高通量測序法分析貯藏期甜瓜果實中真菌群落結構組成及動態變化

鄭賀云，朱麗霞，姚 軍，李 超，張翠環，汪志偉，耿新麗,*

（1.新疆維吾爾自治區葡萄瓜果研究所，新疆 鄯善 838200；2.塔里木大學食品科學與工程學院，新疆 阿拉爾 843300）

甜瓜是世界上最受歡迎的水果之一，富含糖、維生素、抗壞血酸、胡蘿卜素、葉酸、鈣、磷、鉀等營養物質[1]，備受廣大消費者的青睞。甜瓜在我國栽培歷史悠久，隨著產業的可持續發展，其栽培面積不斷擴大，聯合國糧食及農業組織統計數據庫（http://fao.org）顯示，2020年，我國甜瓜栽培面積和產量均居世界前列，種植面積為38.78萬 hm2，產量為138.65萬 t。甜瓜果實糖和水分含量較高，生理代謝旺盛，后熟衰老速度較快，采收、運輸和貯藏期間水分散失和呼吸蒸騰作用會導致果實萎蔫、軟化等品質劣變，而病原菌侵染致果實腐爛現象更為普遍，造成了巨大的經濟損失。

近年來，諸多研究已將采后甜瓜腐爛與真菌侵染緊密聯系起來，從采后甜瓜中鑒定出的致病菌主要包括鏈格孢、鐮刀菌、粉紅單端孢、青霉等[2]。然而，采后果實中微生物群落系統復雜，其相互作用直接影響果實的品質和貯藏性能。內生真菌通常不會引發植物病害，其可以通過與病原體直接相互作用或誘導宿主產生激素促進植物生長來提高寄主植物的抗性，但是其與寄主的共生平衡被打破后有可能轉變為病原物潛伏在植物體內，最終引起病害癥狀[3]。

傳統的微生物培養分離技術可以量化可培養的微生物，并能將它們鑒定到屬、種，但只有極少部分微生物能夠實現分離與培養，絕大多數微生物不能獲得純培養物，而且其操作費時費力，結果會因操作誤差而產生偏差[4]。2006年，有研究者通過高通量測序技術對深海微生物群落進行了分析[5]，目前該技術已被廣泛用于研究不同基質微生物群落的動態變化和多樣性。有研究者利用該技術分析不同時期柑橘果實中的真菌種類，發現不同生長階段的柑橘果皮和果肉組織中優勢菌群差異顯著[6]；Qiu Wanwei等[7]評價冬菇冷藏過程中微生物多樣性變化，結果表明冷藏條件下蘑菇貯藏后期假單胞菌、綠桿菌和金桿菌豐度較高；Li Meng等[8]分析了板栗貯藏過程中真菌群落組成的變化，建立了真菌介導的腐爛與板栗貯藏期品質之間的相互關系；Dai Kun等[9]通過高通量測序分析真菌群落的變化，從而監測貯藏過程中楊梅的腐爛程度和果實品質，為楊梅采后貯藏過程中腐爛和品質變化的監測提供了新的思路。目前，高通量測序技術已成功地應用于黃瓜[10]、花生[11]、菠菜[12]、菜心菜[13]、番茄[14]等果蔬貯藏過程中微生物群落變化的解析。上述研究證實利用高通量測序技術可以對果蔬中微生物群落之間的相互關系進行深入的解析。

為了解貯藏期甜瓜果實中真菌群落的變化，本研究利用Illumina MiSeq高通量測序平臺對‘西州密25號’甜瓜不同貯藏期的果皮和果肉中真菌群落進行內部轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）測序，以期對貯藏期甜瓜果皮和果肉組織中真菌群落組成和動態變化進行解析，為采后病害的發生規律及后續甜瓜保鮮、內生生防菌的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘西州密25號’由新疆維吾爾自治區葡萄瓜果研究所育成，于2021年4月18日播種在新疆維吾爾自治區葡萄瓜果研究所甜瓜貯藏與運輸課題試驗基地，行距3 m，株距45 cm，施行膜下滴管栽培模式和田間常規管理。2021年7月9日采收，選擇大小及成熟度一致、無病蟲害、無機械損傷的果實置于溫度為（23.0±0.5）℃、相對濕度為70%～80%的環境下貯藏。

DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

3K15高速冷凍離心機 德國Sigma公司；Scientz-48高通量組織研磨器 寧波新芝生物科技股份有限公司；DYY-11型電泳儀 北京市六一儀器廠；移液槍 德國Eppendorf公司；IE412-L電子天平 德國Sartorius公司；凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；HYSW-10A超純水機 南京恒裕儀器設備制造有限公司；MLS-3750蒸汽滅菌鍋 日本三洋公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

取樣時間分別為0 d（甜瓜果實采收的當天，果實新鮮）、7 d（甜瓜果實果皮轉黃，步入衰老階段）、14 d（甜瓜果實表面開始出現輕微的腐爛）、21 d（甜瓜果實開始大面積腐爛）。每次隨機選取9 個果實，每3 個一組，進行3 次重復，分別取果皮和果肉組織。果皮樣品由隨機選取3 個果實的全果皮混合而成，果肉樣品由距離果皮2.5 cm處一圈果肉混合而成，取樣后置于－80 ℃保存備用。貯藏0 d果皮、果肉分別記為P4、R4，貯藏7 d果皮和果肉分別記為P5、R5；貯藏14 d果皮和果肉分別記為P6、R6；貯藏21 d的果皮和果肉分別記為P7、R7。

1.3.2 甜瓜樣品ITS序列測定

以樣品的基因組DNA為模板，文庫的建立和基于Illumina測序平臺對甜瓜樣品中真菌群落DNA片段進行的雙端測序均由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。ITS測序引物為F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’；R：5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’。

1.3.3 測序數據分析

利用QIIME2軟件對原始數據進行分析，首先調用qiime cutadapt trim-paired切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列；然后通過qiime dada2 denoise-paired調用DADA2進行質控、去噪、拼接、去嵌合體獲得擴增子序列變體（amplicon sequence variants，ASVs）。序列長度分布統計使用R語言腳本，對全部樣本中所包含的高質量序列長度分布進行統計。

1.4 數據統計與分析

使用上海派森諾生物科技股份有限公司的生信云平臺（https://www.zcygov.cn/）對真菌群落組成、群落多樣性、種群差異等進行分析。

2 結果與分析

2.1 序列有效性分析

貯藏期果肉和果皮組織共24 個樣品，通過Illumina MiSeq平臺測序，最終共計獲得1 937 667 對雙端序列，經過質控、去嵌合體后獲得1 638 150 條高質量序列，序列長度范圍為155～369 bp，平均長度為230 bp。

2.2 不同貯藏期甜瓜真菌群落組成分析

2.2.1 甜瓜樣品中ASV分析和物種注釋

分類學分析結果表明，在貯藏期果皮和果肉組織24 個樣品中共鑒定出真菌3 個門、23 個綱、54 個目、106 個科、123 個屬。

2.2.2 基于門水平貯藏期甜瓜真菌組成結構分析

如圖1所示，在門水平上子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）是甜瓜貯藏期果皮和果肉24 個樣品中的優勢菌群，相對豐度分別為69.65%和29.68%，毛霉門（Mucoromycota）的相對豐度為0.67%。貯藏期內（0～21 d），果皮中子囊菌門的相對豐度呈先上升后下降的趨勢，且其在貯藏14 d時占絕對優勢，相對豐度達99.06%，而擔子菌門的相對豐度呈先下降后上升的趨勢；果肉中子囊菌門的相對豐度呈先下降后上升的趨勢，而擔子菌門的相對豐度則呈先上升后下降的趨勢，并在貯藏14 d時占絕對優勢，相對豐度高達66.46%。毛霉門只在貯藏0 d的果皮和和果肉組織中檢出，其相對豐度分別只有2.17%和3.14%。

圖1 基于門水平甜瓜樣品中真菌群落組成Fig. 1 Fungal community composition in melon samples at the phylum level

