不同葉片病害癥狀桃Lhcb基因的克隆與表達分析

張子萌 楊麗娟 盧美光 李世訪

摘要：以我國健康山毛桃和不同癥狀的油桃葉片為試驗材料，基于轉錄組測序數據，通過基因克隆獲得編碼捕光葉綠素a/b結合蛋白的Lhcb基因全長序列，并進行生物信息學分析，以期揭示不同桃品種Lhcb基因序列差異及其表達與功能，豐富Lhcb基因的序列信息，探究Lhcb基因表達與不同葉片病害癥狀間的關系。克隆獲得山毛桃、無癥狀及花葉癥狀油桃的Lhcb基因全長序列，分別命名為Lhcb-Pd1、Lhcb-Ppn1和Lhcb-Ppn3，全長均為1 925 bp，與美國國家生物技術信息中心（NCBI）網站上登錄的桃Lhcb-Pp1基因（1 912 bp）相比，在1 593 nt處多出10個堿基。全長包括1個804 bp（編碼267個氨基酸）的開放閱讀框、CAAT-signal和TATA box等作用元件。遺傳進化分析結果表明，獲得的3個目的基因序列與李屬植物的基因序列聚為1組。蛋白質分析結果表明，桃Lhcb蛋白的相對分子量為 28 332.17 u，理論等電點為5.30，是親水性蛋白；其二級結構主要由53% α-螺旋、33%無規卷曲和24%跨膜螺旋組成，無β-折疊結構。對無癥狀及花葉癥狀油桃樣品中Lhcb基因表達差異進行分析，通過半定量RT-PCR和RT-qPCR，結果表明，與無癥狀樣品相比，花葉油桃中Lhcb轉錄本的轉錄水平較低，Lhcb基因的相對表達量顯著下調。

關鍵詞：桃；Lhcb基因；基因克隆；基因表達；蛋白分析

中圖分類號：S436.621.1文獻標志碼：A

文章編號：1002-S662.11302（2023）11-0035-08

收稿日期：2022-11-01

基金項目：國家農業產業技術體系建設專項（編號：CARS-30-3-01）。

作者簡介：張子萌（1998—），女，河北保定人，碩士研究生，主要從事果樹病毒學研究。E-mail：zimeng980809@163.com。

通信作者：盧美光，博士，研究員，主要從事果樹病毒學研究。E-mail：mglu@ippcaas.cn。

桃樹是我國非常重要的落葉核果類果樹，屬于薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus），在世界范圍內被普遍引種、栽培。山毛桃（Prunus davidiana Franch）耐寒、耐旱且具有發達的根系，是黃土丘陵和北方實質山區自然分布的樹種。油桃（Prunus persica cv. nectarina）是桃的變種，由于其采摘食用便利，商品性強，經濟效益高^［1］，故其在桃產業中所占比重逐年增大。與薔薇科其余木本植物（如李、櫻桃）相比，桃的基因組較小（230 Mbp），且童期僅為2～3年，因此桃可作為薔薇科植物研究中的模式基因組物種^［2］。

