樣品個數相同，分別貯存在（5±1）℃、80%相對濕度的冰箱中，以便果實進一步成熟軟化。在每個取樣日期（第0、5、10、15天）進行果實硬度測定，并收集獼猴桃無籽果肉用于細胞壁修飾酶活力、果膠成分的提取和相關指標的測定，將第0天的獼猴桃樣品設為對照。

1.3.2 果實硬度測定

使用物性分析儀測定果實的硬度。為了保證硬度測定的準確性，在相同的環境條件下（溫度、濕度、空氣流速）將獼猴桃果實切半，在果實赤道部位90°垂直于地面方向測量2 次，取平均值。測試模式選擇質構剖面分析（texture profile analysis，TPA），參數設置：探頭P5；觸發力5.0 g；測試前速率1.0 mm/s；測試速率5.00 mm/s；測試后速率5.00 mm/s；時間5 s。硬度單位為N。

1.3.3 細胞壁修飾酶活力測定

所有細胞壁修飾酶的提取與活力測定均在冰浴條件下進行。PL活力采用試劑盒測定。PG的活力參考Zhou Qian等[14]的方法測定，以1 mL酶液每小時催化果膠生成1 mg半乳糖醛酸表示一個單位酶活力（U），單位為U/mg。PME活力采用Saleem等[15]的方法測定，以每分鐘引起反應體系在620 nm波長處吸光度變化1表示一個單位酶活力（U），單位為U/mg。β-Gal活力參考Yi Junjie等[9]的方法測定，以1 mL酶液每小時產生1 μmol/L對硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）表示一個酶活力單位（U）。以上酶活力單位均為U/mg。每次測定分別隨機取4～8 個果實的無籽果肉混勻并設3 個重復。

1.3.4 獼猴桃果膠多糖的提取分離與理化特性研究

1.3.4.1 細胞壁成分的提取與分離

根據Cybulska[5]和Chen Yihui[16]等的方法，使用體積分數95%乙醇溶液、氯仿/甲醇（1∶1，V/V）混合物及體積分數80%丙酮溶液對果肉進行除雜，體積分數90%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）4 ℃浸提過夜，所得到的殘渣干燥后分別用去離子水、20 mmol/L CDTA溶液（pH 6.5，含100 mmol/L NaAc）、50 mmol/L Na2CO3溶液浸泡振蕩，并用4 倍體積的無水乙醇進行靜置沉淀，分別得到WSP、CSP和NSP。冷凍干燥后置于干燥器中保存備用。

1.3.4.2 果膠含量、蛋白質含量、酯化度和甲氧基質量分數的測定

參考Gerschenson等[17]的方法，采用硫酸-咔唑法測定樣品中的果膠含量。以去離子水為空白對照，以半乳糖醛酸繪制標準曲線，WSP、CSP和NSP中果膠的含量以每克凍干樣品中含有的半乳糖醛酸質量表示，單位為mg/g。蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定，以牛血清白蛋白繪制標準曲線，在595 nm波長處測定吸光度并按Bradford[18]所述方法計算蛋白質含量。酯化度與甲氧基質量分數采用化學滴定法測定[19]。

1.3.4.3 傅里葉變換紅外光譜、粒徑分布與Zeta電位測定

取少量凍干的多糖樣品與適量干燥的KBr混合充分研磨后壓成薄片，使用傅里葉變換紅外光譜儀進行紅外掃描，光譜掃描范圍為400～4 000 cm－1。使用Nano-ZS激光粒度分析儀在25 ℃下測定多糖溶液（2 mg/mL）的Zeta電位和粒徑分布。

1.3.4.4 分子質量測定

參考Ren Yuanyuan等[12]的方法采用高效凝膠滲透色譜法測定樣品的分子質量。將不同分子質量的葡聚糖標準品（5.2～668.0 kDa）和凍干的多糖樣品用0.02 mol/L KH2PO4溶液溶解，分別配制成2 mg/mL的溶液，過0.22 μm的濾膜后即可上機檢測。上樣量為20 μL，柱溫固定在35 ℃，流動相為0.02 mol/L KH2PO4緩沖液，流速為0.6 μL/min。色譜柱為TSK G-5000 PWXL柱（300 mm×7.8 mm）和TSK-GEL-G-3000柱（300 mm×7.8 mm）串聯。