2.2.3 基于目水平貯藏期甜瓜果皮和果肉組織中真菌結構分析

如圖2所示，甜瓜貯藏期果皮和果肉24 個樣品在目水平共注釋到10 個相對豐度大于1%的真菌微生物群落，分別是散囊菌目（Eurotiales）（相對豐度28.55%）、格孢腔菌目（Pleosporales）（相對豐度17.12%）、銀耳目（Tremellales）（相對豐度16.55%)、肉座菌目（Hypocreales）（相對豐度12.50%）、線黑粉菌目（Filobasidiales）（相對豐度3.42%）、酵母菌目（Saccharomycetales）（相對豐度2.60%）、馬拉色菌目（Malasseziales）（相對豐度2.48%）、小囊菌目（Microascales）（相對豐度2.02%）、煤炱目（Capnodiales）（相對豐度1.66%）和葉黑粉菌目（Entylomatales）（相對豐度1.41%）。

圖2 基于目水平甜瓜樣品中真菌群落組成Fig. 2 Fungal community composition in melon samples at the order level

整個貯藏期內（0～21 d），果皮與果肉中優勢菌群差異較為明顯，新鮮果實（0 d）的果皮中格孢腔菌目、銀耳目、肉座菌目占據優勢，而果肉中優勢菌群為格孢腔菌目、銀耳目和小囊菌目。隨著貯藏時間的延長，貯藏21 d時果皮中檢測到的優勢菌群以散囊菌目為主，肉座菌目次之，貯藏14 d時散囊菌目占絕對優勢，相對豐度高達87.36%；貯藏21 d時果肉中的優勢菌群除格孢腔菌目、銀耳目和小囊菌目外，還包括為肉座菌目、酵母菌目和葉黑粉菌目。綜上，貯藏21 d時果皮中的優勢菌群為散囊菌目和肉座菌目，而果肉中格孢腔菌目、銀耳目和肉座菌目占優勢。

2.2.4 基于屬水平貯藏期甜瓜果皮和果肉組織中真菌結構分析

如圖3所示，在屬水平上，甜瓜貯藏期果皮和果肉24 個樣品中相對豐度排名前10 位的優勢菌群分別為曲霉屬（Aspergillus）、維什尼亞科齊馬菌屬（Vishniacozyma）、鏈格孢屬（Alternaria）、單端孢屬（Trichothecium）、Papiliotrema、青霉屬（Penicillium）、黑粉酵母屬（Filobasidium）、附球菌屬（Epicoccum）、綠僵菌屬（Metarhizium）、畢赤酵母屬（Pichia）。

圖3 基于屬水平甜瓜樣品中真菌群落組成Fig. 3 Fungal community composition in melon samples at the genus level

從圖3和表1可以看出，貯藏0 d時果實較新鮮，果皮中菌群相對均衡，優勢菌為綠僵菌屬、維什尼亞科齊馬菌屬和鏈格孢屬，曲霉屬和Papiliotrema相對豐度較低；貯藏7～14 d時優勢菌群轉變成曲霉屬，鏈格孢屬次之，在第14天時曲霉屬相對豐度達到峰值（84.06%），這個時期部分果實表面開始出現黑色斑塊，斑塊上出現黑色顆粒狀物，形成黑色霉斑，依據形態學分析鑒定為典型的黑曲霉[15]；貯藏21 d時曲霉屬、單端孢屬和Penicillium占主要地位，果實表面部分病斑布滿淺粉紅色霉層，邊緣霉層為白色，病斑周圍有水漬狀，而軟化腐爛為粉紅單端孢的典型特征[16]，還有部分病斑為青綠色，病斑上有青綠色霉狀物，與青霉菌引起的癥狀相符[17]。貯藏0 d時，果肉中鏈格孢屬、Papiliotrema和附球菌屬的相對豐度較高，隨著貯藏時間的推移，維什尼亞科齊馬菌屬、鏈格孢屬和單端孢屬轉變成優勢菌群。貯藏7～14 d果實進入衰老期，但果實無腐爛癥狀，維什尼亞科齊馬菌屬占據絕對優勢，相對豐度分別為30.29%（7 d）和42.83%（14 d）；貯藏后期（21 d）單端孢屬相對豐度較高（29.64%），維什尼亞科齊馬菌屬和畢赤酵母屬次之，相對豐度分別為11.87%和8.97%。綜上，甜瓜貯藏期果皮和果肉中的優勢菌屬存在較大差異，貯藏21 d時果皮中曲霉屬、鏈格孢屬、單端孢屬為優勢菌屬，而果肉中的優勢菌屬則為單端孢屬、維什尼亞科齊馬菌屬和畢赤酵母屬。