捕光葉綠素a/b結合蛋白在高等植物的光合作用中發揮著重要功能，其與光合反應體系中的有機色素分子連接形成復合體，將光能信號迅速傳遞到光系統Ⅰ（PSⅠ）、光系統Ⅱ（PS Ⅱ）的反應中心，推動光合反應的進行^［3］。捕光葉綠素a/b結合蛋白復合體在PSⅠ和PSⅡ中均存在，PS Ⅱ-LHCⅡ［the light-harvesting chlorophyll a/b-binding proteins （LHC Ⅱ） associated with photosystem Ⅱ （PS Ⅱ）］主要包括1個三聚體和3個單體蛋白，三聚體分別由Lhcb1、Lhcb2和Lhcb3基因編碼，3個單體蛋白則分別由 Lhcb4（CP29）、Lhcb5（CP24）和Lhcb6（CP26）基因編碼^［4］。目前，已有許多植物的Lhcb基因被克隆，如豌豆^［5］、矮牽牛^［6］、擬南芥^［7］、番茄^［8］、小麥^［9］、花椰菜^［10］、毛竹^［11］、長白松^［12］等。據報道，捕光葉綠素a/b結合蛋白也參與了植物抗逆、環境適應性等方面的調節。例如，Zhang等在研究2種生態型東南景天Lhcb2基因在鎘、鋅脅迫下的表達變化時發現，鎘、鋅脅迫處理能夠提高轉基因煙草中該基因的表達量^［13］。Petit等對殺菌劑脅迫后葡萄光合作用相關基因的表達情況進行研究，發現光合作用的降低伴隨著PS Ⅱ的psbP1（PsbP subunit of photosystem Ⅱ）基因、PSⅠ的cab基因［chlorophyll a/b-binding （Cab） proteins］的抑制表達，使得光合作用受到影響，但沒有觸發任何植物防御反應^［14］。

本研究基于大田溫室中具有不同病害癥狀的油桃葉片（無癥狀和花葉）樣品的sRNA和轉錄組測序數據，篩選獲得桃中與光合作用密切相關的Lhcb基因。雖然目前在NCBI中已登錄1條桃（Prunus persica cv. Stark Earlilo）Lhcb基因（Lhcb-Pp1）全序列，但是未見對其相關序列和功能研究的報道。因此，本研究以Lhcb-Pp1基因為模板，分別設計5′、3′端和特異性引物，利用RT-PCR技術擴增我國山毛桃與油桃中不同表型葉片的Lhcb基因序列；利用BioEdit、MEGA 7.0、Phyre2、SWISS MODEL及ExPASy-ProtParam等軟件/在線工具對獲得的基因序列及其編碼的蛋白質結構進行分析；利用半定量RT-PCR、RT-qPCR技術檢測具有不同病害癥狀的油桃樣品中Lhcb基因的表達量差異。研究結果能解析不同桃品種相關Lhcb基因的序列差異及油桃Lhcb基因與花葉癥狀的相關性，從而為植物病害防治研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山毛桃種子于2021年3月份購自浙江杭州，于4 ℃黑暗冷藏至少2個月后進行消毒、去殼、播種得到實生苗；油桃葉片樣品（S01、S03）品種來源為中油4號，于2017年5月采自管理與栽培條件一致的遼寧省大連市大田溫室，其中S01為無癥狀，S03為花葉。采集的新鮮葉片經液氮處理后，于-80 ℃保存備用，后續試驗于2021年12月在中國農業科學院植物保護研究所進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 編碼捕光葉綠素a/b結合蛋白Lhcb基因的克隆與測序 植物總RNA的提取和引物設計：使用多糖、多酚植物總RNA提取試劑盒提取植物總RNA，并于-80 ℃保存備用。根據GenBank中已登錄的桃Lhcb-Pp1基因序列（登錄號L36064.1）設計引物（表1），對Lhcb基因進行全長擴增。5′、3′端全長擴增引物（Full-F/R）預期擴增出大小為 1 912 nt 左右的目的基因全序列及5′或3′端部分片段。另設計3′端序列擴增引物（5′-991F），預期目的片段擴增大小為900 nt左右。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成，詳見表1。

RT-PCR擴增：以植物總RNA為模板，使用反轉錄試劑盒合成cDNA；用Q5 High-Fidelity 2X Master Mix試劑盒進行PCR反應，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行分析。

目的基因片段的克隆和測序：PCR目的產物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化。將純化產物連接至pTOPO-Blunt克隆載體，轉化到大腸桿菌Escherichia coli DH5α感受態細胞，經菌液PCR檢測鑒定后，挑選陽性克隆送至北京擎科生物科技有限公司測序。用BioEdit^［15］軟件對克隆測序得到的序列進行拼接，獲得Lhcb基因全長序列。

