基于SSR分子標記的154份桃品種遺傳多樣性分析

殷紀偉 韓貝貝 馬瑩雪 武星廷 徐振江 姜建福 陳昌文 韓瑞璽

摘要：利用簡單重復序列（SSR）分子標記對桃種質資源的遺傳多樣性和群體結構進行分析，構建桃品種的分子數據庫，為桃品種的鑒定提供技術依據。利用10個SSR標記對154份桃品種進行指紋采集，通過聚類分析和群體結構分析研究其遺傳多樣性。結果表明，10對SSR引物共檢測出140個等位變異，變異范圍為8～27；共獲得304個基因型，變化范圍為17～59；引物多態性信息含量（PIC）變化范圍為0.510 9～0.824 2，申請品種保護和登記的品種遺傳多樣性較已知品種低。根據Neis遺傳距離進行非加權組平均法（UPGMA）聚類分析，供試品種可劃分為5個大類，各品種間的遺傳距離在0.029 3～1.000 0之間，其中2對品種未區分開。對供試品種進行群體結構分析，發現可以劃分為4個亞群，大部分材料的親緣關系比較單一。方差分析結果表明，10%的遺傳變異來自群體間，72%的遺傳變異來自群體內部，群體內的變異大于群體間。154份桃品種的遺傳多樣性水平適中，群體間的遺傳分化程度處于中等水平，同一育種單位的品種遺傳距離較近。研究結果可為不同類型桃育種創新、分子指紋數據庫的構建及品種鑒定提供參考依據。

關鍵詞：桃；SSR；遺傳多樣性；群體結構

中圖分類號：S662.102文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）16-0018-08

收稿日期：2022-10-11

基金項目：物種品種資源保護項目（編號：h20210472）；農產品質量安全標準體系建設（編號：2130109）。

作者簡介：殷紀偉（1998—），男，安徽宣城人，碩士研究生，從事分子生物學研究。E-mail：jiwyin@163.com。

通信作者：韓瑞璽，博士，高級農藝師，主要研究方向為植物新品種保護和DNA分子技術應用。E-mail：wudifeixue007@163.com。

桃（Prunus persica L.）是薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）的一種重要落葉果樹，是全球第三大重要的溫帶水果^［1］。中國擁有世界上最長的桃栽培歷史^［2］，種質資源比較豐富，其種植面積、產量均居世界首位^［3］。利用DNA分子標記技術對桃進行品種鑒定及種質資源的遺傳多樣性研究，對我國桃種質資源利用和育種創新具有重大意義。隨著基因組學的不斷發展，基于DNA的遺傳標記在植物分子研究中被廣泛應用，簡單重復序列（SSR）分子標記技術由于具有可重復性好、共顯性遺傳等優點，在DNA指紋分析和遺傳多樣性分析方面有重要的應用價值^［4］。目前，SSR分子標記技術已經被用于鑒定葡萄^［5］、柑橘^［6］、蘋果^［7］、獼猴桃^［8］、櫻桃^［9］等果樹品種或種質資源。近年來SSR分子標記技術被廣泛應用于各項研究中，如品種鑒定、遺傳圖譜構建、遺傳多樣性研究等。Cheng等利用7對SSR引物構建了32個桃地方品種的指紋圖譜，并評估了品種的遺傳多樣性和親緣關系^［10］；葛志剛等利用SSR標記對22個蟠桃品種及另外9種類型桃品種的遺傳多樣性的分析結果顯示，蟠桃的遺傳多樣性較高^［11］；Xie等采用34個SSR標記分析了浙江地區的94份桃種質資源的多樣性，發現引進品種的種質多樣性高于地方品種^［12］；李雄偉等利用16個SSR標記對國內外669份桃的遺傳多樣性進行測試并構建了相應的分子指紋圖譜^［13］；凌士鵬等對不同來源的桃品種進行SSR分析，發現聚類結果和品種的地理分布之間存在一定的相關性，相同地理來源的品種較為集中地聚在一起^［14］；根據桃果實性狀，可以將桃劃分為多個類型，魏姍姍等開發了18個SSR標記對桃果實的形狀進行分析，發現扁球形桃類群的遺傳多樣性較球形豐富，對桃有無毛性狀的分析結果表明，有毛類群的遺傳多樣性和基因雜合度高于無毛類群^［15］；劉偉等以60份山東省地方桃種質資源為研究材料，利用SSR標記構建了分子身份證，相關研究可為山東省地方桃品種資源鑒定和種質資源利用與保護奠定基礎^［16］。通過對桃種質資源的遺傳多樣性進行評價，可為今后桃種質資源創新和利用提供參考依據。但是，目前對于新育成的桃品種，尚未有人分析并及時構建DNA分子數據庫。本研究首次以近5年申請品種權保護的桃品種為材料，并且通過果實類型進行聚類分析，前人在此方面的研究報道較少。隨著國內桃新品種權申請量逐年增加，通過比較申請品種權保護品種和已知品種間的遺傳多樣性，不同育種單位和地區育種水平的相關研究較少。本研究構建了154份桃品種的DNA指紋數據庫，并對申請品種保護的品種和已知品種間進行遺傳多樣性比較分析，可為加快我國桃種質資源的創新利用和桃品種權保護提供參考，為桃品種鑒定和輔助桃新品種特異性、一致性和穩定性測試（簡稱DUS測試）提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗于2022年在農業農村部科技發展中心植物新品種測試中心進行，試驗材料包括申請新品種權保護的品種63份、登記品種13份、已知品種78份，共154份，由農業農村部植物新品種測試中心提供，供試品種的基本信息見表1。

