小麥白粉菌BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因的克隆及在調控無性繁殖中的作用

曾凡松 翟亞美 袁斌 龔雙軍 向禮波 薛敏峰 闕亞偉 史文琦 鄭磊 張強 楊立軍 喻大昭

摘要：為了明晰小麥白粉菌BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因的序列特點及它們在白粉菌產孢過程中的表達動態，為解析velvet蛋白在調控白粉菌無性繁殖中的作用提供理論依據，采用基于RNA-seq數據的克隆測序技術獲得BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因的CDS序列，用生物信息學方法分析它們編碼的蛋白質序列特征和空間結構，用RT-qPCR監測它們在白粉菌分生孢子形成時期的表達模式。結果表明，BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因的ORF長度依次為1470、1341、1143 bp，分別編碼489、446、380個氨基酸，分子量在54.0～48.0 ku，屬于堿性、親水性、熱不穩定蛋白質，均含有核定位信號，不含跨膜螺旋和信號肽，空間結構呈現出近球形。BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA分別與其他真菌來源的VosA、VelB、BrlA蛋白具有同源性，且與白粉菌同源蛋白具有更近的親緣關系，氨基酸序列在白粉菌自然群體中均高度保守。BgtVosA、BgtVelB屬于典型的velvet蛋白家族成員，可能通過分子互作形成復合物，但其結構與構巢曲霉同源蛋白復合物存在明顯差異。在小麥白粉菌無性繁殖階段，BgtVosA、BgtVelB基因均顯著上調（P<0.01），BgtBrlA表達水平沒有顯著變化（P>0.05）。 DNA結合區域分析推測BgtVosA-BgtVelB復合物不能靶向BgtBrlA啟動子，調控其BgtBrlA的表達。BgtVosA、BgtVelB基因在調控白粉菌無性生殖中起重要作用。

關鍵詞：小麥白粉菌；Velvet蛋白；BrlA基因；無性產孢；表達分析

中圖分類號：S435.121.4+6文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）16-0026-09

收稿日期：2022-11-23

基金項目：國家小麥產業技術體系建設專項（編號：CARS-3-1-2）。

作者簡介：曾凡松（1980—），男，湖北宜昌人，博士，副研究員，主要從事小麥病害防控研究。E-mail：zengfansong2005@126.com。

通信作者：楊立軍，博士，研究員，主要從事小麥病害防控研究。E-mail：Yanglijun1993@163.com。

小麥白粉病是由禾谷類白粉菌小麥專化型（Blumeria graminis f. sp. tritici，Bgt）引起的重要病害。白粉病降低小麥的產量和品質，在我國常年發生面積約700萬hm²，對小麥生產造成了嚴重威脅^［1］。禾谷類白粉菌只能在活的寄主上生活，可通過有性生殖和無性生殖繁衍后代，其中有性生殖每年只發生1次；而無性生殖可在1個生長季節發生很多次，產生的分生孢子不僅是無性世代的繁殖體，而且是病害流行的主要侵染源^［2］。分生孢子落在小麥葉片上1 d后侵入寄主表皮細胞，2 d后形成成熟的吸器，從寄主細胞中不斷汲取營養物質，3 d后形成大量的營養菌絲，4 d后進入無性生殖階段，菌絲上開始形成足細胞，5 d后開始形成分生孢子梗，不斷分化出分生孢子，在風力的作用下擴散傳播，導致病害迅速擴散^［3］。解析白粉菌產孢相關基因的功能，有助于揭示白粉菌無性繁殖的分子機制，為白粉病的流行和防控提供理論依據。關于絲狀真菌產孢遺傳機制的研究始于對構巢曲霉（Aspergillus nidulans）的研究。BrlA基因編碼1個C₂H₂—鋅指轉錄因子，它能夠激活AbaA、WetA基因的表達，這3個基因組成的BrlA-AbaA-WetA途徑在構巢曲霉無性產孢過程中起核心調控作用^［4］。Velvet家族蛋白是絲狀真菌特有的蛋白，它們具有Velvet結構域，參與真菌無性、有性發育過程的調控和次生代謝產物的合成，其成員包括VosA（viability of spores A）、VeA （velvet）、VelB（velvet like B）、VelC（velvet like C）、VelD（velvet like D）^［5-6］。Velvet蛋白可在BrlA-AbaA-WetA途徑下游起調控作用，其中VosA能夠與VelB形成復合物，結合到BrlA的啟動子區域，反饋抑制BrlA的表達，從而影響分生孢子的數量和成熟^［7-8］。VosA、VelB能夠直接或間接地調節異源G蛋白信號轉導途徑和促分裂原蛋白激酶信號途徑相關基因，影響真菌無性生殖、初生代謝和次生代謝^［9-10］。國內外關于白粉菌velvet蛋白的研究還未見報道。從已發表的小麥白粉菌基因組中找到了3個含有velvet結構域的蛋白，NCBI登錄號分別為：EPQ65573.1、EPQ63747.1、EPQ67732.1^［11］。