1.2.2 序列分析 從NCBI數據庫中下載已登錄的桃Lhcb-Pp1基因序列及其編碼的蛋白質序列（登錄號：AAA50310.1），用BioEdit軟件對“1.2.1”節擴增到的基因序列進行比對，分析其序列的差異。

1.2.3 系統發育樹的構建 為了確定所得Lhcb基因的遺傳進化關系，除供試樣品Lhcb基因外，從NCBI上下載桃、杏、梅、甜櫻桃、月季、白梨、蘋果、野草莓、蓖麻、大麻、大豆、野大豆、美花煙草、擬南芥、雷公藤、胡楊、茶、油茶、銀白楊、蓮、向日葵、核桃、山核桃、木薯、橄欖、葡萄的Lhcb基因及其編碼的蛋白序列，在BioEdit中進行序列比對，用MEGA 7.0^［16］構建系統發育樹。系統發育樹的構建選擇General Time Reversible model和Gamma Distributed（G）模式運行程序，采用最大似然法（maximum likelihood，ML），Bootstrap值設為1 000次。

1.2.4 Lhcb蛋白的理化性質分析 為了明確不同植物Lhcb蛋白之間的親緣關系是否和其理化性質相關，用ExPASy-ProtParam^［17］（https：//www.expasy.org/resources/protparam）對桃和其他物種的Lhcb蛋白進行理化性質分析。

1.2.5 Lhcb蛋白二級結構、三維結構的預測 利用Phyre2在線工具^［18］（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）對桃中的Lhcb蛋白進行分析。先輸入蛋白序列，再預測Lhcb蛋白的二級結構，并以Pea Light-Harvesting Complex（PDB ID：2bhw）為模型，用Swiss Model在線工具（https：//swissmodel.expasy.org/）進行同源建模，用Swiss-PDB Viewer軟件查閱其三維結構^［19］。

1.2.6 半定量RT-PCR及RT-qPCR技術 將油桃樣品的RNA定量2 μg后再反轉錄為cDNA，稀釋20倍后可用作模板。以TEF2（translation enlongation factor 2，翻譯延伸因子2）^［20］為內參基因，以桃轉錄本PRUPE_ppa0100 15 mg基因序列設計特異引物。半定量RT-PCR：將得到的cDNA分別按1 ∶2、1 ∶20、1 ∶200的比例稀釋，PCR反應使用2×Taq PCR MasterMix試劑盒進行。引物 Lhcb-F：5′-AACCGCATCCAAGTCCA-3′，Lhcb-R：5′-CTCAAGTTCTCAGGCTCAC-3′。RT-qPCR：用含有 SYBR GreenⅠ的 TransStart Green qPCR SuperMix試劑盒配制反應體系，在MyGo Pro Real-Time PCR System （IT-IS Life Science Ltd.，UK）上進行RT-qPCR擴增。引物qLhcb-F：5′-CTCTTACCTCACTGGAGAATT-3′，qLhcb-R：5′-ATACAGCCTCACCGAACT-3′，每個qPCR反應設1個陰性對照。

2 結果與分析

2.1 編碼捕光葉綠素a/b結合蛋白Lhcb基因的克隆與序列分析

利用5′、3′端全長擴增引物Full-F/R，通過 RT-PCR 擴增、克隆測序得到山毛桃全序列與油桃S01 5′端1 047 bp、3′端1 400 bp的片段及S03 5′端1 047 bp的部分序列。通過3′端擴增引物5′-991F、3′-Full-R擴增，獲得S03 3′端889 bp的片段。最終通過克隆、序列拼接與測序，獲得S01、S03的完整序列。山毛桃、油桃S01、S03的Lhcb基因分別命名為Lhcb-Pd1、Lhcb-Ppn1、Lhcb-Ppn3（圖1）。