表1 甜瓜果實組織中真菌ASVs優勢菌群相對豐度分析Table 1 Relative abundance analysis of dominant groups of fungal ASVs in melon fruit tissues %

2.2.5 基于種水平貯藏期甜瓜果皮和果肉組織中真菌結構分析

如圖4所示，甜瓜貯藏期果皮和果肉24 個樣品中在種水平上注釋到相對豐度排名前10 位的優勢菌群分別Vishniacozyma tephrensis（相對豐度8.21%）、粉紅單端孢（Trichothecium roseum）（相對豐度6.94%）、卡恩斯維希尼克氏酵母（Vishniacozyma carnescens）（相對豐度3.42%）、Filobasidium magnum（相對豐度2.59%）、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）（相對豐度2.42%）、產黃青霉菌（Penicillium chrysogenum）（相對豐度2.29%）、淺黃隱球酵母菌（Papiliotrema flavescens）（相對豐度2.11%）、黑附球菌（Epicoccum nigrum）（相對豐度1.85%）、雜色曲霉（Aspergillus versicolor）（相對豐度1.73%）、限制馬拉色菌（Malassezia restricta）（相對豐度1.46%）和其他（相對豐度66.98%）。

貯藏0 d時，果皮中主要優勢菌種為M. anisopliae、V. tephrensis、P. flavescens，隨著貯藏時間的延長，這些具有生防效果的菌群相對豐度大幅下降，并在貯藏14 d時基本消失，導致貯藏后期（21 d）T. roseum、P. chrysogenum、A. versicolor等致病菌迅速生長繁殖，促使甜瓜產生嚴重的粉霉病。果肉中真菌群落組成隨著貯藏時間的延長差異明顯，V. tephrensis、V. carnescens、F. magnum和P. flavescens相對豐度先上升后下降，貯藏21 d時T. roseum占絕對優勢，因此，T. roseum是甜瓜采后不可忽視的病菌。

2.3 果實組織間顯著差異性群落和種群分析

使用ASV豐度特征表制作的維恩圖可以用來統計樣本之間共有和獨有的物種數目，從而直觀地顯示樣本在ASV水平上組成的相似性及重疊性。如圖5所示，由維恩圖解析不同貯藏期甜瓜果皮和果肉樣品及不同時期果實中真菌群落的異同，發現果皮中的ASV有57 個，果肉中的ASV有47 個，兩者共有的ASV有11 個，占ASV總數的10.75%，貯藏期果皮中的ASV多于果肉，由此可知，貯藏期果皮的真菌群落豐富度高于果肉。從貯藏0、7、14、21 d果實組織中檢測到的ASV分別為42、35、24、27 個，其特有的ASV分別為33、20、8、11 個，這4 個時期檢測出共有的ASV為4 個，貯藏期內ASV數量呈先下降后上升的趨勢（圖6）。綜上，可通過高通量測序技術獲得較多真菌群落種類和豐富度方面的信息，在本研究貯藏條件下，只有一部分真菌進一步生長，進而在一定條件下導致甜瓜果實腐爛。

圖5 貯藏期甜瓜果皮和果肉樣品ASVs分布維恩圖Fig. 5 Venn diagram of ASV distribution in melon peel and pulp during storage

圖6 不同貯藏時期果實中真菌群落ASVs分布花瓣圖Fig. 6 Petal diagram of ASVs distribution of fungal communities in melon fruit at different storage periods