DNA聚合酶、PCR Buffer等購于南京諾維贊生物科技股份有限公司；甲酰胺、LIZ500購于ABI公司。主要設備儀器：Nano Drop 1000微量分光光度儀、ETC-811定性PCR儀、Applied Biosystems^TM3730基因分析儀、組織研磨儀等。

1.2 SSR引物

本研究中用于檢測的SSR引物選自《桃品種鑒定? SSR分子標記法》中規定的10對核心引物（表2），普通引物、熒光引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根據等位變異大小在熒光引物5′端添加6-羧基熒光素（FAM）、六氯熒光素（HEX）、羧基四甲基羅丹明（TAMRA）熒光基團。

1.3 DNA提取和PCR擴增

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法^［17］提取新鮮葉片的基因組DNA，并用2%瓊脂糖凝膠電泳進行DNA的完整性檢測，用紫外分光光度計Nano drop1000測定DNA的質量和濃度，并將其稀釋至50 ng/μL，于-20 ℃保存。PCR擴增反應總體積為10 μL，包含1 μL 50 ng/μL DNA模板、1 μL 10×PCR Buffer、各 0.3 μL 10 μmol/L上下游引物、0.1 μL Taq DNA聚合酶、2.5 mmol/L dNTP，加 6.5 μL ddH₂O補足至10 μL。PCR 擴增參考《桃品種鑒定? SSR分子標記法》中的擴增程序，具體如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環；4 ℃保存20 min。

1.4 PCR產物檢測

分別吸取1.2 μL不同熒光標記擴增產物，混勻后加超純水稀釋100倍，從稀釋混合液中分別吸取1 μL加入96孔板中。每孔另外加入8.9 μL去離子甲酰胺、0.1 μL ABI GeneScan 500LIZ分子量內標，離心30 s后于94 ℃變性5 min，冷卻后上機檢測，具體操作步驟和流程參考儀器操作說明。

1.5 數據分析方法

用SSR Analyser （V1.2.6，http：//172.16.2.68：8080/ssr3/no/index）對電泳的原始數據進行處理。用Powermarker V3.25計算不同品種間的遺傳距離，并構建基于Neis遺傳距離的非加權組平均法（UPGMA）聚類圖。利用Ntsys 2.11進行遺傳相似度分析，用Structure 2.3.4軟件進行群體結構分析，假定群體數目（K值）為1～10并且逐一進行測試，每個K值重復估算20次，迭代次數5 000次，馬爾可夫鏈蒙特卡洛方法（Markov chain monte carlo，MCMC）值為50 000次。使用lnP（D）的平均值進行種群估計，并通過Structure Harvester程序估算最佳種群數量的K值，對群體間及群體內分子變異作方差檢驗（AMOVA），分析群體內、群體間的遺傳變異情況。

2 結果與分析

2.1 SSR標記多態性和遺傳多樣性分析

根據SSR標記的等位變異范圍，進行多重電泳組合，本研究將10對引物分為4組來提高電泳效率，圖1為品種SpringPrince的毛細管電泳結果。用SSR Analyser軟件處理毛細管電泳的原始數據，從表3可以看出，10對SSR引物在154份材料中共檢測出140個等位變異位點，變異范圍為8～27，平均值為14；共獲得304個基因型組合，變化范圍為 17～59個，平均值為30.4個。多態性信息含量能夠反映一個群體的遺傳變異程度，本研究中，PIC值的變化范圍為0.510 9～0.824 2，平均值為0.698 4，其中PIC值最高的標記是SSR125（0.824 2），最低的標記是SSR107（0.510 9），各標記的PIC值均高于0.5，說明該標準所選引物多態性較好，適用于桃品種的鑒定，能夠有效反映桃品種的遺傳多樣性信息。供試材料的基因多樣性變化范圍為0.530 8～0.839 6，平均值為0.728 2，表明供試材料的遺傳多樣性豐富，遺傳背景較為復雜。