1.3.4.5 熱穩定性分析

使用熱分析儀對多糖樣品進行熱重（thermogravimetric，TG）分析。每個多糖樣品（3～7 mg）在流動的氮氣環境中以25 ℃/min的速率從室溫加熱到500 ℃。將所得數據繪制成TG和微分熱重（derivative thermogravimetric，DTG）分析曲線。

1.3.4.6 掃描電子顯微鏡觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察獼猴桃多糖WSP、CSP和NSP的形貌特征。取適量冷凍干燥后的樣品用導電膠固定在樣品臺上，在其表面噴涂3～6 nm厚金層，在加速電壓10 kV、放大500 倍的條件下觀察樣品。

1.4 數據處理與統計分析

采用Excel 2010軟件進行數據統計處理，結果以平均值±標準差表示；采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析和相關性分析，并使用Origin 2021軟件繪圖。設置差異顯著性的檢驗水平為α＝0.05。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃果實貯藏過程中的硬度變化

如圖1所示，在實驗條件下，獼猴桃果實的硬度表現為先快速下降后緩慢下降的經典兩段式軟化歷程，與大多數獼猴桃果實軟化模型[20]相同。在貯藏的前5 d內硬度下降幅度最大（85.19%），從24.98 N迅速降至3.70 N。此后果實由快速軟化階段進入緩慢軟化階段。15 d時果實的硬度小于1 N，獼猴桃達到完全軟化。

圖1 貯藏期間獼猴桃果實的硬度變化Fig. 1 Changes in the hardness of kiwifruits during storage

2.2 獼猴桃果實貯藏過程中的細胞壁修飾酶活力變化

如圖2A～C所示，PG、PME、PL活力均表現出先上升后降低的變化趨勢，15 d時PG和PME活力均顯著低于0 d時的酶活力，這與賈德翠等[21]的研究結果一致。PG活力在貯藏10 d內持續上升，第10天達到最大值（670.76 U/mg），貯藏15 d時急劇下降，僅為127.09 U/mg。貯藏5 d時PME活力達到最大值（9.17 U/mg），此后下降至低于1 U/mg。PME活力變化特征與Yi Junjie[9]和Fan Xinguang[11]等的研究結果一致。貯藏的前5 d內，PG和PME活力增長幅度最大，與此時獼猴桃果實硬度的快速下降相對應。有研究表明，在PG和PME兩種酶的共同作用下，β-Gal從鼠李半乳糖醛酸聚糖I（rhamnogalacturonan I，RG-I）的側鏈和果膠脫氧基團中流失，與早期果實的快速成熟密切相關[22]，Cárdenas-Péreza等[23]的研究表明，在5 ℃、相對濕度26%條件下，芒果成熟的初始階段，PME的活性增強并產生大量果膠酸，從而為PG發揮作用提供底物，造成果實硬度的損失。PL活力高峰出現在貯藏的第5天，達3.41 U/mg。

圖2 貯藏期間獼猴桃果實的PG（A）、PME（B）、PL（C）和β-Gal（D）活力Fig. 2 PG (A), PME (B), PL (C) and β-Gal (D) activities in kiwifruits during storage

β-Gal通過作用于細胞壁多糖側鏈中的非還原末端β-D-半乳糖殘基，促進細胞壁結構的解體[24]。如圖2D所示，在整個后熟過程中，獼猴桃果實β-Gal的活力持續上升，至第15天時達到峰值（12.58 U/mg）。

2.3 貯藏期間獼猴桃果實細胞壁多糖理化特性分析

2.3.1 果膠含量、蛋白質含量、酯化度和甲氧化程度分析

由表1可知，在整個貯藏期間獼猴桃無籽果肉中WSP的果膠含量呈現出持續上升的趨勢，與Wang Hui等[25]的研究結果一致。貯藏至15 d時WSP果膠含量達到9.42 mg/g，相比于貯藏0 d增長了334.10%（P＜0.05）。在貯藏的10～15 d，WSP果膠含量的增長幅度最大。結合圖2結果，10 d時是PG活力最高的時間，提示PG活力對細胞壁成分間的轉化起關鍵作用。與以往研究中CSP果膠含量持續降低[12,25]表現不同的是，本研究中貯藏10 d時的CSP果膠含量驟然增加，這可能與此時PME活力被抑制，CSP與Ca2＋交聯形成“蛋盒”結構有一定的關系[26]。在果實成熟后期，CSP和NSP果膠含量的下降削弱了細胞壁的強度，從而加劇了細胞壁的變薄和致密結構的松動[27]。