根據屬水平ASV平均豐度排名前20 位的菌群數據繪制熱圖，將不同的ASV根據操作分類單元豐度分布或樣本間的相似度加以聚類，熱圖中不同顏色可反映出不同時期甜瓜果實組織中真菌群落的相似性、差異性及物種聚類關系。如圖7所示，貯藏0 d時，剛采摘成熟的果實較新鮮，營養較豐富，附球菌屬（Epicoccum）、Papiliotrema、被孢霉屬（Mortierella）、馬拉色氏霉菌屬（Malassezia）、光黑殼屬（Preussia）、綠僵菌屬（Metarhizium）、阿德利長西氏酵母屬（Naganishia）是果實中積累的特異性真菌群落。附球菌屬能夠抵御細菌，也能引起甜瓜病害，王郅媛等[18]在華萊士甜瓜上分離得到黑附球菌并確定其為甜瓜的病原菌；Papiliotrema為一種酵母屬真菌；被孢霉屬在生物技術和生物轉化應用方面具有重要的價值，同時還可以引起動植物病害[19]；馬拉色氏霉菌屬是一種致病菌；綠僵菌屬為昆蟲病原菌；光黑殼屬是一種植物內生菌[20]。

貯藏期內甜瓜果實中積累的特異性真菌包括單端孢菌屬（Trichothecium）、畢赤酵母屬（Pichia）、葉黑粉菌屬（Entyloma）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、節擔菌屬（Wallemia）、Gibellulopsis、維什尼亞科齊馬菌屬（Vishniacozyma）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、帚枝霉屬（Sarocladium）。單端孢屬、青霉屬、曲霉屬是甜瓜采后致腐的主要病原菌；葉黑粉菌屬、節擔菌屬、帚枝霉屬和Gibellulopsis都是植物病原菌。葉黑粉菌屬能夠引起向日葵黑粉病[21]，節擔菌屬為煤污病病原菌[22]，帚枝霉屬可引起水稻鞘腐病[23]；畢赤酵母屬、維什尼亞科齊馬菌屬、線黑粉酵母屬為生防菌。綜上，隨著甜瓜果實的衰老，果實中積累的致病菌種類增多，同時也積累了大量的生防酵母菌，這為拮抗菌的分離提供了理論依據。

2.4 果實組織中真菌多樣性分析

Alpha多樣性是評價微生物群落豐度和多樣性的重要指標，包括Chao1指數和Shannon指數。Chao1指數反映樣品中菌群的豐富度，其數值越大表明樣品中菌群越豐富。Shannon指數反映樣品中菌群的多樣性，其數值越大表明樣品中菌群的多樣性越高[24]。

由圖8可知，貯藏0～21 d的甜瓜樣品果皮Chao1指數和Shannon指數均在貯藏7 d時升高，14 d時下降，貯藏21 d時再次升高；而果肉中Chao1指數呈上升趨勢，Shannon指數呈先上升后下降的趨勢。由此可知，貯藏期甜瓜果皮和果肉中真菌群落的豐度和多樣性存在差異，且果皮中的真菌群落豐度和多樣性都高于果肉。

圖8 甜瓜不同貯藏期果實組織中真菌Alpha多樣性Fig. 8 Fungal alpha diversity in melon fruit tissues at different storage periods

3 討 論

本研究以不同貯藏期的甜瓜為對象，利用高通量測序技術探究了甜瓜貯藏期果皮和果肉中真菌的群落結構組成和相對豐度的變化趨勢，測序數據經過去噪、質控處理后，24 個樣品共得到1 638 150 條高質量序列片段，平均長度為230 bp，同時共得到570 個ASV，共鑒定出真菌3 個門、23 個綱、54 個目、106 個科、123 個屬。ASV注釋結果表明，甜瓜貯藏期果皮和果肉24 個樣品中，子囊菌門和擔子菌門是門水平的優勢菌群；在目水平，果皮中優勢菌群為散囊菌目，而果肉中格孢腔菌目和銀耳目占優勢；在屬水平，果皮中優勢菌群從維什尼亞科齊馬菌屬、Papiliotrema和綠僵菌屬（貯藏0 d）變為曲霉屬、單端孢屬和青霉屬（貯藏21 d），果肉中的優勢菌群也隨著貯藏期的延長而改變，貯藏21 d時優勢菌群為維什尼亞科齊馬菌屬、單端孢屬和畢赤酵母屬。由此可知，貯藏期甜瓜果實組織中真菌群落的豐度和多樣性存在差異，引起貯藏期甜瓜品質劣變的真菌包括曲霉屬、單端孢屬、青霉屬、鏈格孢菌屬、鐮刀菌屬等，本研究結果與使用傳統方法對甜瓜果實進行研究的結果相似，如利用純培養方法也得到了相同的純培養物[25-26]。