白粉菌無法在人工培養基上生長，只能在活的寄主上存活，因而很難對其進行遺傳轉化，基因功能研究進展速度偏慢。本研究對小麥白粉菌2個velvet蛋白BgtVosA、BgtVelB以及調控因子BgtBrlA進行了氨基酸序列分析、功能注釋、結構預測和變異位點檢測，對這些基因在小麥白粉菌分生孢子形成過程中的表達譜進行了監測，旨在為揭示白粉菌無性生殖調控的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的小麥白粉菌菌株Bgt21-2來自江蘇省鹽城市^［12］。培養白粉菌的小麥材料為感病品種Chancellor。種植小麥的土壤為含有水溶肥（山東金正大生態工程集團股份有限公司）的營養土，白粉菌的接種、擴繁參照Yang等的方法^［3］。菌株在Chancellor離體葉段上進行擴繁，每12 d擴繁1次。

1.2 基因克隆

以構巢曲霉AnVosA、AnVelB（NCBI登錄號分別為ABI51618.1、ABQ17967.1）和煙曲霉（A. fumigatus）AfBrlA蛋白質序列（NCBI登錄號 XP_753026.1）為查詢序列，在已發表的參考菌株 96224蛋白質數據庫^［11］中進行BLASTp比對，獲得BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA的候選蛋白。根據菌株Bgt21-2分生孢子形成階段轉錄組測序的reads比對參考基因組后的數據^［13］，獲取覆蓋3個基因ORF的cDNA序列。采用Primer Premier 6.0軟件從ORF上游和下游設計引物，送武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

采用醋酸纖維素包埋法^［14］將接種5 d后的小麥葉片表面的菌絲體剝離，液氮速凍后保存備用。采用Trizol試劑盒和PrimeScript^TM反轉錄試劑盒（大連寶生物科技有限公司）提取總RNA和合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增。25 μL反應體系包含1 μL cDNA，2.5 μL 10×ExTaq PCR buffer，1.25 μL 50 mmol/L Mg²⁺，0.5 μL 10 mmol/L dNTPs，上下游引物各0.5? μL，0.25 μL ExTaq酶（大連寶生物科技有限公司），補ddH₂O至25 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，40個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物經凝膠回收后連接到T-vector pMD^TM19，送武漢天一輝遠生物科技有限公司測序。為檢測目的基因DNA序列變異，采用CTAB法提取菌株分生孢子樣品中的基因組DNA^［15］。用相同的方法進行 PCR 擴增、產物連接和序列測定。

1.3 基因序列特征分析

采用DNAMAN v6.0軟件和NCBI ORF finder工具對基因編碼區進行序列分析。采用ExPASy-ProtParam和ExPASy-Scale工具分析蛋白質氨基酸的理化性質，包括分子量、理論等電點、脂肪指數和親水性指數^［16］。采用SinalP v5.0、NLStradamus 和TMHMM v2.0等軟件預測蛋白質的信號肽、核定位信號和跨膜區^［17-19］。采用MEME Suite v5.5.0 進行motif分析。采用I-TASSER在線工具計算 B-因子（B-factor），預測蛋白質二級結構和三級結構^［20］。采用ZDOCK Server（https：//zdock.umassmed.edu/）進行蛋白之間的分子對接^［21］。

1.4 系統發育樹的構建

將目標蛋白質序列在NCBI nr蛋白質數據庫中進行BLASTp比對，搜索并下載同源序列。采用MEGA v6.0軟件和鄰接法（Neighbor-Joining method）進行序列比對和系統發育樹構建^［22］，并進行bootstrap 1 000次重復檢驗。

1.5 表達譜分析

在接種菌株Bgt21-2后3 dpi（菌絲生長期）、4 dpi （足細胞發育期）和5 dpi（分生孢子梗發育期），取感染的小麥離體葉段進行臺盼藍染色，顯微觀察和拍照。采用醋酸纖維素包埋法收集3個時間點的葉表面菌體，每個時間點樣品重復3次。總RNA的提取和cDNA合成方法同“1.2”節。根據“1.2”節方法克隆的目標基因的ORF序列，設計引物送武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。PCR反應體系采用2×Q3 SYBR qPCR Master Mix-Universal Kit （吐露港生物科技有限公司）配制。PCR反應參照Hacquard等的方法^［14］執行。PCR反應在ABI 7500 real-time PCR儀上完成，每個反應重復3次。采用2^-ΔΔC_T方法和SPSS v26.0軟件計算基因相對表達量和統計分析^［23］。