154份桃品種中共包括63份申請保護品種、13份登記品種和78份已知品種，利用GenAlEx6.503對申請和登記的品種與已知品種進行群體遺傳多樣性分析（表4）。已知品種的等位基因數、有效等位基因數分別為12、4.534，Shannons信息指數（I）為1.762，期望雜合度（H_e）為0.752，均高于申請品種保護和登記品種，說明已知品種的群體遺傳多樣性比申請品種保護和登記的品種更豐富。

2.2 聚類分析

本研究通過計算各品種間的遺傳距離，用UPGMA法對154份桃品種進行聚類分析，發現該聚類結果和品種類型有一定的相關性（圖2）。154份桃種質被劃分為5個主要類群，其中類群Ⅰ全部為觀賞類桃品種，類群Ⅱ主要是蜜桃品種，類群Ⅲ主要為蟠桃品種，類群Ⅳ主要為黃桃品種，類群Ⅴ主要為油桃品種。觀賞類桃與可食用桃品種間的遺傳信息差異較大，單獨聚為一類。而其他幾個類群中存在品種類型相互交叉的現象，如油蟠桃品種在類群Ⅲ、類群Ⅴ中均有分布，類群Ⅱ中除了蜜桃品種外，還有些黃桃品種。在154份材料中，共有2對品種未區分開，分別是甘峪秋蜜（T101）和中油桃4號（T62），川中島（T102）和中油桃5號（T61），由于該標準選用的是SSR隨機標記，可能未覆蓋相應的等位變異差異區域，因此從分子水平上表現出相似性。除此之外，中蟠9號（T23）和中油蟠9號（T75）、中蟠19號（T26）和中蟠1號（T41）、中桃金霞（T71）和金霞（T78）的遺傳距離最小，均為0.029 3。進一步分析發現，同一育種單位的品種聚在一起，遺傳距離較近，如北京市林業果樹科學研究院選育的瑞蟠系列品種瑞蟠4號（T22）、瑞蟠21號（T40）和瑞蟠101號（T39），其中瑞蟠21號是由瑞蟠4號為父本雜交選育的極晚熟品種， 瑞蟠101號則是由瑞蟠21號為父本雜交選育的晚熟黃肉品種。此外遺傳距離較近的還有甘肅省農業科學院林果花卉研究所的隴系列品種隴金6號（T96）、隴紅蜜1號（T125）、隴蜜17號（T123）、隴蜜15號（T124）、隴蜜12號（T120）等，其中隴蜜15號和隴蜜12號都是由隴蜜9號為母本雜交選育而來。同一育種單位的品種由于遺傳背景相似而聚在一起，說明該聚類結果符合實際育種現狀。為了探討利用該分子數據庫在桃特異性、一致性、穩定性（DUS）測試中篩選近似品種的可行性，隨機選取6個申請品種與對應的近似品種進行分析。從表5、圖2可以看出，申請品種中油金夏（T43）、中油蜜玉（T44）、金京紅（T153）等對近似品種的選擇比較合理，二者的遺傳距離較近，但是中蟠7號（T18）、中蟠9號（T23）、中桃金飴（T84）在分子水平上有更加近似的品種。

2.3 群體結構分析

為了揭示154份桃品種的群體結構，基于貝葉斯的方法分析了不同類型桃品種的群體遺傳結構。結果表明，當K=4時，似然值最大，如圖3-A、圖3-B 所示。遺傳多樣性分析結果顯示，將154份桃品種劃分為4個亞群較為合適，分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ（圖3-C、圖4）。亞群Ⅰ共有23份材料，主要是蟠桃和蜜桃品種；亞群Ⅱ共有15份材料，主要為觀賞類桃品種；亞群Ⅲ有70份材料，大部分為油桃品種；亞群Ⅳ有46份材料，以蜜桃品種為主。從群體結構來看，大部分材料的親緣關系比較單一，還有部分材料的親緣關系比較復雜。分子變異方差分析（AMOVA）結果表明，90%的變異來自于個體間，個體間的遺傳變異大于群體間的遺傳變異，同時群體內的遺傳變異遠高于群體間的遺傳變異（表6）。群體間遺傳分化的程度可以通過遺傳分化指數來判定^［18］，當0≤F_st<0.05時，表示遺傳分化水平極低；當0.05≤F_st<0.15時，表明遺傳分化處于中等水平；當0.15≤F_st<0.25時，表示遺傳分化較大；當F_st≥0.25時，表示群體間有很大的遺傳分化。本研究中，F_st=0.099，表明該群體間遺傳分化程度中等。