表1 貯藏期間WSP、CSP和NSP的果膠含量、蛋白質含量、酯化度和甲氧基質量分數Table 1 Pectin contents, protein contents, esterification degrees and methoxy contents of WSP, CSP and NSP during storage

由表1可知，NSP的蛋白質含量在4 個貯藏時間點均高于WSP和CSP，NSP中蛋白質含量在貯藏10 d時最高，達到2.01 mg/g。酯化度和甲氧基質量分數測定結果表明獼猴桃中提取得到的WSP、CSP和NSP均為高酯果膠（high-methoxy pectin，HMP），酯化度均大于50%，且甲氧基質量分數均大于7%。甲氧基質量分數也是反應果膠酯化度的指標[28]。CSP和NSP的酯化程度于貯藏10 d時降低，這可能與PME能夠催化果膠半乳糖醛酸殘基，使果膠部分脫去甲氧基，催化果膠酯酸轉化為果膠酸，生成適合PG作用的底物有關[29]。

2.3.2 傅里葉變換紅外光譜分析

圖3中，在3 420～3 439 cm－1處呈現的下降寬頻帶吸收峰提示存在廣泛的分子內O—H鍵伸縮振動；在2 923～2 833 cm－1處觀察到的較小吸收峰可能是糖鏈中甲基和甲酯中甲基的C—H鍵伸縮與彎曲振動引起的；1 728～1 752 cm－1處的伸縮振動由乙酰基或醛基的C＝O共振所引起；1 595～1 630 cm－1處和1 408～1 425 cm－1處的吸收峰分別歸屬于羧基（—COOH）的非對稱共振和對稱共振峰，其中1 728～1 752、1 595～1 630 cm－1與1 408～1 425 cm－1處的特征吸收峰共同構成了果膠中糖醛酸的特征結構[30]。在1 250～1 267 cm－1和1 105～1 109 cm－1區域的吸收峰分別是由C—O、C—H或C—C伸縮共振引起，WSP和CSP在1 100 cm－1附近的吸收峰通常與葡萄糖殘基中C—O—C和C＝O的伸縮振動有關；在910 cm－1附近的特征吸收峰歸屬為β-D-吡喃葡萄糖峰。NSP于848～907 cm－1區間存在α-D-吡喃葡萄糖環的特征吸收峰。綜合來看，0～15 d的貯藏過程中，CSP和NSP的O—H鍵伸縮振動峰發生藍移，分別從3 397.5 cm－1和3 395.6 cm－1移位至3 432.7 cm－1和3 465.0 cm－1，這可能與樣品中Ca2＋與果膠基質之間的氫鍵變化有關[31]。與貯藏前期（0 d）相比，貯藏后期（15 d）WSP中離子羧基（—COO—）的非對稱伸縮振動峰發生了藍移（從1 596.3 cm－1移位至1 630.5 cm－1）。CSP的C＝O鍵振動峰與烷基中C—H變形振動吸收峰在貯藏過程中（0～15 d）發生紅移，分別從1 647.9 cm－1和1 456.5 cm－1移位至1 598.7 cm－1和1 412.1 cm－1。貯藏0 d時，CSP中存在865.9 cm－1處的伸縮共振吸收峰，提示此時的CSP含有α-糖苷鍵，貯藏5 d后CSP中α-糖苷鍵的振動峰消失，這種變化可能與葡萄糖異構化有關[32]。

2.3.3 Zeta電位與粒徑分析

多糖的Zeta電位反映了多糖溶液的穩定性，一般而言， Zeta電位的絕對值越高多糖越穩定[33]。如圖4A1～C1所示，WSP的Zeta電位絕對值小于15 mV，貯藏期間Zeta電位變化不顯著。與其他兩種多糖相比，CSP具有最大的負電荷量，貯藏至5 d時Zeta電位絕對值升高至大于30 mV，比貯藏0 d時的Zeta電位絕對值升高了63.31%，此后Zeta電位不再發生顯著變化，表明貯藏5 d后CSP具有更高的分子間斥力，相對穩定。NSP的Zeta電位絕對值先增大后減小，貯藏15 d時NSP的Zeta電位絕對值為14.32 mV，與貯藏中期相比穩定性下降。