2 結果與分析

2.1 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因的克隆

通過BLASTp比對從菌株96224基因組中獲得了候選BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白序列，NCBI登錄號分別為EPQ63747.1、EPQ65573.1、EPQ63980.1。根據菌株Bgt21-2轉錄組reads覆蓋參考基因組區段，從非編碼區設計了特異性PCR引物對（表1）。 以5dpi菌體樣品總RNA反轉錄生成的cDNA為模板進行PCR擴增，分別獲得了覆蓋BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA等3個基因完整ORF區域的cDNA序列，包含完整的ORF區域長度，分別為1 470、1 341、1 143 bp，編碼489、446、380個氨基酸（圖1），其中BgtVosA、BgtVelB各含有3、4個內含子，BgtBrlA不含內含子（圖2）。

2.2 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白的理化性質、序列特征和功能注釋

BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA這3個基因編碼的蛋白質的分子量分別為54.6、47.8、43.7 ku，等電點為7.2～8.0，均屬于偏堿性蛋白質。這些蛋白親水指數（GRAVY）為-0.93～-0.50，脂肪指數為42.0～59.0，提示它們都是親水性、熱不穩定蛋白。3個蛋白均不含跨膜區和信號肽（表2）。BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白的核定位信號分別位于第191～204位氨基酸（RVRKEQNRTLIRKR）、第431～437位氨基酸（RKDAAKG）、第325～358位氨基酸（DKGGPDRPNRRTQYFKDAGKIIKAMSRRGGKLFS）。BgtVosA、BgtVelB具有典型的velvet結構域（Pfam數據庫：PF11754.11；Interpro數據庫：IPR037525），屬于velvet蛋白。BgtBrlA蛋白是1個C₂H₂型鋅指蛋白（Pfam數據庫：PF02200.19；PF13465.9；Interpro數據庫：IPR013087），具有結合DNA和調控轉錄的功能，推測為1個轉錄因子（圖2）。

2.3 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白的系統進化分析

選擇同源蛋白質序列分別構建BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA的系統進化樹（圖3）。BgtVosA與來自白粉菌的同源蛋白能聚到1個較大的分支中。小麥白粉菌、小黑麥白粉菌、大麥白粉菌等禾谷類白粉菌的同源蛋白之間的親緣關系最近，處在同1個小分支中。它們與來自擬蘭芥白粉菌等雙子葉植物上白粉菌的同源蛋白也具有較近的親緣關系。BgtVelB、BgtBrlA呈現出類似的結果，但不同的是，來自白粉菌的同源蛋白與來自腐生生活真菌的同源蛋白分別處在彼此獨立的分支中，表現出更遠的進化距離。

同源蛋白的模體分析表明，從BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA的同源蛋白中分別找到了10、6、5個保守的模體。23個VosA同源蛋白均含有Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4，它們的注釋為velvet 蛋白結構域。在25個VelB同源蛋白序列中發現了4個保守的模體，分別為Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4，它們均為velvet蛋白結構域。18個BrlA同源蛋白中高度保守的模體包括Motif 1、Motif 2、Motif 4、Motif 5，其中Motif 1、Motif 2為鋅指結構域，Motif 5為核定位信號序列（圖3）。

2.4 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白二級和三級結構分析

BgtVosA的二級結構含有4個α螺旋和9個延伸鏈，分布在氨基酸序列的N端，84.5%的序列為無規則卷曲（圖4-A），B-因子在N端富含二級結構的區域呈現頻繁的起伏變化，說明BgtVosA該區域在空間上具有明顯的剛性和柔性相結合的特性。在BgtVelB序列中只發現了1個α螺旋和6個延伸鏈，超過90%的序列為無規則卷曲（圖4-B），在C端第350～400位氨基酸區域，B因子具有明顯的增加，說明該區域有利于蛋白折疊時塑造更加靈活的空間結構。BgtBrlA蛋白含有相對較多的α螺旋（占13.2%），而延伸鏈只占1.6%。

基于二級結構，BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白的三級結構均呈現出近球形，屬于球形蛋白（圖5）。BgtVosA、BgtVelB分別與PDB數據庫中來自構巢曲霉的AnVosA-AnVelB 復合物（PDB登錄號：4n6r）的A鏈（VosA，4n6r.1.A）、B 鏈（VelB，4n6r.1.B）能夠較好地匹配，校正的Z-score分別達到9.07、8.60（表3）。其中BgtVosA、BgtVelB與A鏈和B鏈氨基酸序列的一致性分別為54.9%、50.3%，提示BgtVosA與BgtVelB可能存在類似的互作。進一步通過ZDOCKER在線服務器對BgtVosA、BgtVelB進行分子對接，結果發現它們可以在空間上接近，形成1個復合物，互作的區域位于BgtVosA蛋白靠近N端的延伸鏈區、BgtVelB蛋白靠近C端的延伸鏈，與構巢曲霉的復合物存在明顯差異（圖5-D）。