3 討論

SSR分子標記技術具有較高的穩定性和準確性，已被廣泛應用于各類種質資源的鑒定和遺傳多樣性分析中。近年來，關于桃種質資源的SSR引物的研究也越來越多，Jouy等選出16對具有高多態性的標記用于品種鑒定和保護^［19］。關利平等從已發表的桃基因組SSR引物中篩選出10對核心引物用于指紋庫的構建^［20］。本研究所用10對引物的平均PIC值為0.698 4，多態性含量均大于0.5，高于葉宇蕓等研究中所用的20對SSR引物^［21］。在本研究中，10對引物等位基因平均值和有效等位基因數（N_a=11.05，N_e=4.168）均顯著高于凌士鵬等的研究結果^{［14，22-23］}，說明本研究選用的10個SSR標記多態性較為豐富，可用于桃品種的鑒定和遺傳多樣性分析。相較于李雄偉等構建的分子數據庫^［13］，本研究所用引物較少，但采用了精度更高的ABI 3730基因分析儀采集指紋，并用SSR Analyser軟件處理，更利于數據的整合和可視化。從本研究中的聚類分析結果來看，報春（T14）等觀賞桃類單獨聚在一起，說明觀賞桃與鮮食桃的遺傳差異較大，其起源可能存在較大差異，與周平等的研究結果^［24］相似。而油蟠類型的品種在前人研究中也很少提到，該聚類結果顯示，油蟠桃類品種在油桃、蟠桃群體中均有分布，說明油桃、蟠桃這2類群體間的雜交可以創制更多新種質。各亞群既有獨立進化，又有部分品種出現高度遺傳混合，亞群內品種間遺傳相似度較高，尤其是對于同一育種單位、同一地區的品種。因此，將不同類型、不同地域的桃品種間進行雜交育種，有利于桃種質資源的創新。AMONA分析結果顯示，群體間的遺傳變異小于群體內，與王淋等的研究結果^［3］一致，這種現象在核桃^［25］、油桐^［26］等木本植物中也有發現，這也與多年生木本植物的遺傳變異規律^［27-28］相符。

DNA指紋數據庫的構建在品種管理和品種保護方面具有重要的應用價值。本研究利用10個SSR標記構建了154份桃的DNA指紋數據庫，一方面可用于品種真實性的鑒定、品種管理和維權等，另一方面還可輔助DUS測試中近似品種的篩選。植物新品種保護條例規定，授權品種必須滿足特異性（distinctness）、一致性（uniformity）和穩定性（stability）的要求。近似品種選擇是否合理會直接影響測試品種特異性的審查結果，而申請者了解的品種有限，原則上近似品種應從世界范圍內的已知品種中選擇。通過采集申請品種和目前市場上已知品種的指紋信息，構建桃分子指紋庫，再利用SSR分子標記技術輔助篩選近似品種，結合桃已知品種表型數據庫，能夠進一步提高近似品種選擇的準確性，加快品種授權的速度，并且降低重復授權的風險。另外，還可利用DNA指紋數據庫的信息，對申請品種和已知品種進行聚類分析，根據品種間的遺傳距離對品種進行分類和區分，這種方法也能夠較好地輔助近似品種的選擇。目前，DNA指紋數據庫已被應用于梨^［29］、枇杷^［30］等果樹的近似品種的篩選和特異性判定中。

我國桃種質資源豐富，DNA分子標記技術較傳統表型分析具有較高的穩定性和準確性，被廣泛應用在桃種質資源鑒定和遺傳多樣性分析方面，但是采用的標記類型比較單一，后續可加強對桃品種研究方面新型分子標記的開發，如單核苷酸多態性（SNP）、表達序列標簽微衛星（EST-SSR）、多核苷酸多態性（MNP）等，同時建立桃品種的DNA指紋庫，利用分子標記構建品種特異性指紋，為桃品種鑒定和品種權保護服務。

4 結論

本研究利用10對SSR核心引物構建了154份桃品種的DNA指紋數據庫，能夠進行品種鑒定并輔助DUS測試中近似品種的篩選。分析申請品種與已知品種的遺傳多樣性和群體結構，發現已知品種的遺傳多樣性更加豐富，同一育種單位的品種遺傳距離較近，群體間的遺傳分化程度呈中等水平，可為我國桃種質資源的創新提供一定參考價值。

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