甜瓜目前面臨的主要保鮮問題仍是衰老引起的果實品質劣變和微生物大量滋生繁殖導致的腐敗。隨著貯藏期的延長，甜瓜果實衰老逐漸加重，導致果實生理失調嚴重、抗性降低，同時也對果實中微生物群落的變化和動態平衡產生極大的影響。本研究選取不同貯藏期甜瓜果皮和果肉組織，通過高通量測序分析其真菌群落結構的變化，研究發現從新鮮甜瓜果皮中檢測出的優勢菌群有維什尼亞科齊馬菌屬、鏈格孢屬、綠僵菌屬，此外還檢測到曲霉屬和單端孢菌屬，但相對豐度較低；而果肉中則以鏈格孢屬、Papiliotrema和附球菌屬為主。鏈格孢菌屬、曲霉屬和單端孢菌屬是甜瓜采后常見致病菌，由此推斷，病原菌在甜瓜果實生長發育過程中已潛伏侵染，這與馬文平等[27]的研究結果一致，即在甜瓜生長發育過程中，從開花至成熟期均可受到鏈格孢的侵染，且侵染率較高，粉紅單端孢主要侵染成熟的甜瓜果實。這一結果提示甜瓜采后黑斑病和粉霉病的發生也有可能源于生長期間即在果實中潛伏的鏈格孢屬和單端孢屬，因此生產中在采前進行對采后病菌的防治可能會得到較好的效果，并有效保持采后果實品質。

隨著貯藏時間的延長，果皮和果肉組織中的優勢菌群都發生了顯著變化，貯藏中后期（14～21 d）果皮中維什尼亞科齊馬菌屬、畢赤酵母屬和Papiliotrema的相對豐度為0，說明該物種幾乎消失；而果肉中維什尼亞科齊馬菌屬的相對豐度在貯藏期先升高后降低，與其在菜心切口處的變化趨勢一致[13]，說明貯藏時間可影響其生長繁殖。果實組織中主要致病菌鏈格孢屬、單端孢屬、青霉屬、曲霉屬的相對豐度隨酵母菌相對豐度的變化呈先下降后升高的趨勢，最終大量生長繁殖并占據優勢，導致果實腐爛。通常認為維什尼亞科齊馬菌屬、Papiliotrema和畢赤酵母屬均為有益菌，研究表明維什尼亞科齊馬菌屬能夠有效抑制貯藏期擴展青霉、Botrytis cinerea和枝孢霉對有機梨的侵染[28-29]；P. flavescen對小麥苗期莖基腐病有一定防治效果[30]；畢赤酵母可以有效延緩櫻桃番茄黑斑病的發展[31]。由貯藏期果實組織中優勢菌群的改變可以推斷，酵母菌在貯藏前期可能通過營養競爭抑制了鏈格孢和單端孢屬等致病菌的生長，而后期由于大量消亡其競爭能力減弱，由于缺少了拮抗菌的防御，最終致使致病菌迅速生長繁殖并占據優勢，從而致使果實腐爛嚴重。

本研究貯藏后期果實組織中真菌豐度整體下降，這與獼猴桃軟腐病發病過程中內生真菌多樣性的研究結果[32]一致。出現這一結果可能是由于隨著貯藏時間的延長果實成熟衰老嚴重，果實中的營養流失較多，無法滿足微生物的正常營養代謝需求，導致大量微生物死亡，且病原微生物侵染果實后進行代謝，釋放出有毒的代謝產物，使得微生物不能正常生長繁殖；同時，果實在受到病原物侵染后釋放出抑制微生物生長的揮發性物質，最終使得果實在貯藏后期真菌群落不斷減少。

隨著貯藏時間的延長及果實的成熟與衰老，甜瓜采后病害逐漸加重，其生理變化導致營養流失，同時對果實中微生物群落的種類及動態平衡均有很大影響，促使果實抗性降低，導致病害發生。本實驗研究果實內微生物群落的動態變化和相互關系，可為甜瓜采后病害的發生規律、病害防治以及拮抗菌的篩選提供理論依據。