圖4A2～C2所示，貯藏0 d時WSP的平均粒徑為923 nm，貯藏5 d后平均粒徑增大，在貯藏10 d 后平均粒徑穩定在1 300 nm左右。CSP粒徑分布圖存在兩個信號峰，貯藏0 d兩個峰存在部分重疊，主峰位于1 473 nm處，次峰位于255 nm處。貯藏5 d后兩個信號峰逐漸分離，至貯藏15 d時出現粒徑約為59 nm的成分。NSP的粒徑分布變化與CSP相似，貯藏0 d時NSP的兩個主峰位于59～825 nm內，存在部分重疊；另外，在5 560 nm附近出現了一組弱信號峰，可能是樣品中存在的較大原纖維或團塊所引起。貯藏5 d后NSP信號峰逐漸分裂，15 d時出現38 nm左右的小粒徑成分。

2.3.4 分子質量分析

多糖的理化、功能和生物學特性與其分子質量密切相關[33]。如表2所示，WSP的重均分子質量（mw）均在貯藏過程中呈逐漸增大趨勢，0 d時主要分布于0.93 kDa，其次位于7.81×102kDa；貯藏5 d時mw分布在1.09～73.2 kDa范圍內，多分散性系數（polydispersity index，PDI）接近1，提示此時WSP分子質量分布均勻，樣品均一性較好[28]。貯藏10 d后WSP的mw分布范圍逐漸增加，至15 d時主要出現5.26×102kDa的成分，PDI比貯藏0 d時增大。CSP在貯藏0 d時分子質量分布不均勻，其mw在0.73～1.09×103kDa范圍內均有分布；貯藏5 d后分布范圍稍有變窄，15 d時主要分布在5.47×102kDa處。綜合來看，CSP在貯藏0 d時mw較大，貯藏5 d開始CSP的mw先減小后增加。NSP的mw在貯藏開始時主要分布于0.89 kDa處，貯藏15 d時NSP的分子質量分布于0.17～84.60 kDa范圍內，此時樣品的PDI接近1，分子質量分布均勻。從NSP的分子質量分布來看，貯藏5 d后NSP主要成分的mw有逐漸減小的趨勢，貯藏至15 d時長鏈成分消失，分子質量分布較均勻。結合β-Gal活力分析結果，NSP分子長度的縮短可能與側鏈中糖苷鍵的斷裂有關[5]。

表2 貯藏期間WSP、CSP和NSP的分子質量Table 2 Molecular masses of WSP, CSP and NSP during storage

2.3.5 熱穩定性分析

熱穩定性是多糖的重要化學性質之一[34]。如表3所示，在室溫至500 ℃的升溫過程中，WSP和NSP主要經歷了2 個分解階段，而CSP經歷了3 個分解階段。WSP降解的階段I發生在25.00～162.34 ℃范圍內，質量損失成分包括填充在果膠鏈之間的結合水和揮發性化合物等。階段I引起的質量損失隨著貯藏時間的延長逐漸增加，提示貯藏時間越長，鍵合在WSP糖鏈上的水越多。階段II發生在151.58～499.24 ℃范圍內，此時果膠的半乳糖醛酸鏈發生熱降解釋放出二氧化碳、一氧化碳、水和脂肪族化合物[35]。貯藏10 d時WSP階段II的結束溫度最高，為499.24 ℃，可能與此時WSP的分子質量最大有關。在階段II，WSP的質量損失率隨著貯藏時間的延長逐漸減少，降解結束后的殘余量呈增加趨勢，提示貯藏時間越久，獼猴桃WSP糖鏈的熱穩定性越好。CSP的熱降解階段I發生在29.31～179.99 ℃，此階段質量損失率隨貯藏時間延長逐漸增加，貯藏15 d時質量損失率最大，是貯藏0 d時的近2 倍；階段II發生在168.43～363.19 ℃，質量損失率隨貯藏時間延長先升高后降低再升高，貯藏15 d時的質量損失率最大，為30.29%。CSP獨有的階段III降解發生在344.63～498.30 ℃，此階段CSP的損失主要為糖鏈上的芳香碳殘留物[36]，質量損失率隨貯藏時間延長呈減少趨勢。NSP的熱降解階段I發生在30.11～178.70 ℃；階段II發生在157.02～498.37 ℃，貯藏5 d時的NSP在整個貯藏過程中質量損失率最少，降解結束溫度最高，殘余量最多，提示此時的NSP熱穩定性最好。本研究中‘亞特’獼猴桃中WSP、CSP和NSP的熱分解過程與其他品種獼猴桃[37]相一致，其中，WSP在貯藏15 d時熱穩定性最好，CSP和NSP在貯藏5 d時熱穩定性相對于其他時期較好。