2.5 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因在小麥白粉菌自然群體中的變異

采用PCR產物測序的方法，對來自江蘇等省份白粉菌的BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因序列進行了測定，序列比對結果表明，在BgtVosA基因ORF中，有3個菌株的第1 234位堿基發生了點突變，導致第412位氨基酸有甘氨酸（G）突變為絲氨酸（S），屬于非錯義突變。突變菌株有2個來自甘肅省，1個來自河北省（表4）。突變位點不在velvet功能結構域內。在BgtVelB、BgtBrlA基因序列中未檢測到突變。

2.6 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因在小麥白粉菌無性產孢階段的表達譜分析

基因表達量檢測結果表明，與葉表面菌絲生長階段（3 dpi）相比，BgtVosA、BgtVelB在4、5 dpi均呈現顯著上調表達（P<0.01），其中BgtVosA持續上調表達，BgtVelB在產孢階段維持較高的表達水平。BgtBrlA基因水平在整個過程中沒有表現出顯著的差異（圖6）。這些結果說明，BgtVosA、BgtVelB可能在白粉菌無性生殖過程中起重要調控作用，BgtBrlA可能起基礎作用。根據Ahmed等的報道，構巢曲霉AnVosA-AnVelB復合物能夠特異性地結合到BrlA基因啟動子區域的CCGCGG的基序^［8，10］。采用DNAMAN軟件在BgtBrlA 5′非翻譯區搜索2個基序，結果未發現相關DNA序列，作者推測BgtVosA-BgtVelB復合物可能不是通過類似的方式調控BgtBrlA的基因表達。

3 討論

Velvet蛋白普遍存在于植物病原真菌中，例如玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、蘋果黑腐皮殼菌（Valsa mali）、稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）^［24-26］。它們均含有同源的velvet結構域序列，與其他已知蛋白缺乏相似性，這些序列具有DNA結合能力^［27］。在本研究中，小麥白粉菌BgtVosA、BgtVelB的序列特征、功能模體分析表明，它們均含velvet結構域， 說明它們能夠與特定DNA結合。而且，它們具有核定位信號，沒有跨膜螺旋和信號肽，提示可能在細胞核中發揮作用，調控其他基因的表達。對構巢曲霉AnVosA、AnVelB蛋白的靶向基因啟動子序列分析結果表明，它們具有十分相似的DNA結合序列（5′-CCXTGG-3′、 5′-CCXXGG-3′），靶向包括BrlA在內的166個參與無性繁殖調控的基因^［10］。而且，AnVosA-AnVelB復合物能夠抑制AnBrlA的表達，阻止構巢曲霉無性生殖的開始^［4］。BgtVosA、BgtVelB在氨基酸序列和空間結構上均分別與AnVosA、AnVelB蛋白存在顯著的相似性，經預測能夠互作形成復合物，提示它們可能靶向相似的基因，例如AnBrlA。但是，BgtVosA-BgtVelB復合物在空間結構上與AnVosA-AnVelB復合物存在明顯差異^［8］，而且在BgtBrlA基因啟動子區域并未找到類似的序列，BgtBrlA基因也不隨BgtVosA、BgtVelB基因的變化而變化，推測BgtVosA-BgtVelB復合物不調控BgtBrlA的表達。AnVosA-AnVelB復合物還能夠靶向構巢曲霉vidD、McrA等生長發育相關基因的啟動子并調控它們的表達^［28-29］。對BgtVosA、BgtVelB及其復合物開展蛋白表達、空間結構、與DNA互作分析將有助于發現它們調控的基因。

系統進化分析表明，BgtVosA、BgtVelB與其他真菌的同源蛋白具有保守的基序，可能具有相對保守的功能。BgtVosA的序列在不同白粉菌菌株中是高度保守的，在velvet結構域沒有發現突變，BgtVelB的序列則完全一致。而且，BgtVosA、BgtVelB在小麥白粉菌分生孢子形成過程中顯著上調。上述結果說明，BgtVosA、BgtVelB可能在白粉菌的無性生殖調控中起重要作用，在白粉菌進化過程中一直得以保留。Velvet蛋白家族成員可通過自身形成二聚體，彼此形成二聚體或者與其他非velvet蛋白（如LeaA）形成復合物，通過反饋抑制參與曲霉無性生殖的調控^［4］。然而，BgtVosA、BgtVelB的空間結構主要以無規則卷曲為主，部分區域B-因子數值較高，它們的互作模型具有較強的可縮性，可形成不同結構的復合物，導致它們參與的調控網絡可能與構巢曲霉等真菌存在差異。下一步研究將對3個基因開展沉默和表型分析、轉錄組測序和蛋白-DNA互作等研究，有望進一步解析它們的調控網絡。

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