表3 貯藏期間WSP、CSP和NSP的熱重分析結果Table 3 Thermal gravimetric analysis of WSP, CSP and NSP during storage

2.3.6 果膠的微觀形態觀察

如圖5所示，在放大500 倍的視野下，WSP表現為不規則的片狀結構，表面相對光滑平整、層次清晰，表明多糖鏈發生聚集。貯藏0 d時WSP的微觀結構較纖薄，貯藏5 d時片層增厚，面積較大，貯藏15 d時樣品呈較小薄片狀層疊排列，面積變小。貯藏0 d的CSP有大的空腔、扁平的膜狀結構，為團簇狀結構的混合，有較多交聯纏繞形成，貯藏5 d時CSP變得松散，呈褶皺薄紗狀，孔洞變小，邊緣出現分支；此后CSP表現為更加光滑柔軟，孔洞消失。貯藏期間NSP的微觀形態呈表面毛糙的團簇狀結構，貯藏5 d時NSP的不規則粗糙團塊結構排列更加緊湊，貯藏10 d時有邊緣粗糙的片狀結構出現，排列較松散，15 d時塊狀結構崩塌，呈現出分散的顆粒團簇形態，碎屑增多，證實了部分NSP糖鏈在貯藏15 d時發生斷裂和解離。

圖5 貯藏期間 WSP、CSP和NSP的掃描電子顯微鏡圖Fig. 5 SEM images of WSP, CSP and NSP during storage

2.4 相關性分析

如表4所示，獼猴桃果實硬度與貯藏時間之間呈極顯著負相關（r＝－0.829）。PL活力與PG活力（r＝0.811）、PME活力（r＝0.903）均呈極顯著正相關，提示這3 種果膠降解酶之間關系密切，共同導致了果實質地的軟化。β-Gal活力與果實硬度之間呈極顯著負相關（r＝－0.888），這與李圓圓等[38]的研究結果一致；同時，β-Gal活力與WSP果膠含量之間呈極顯著正相關（r＝0.967），提示果膠側鏈中的半乳糖損失導致了WSP的積累[24]。貯藏時間與WSP的重均分子質量呈極顯著正相關（r＝0.921）。CSP的重均分子質量與貯藏時間呈顯著負相關（r＝－0.626），與PG、PL和PME活力均呈顯著或極顯著相關（r分別為0.735、－0.818、－0.581），提示貯藏期間果膠酶對CSP的鏈長影響較大。

表4 獼猴桃貯藏期間各項指標相關分析Table 4 Correlation analysis among physicochemical indicators of kiwifruits during storage

3 結 論

在（5±1）℃、80%相對濕度的條件下獼猴桃果實硬度表現為兩段式下降模式，果實發生軟化。結合細胞壁修飾關鍵酶活力測定與多糖理化性質測定結果發現，β-Gal活力與WSP果膠含量之間呈極顯著正相關關系；PG、PL和PME活力與CSP分子質量均呈顯著或極顯著負相關；另外，在貯藏5 d時，PME和PL活力均達到最大值，此時NSP的果膠含量最小，CSP的α-糖苷鍵振動峰消失且重均分子質量減小，掃描電子顯微鏡下觀察其結構變得松散并出現邊緣分支，宏觀上表現為果肉硬度的下降幅度達到最大，獼猴桃經歷快速軟化。上述相關變化均提示，獼猴桃果肉中細胞壁修飾關鍵酶對于果肉中的細胞壁多糖組分及結構改變具有重要作用，最終導致了獼猴桃果實在貯藏過程中的質地軟化。