序列分析結果表明，Lhcb-Pd1、Lhcb-Ppn1和Lhcb-Ppn3基因全長1 925 bp，包括1個804 bp的開放閱讀框（ORF），可編碼267個氨基酸，預測其編碼PSⅡ-LHC Ⅱ，Type1，非編碼區中包含 CAAT-signal、TATA box等作用元件。與 Lhcb-Pp1序列（基因全長1 912 bp）相比，明顯的差異是克隆的3個目的基因序列在1 593 nt處均有10 bp堿基（CAGTCTGCAG）的插入（圖2），在266 nt處有G插入，在1 278、1 303 nt處有A插入（圖2）。但是與Lhcb-Pp1基因編碼區（位置：337～1 140 nt）的氨基酸序列比對發現，其編碼的氨基酸高度保守，相似性為100%。此外，將得到的目的基因在NCBI中進行比對，發現100余種植物的Lhcb基因中，只在杏（登錄號：AP019299.1）中發現相同的10 bp堿基插入（圖中未顯示），其他物種并未發現相同堿基插入。

2.2 Lhcb基因及其編碼蛋白的系統發育樹分析

將Lhcb-Pd1、Lhcb-Ppn1和Lhcb-Ppn3全長基因與模式植物擬南芥的Lhcb1全長基因進行序列比對，結果表明，3條目的基因核苷酸全序列與擬南芥Lhcb1的5條基因序列的一致性都較低，為34.6%～39.8%，但其編碼區的蛋白編碼核苷酸序列的一致性較高，為67.4%～67.9%，氨基酸序列一致性為87.8%～88.1%；李屬代表植物如甜櫻桃、梅、杏等與桃目的基因編碼蛋白編碼氨基酸序列的一致性為96.3%～98.6%，不同桃品種之間的Lhcb基因同源性較高，其所編碼的蛋白編碼氨基酸序列一致性可達100%。上述結果表明，雖然不同物種相應的Lhcb基因親緣關系不同，但是其編碼的蛋白質在進化上還是相對保守的。

對不同物種Lhcb基因編碼核苷酸序列和編碼蛋白的遺傳進化分析結果表明，從桃中克隆到的3條基因與大多數李屬植物的基因聚在一起，親緣關系最近；與擬南芥親緣關系較遠，與序列比對結果一致；對不同桃品種而言，山毛桃、桃和油桃單獨聚在李屬植物遺傳組的1個亞組上（圖3）。

2.3 不同物種Lhcb蛋白質的理化性質分析

不同物種Lhcb蛋白的理化性質分析結果表明，毛桃與油桃Lhcb蛋白的理化性質一致。由表2可知，除月季、向日葵外，其余物種Lhcb蛋白的氨基酸殘基數為261～269個，相對分子量為27 700.74～28 633.67 u，理論等電點為5.10～6.33，大多數為親水性蛋白；不同植物的Lhcb蛋白理化性質較一致，但也有差異，如擬南芥Lhcb1中的5個蛋白大都為疏水蛋白，可能是由氨基酸非保守域序列的差別造成的。

2.4 桃Lhcb蛋白的二級結構、三維結構分析

用Phyre2對桃Lhcb蛋白的二級結構進行分析，結果表明，Lhcb主要由53% α-螺旋、33%無規卷曲和24%跨膜螺旋組成，無β-折疊結構，預測結果的可信度為100%。以Pea Light-Harvesting Complex（LHC；PDB ID：2bhw）為模型，用Swiss-Model進行三維結構的同源建模，結果表明，桃Lhcb與Pea LHC的氨基酸序列相似性為94%，二者具有相似的三維結構。桃Lhcb蛋白的空間結構分析結果顯示，其主要由3條鏈組成，包括α-螺旋、無規卷曲結構（圖4）。與模式植物擬南芥相比，桃Lhcb蛋白的整體三維結構與擬南芥S-LHCⅡ、M-LHCⅡ的三維結構均相似，這些結構也是捕光葉綠素a/b結合蛋白的典型空間結構，是其行使生物學功能的基礎，也表明LHCⅡ蛋白在進化上相當保守。

2.5 半定量RT-PCR、RT-qPCR對油桃中Lhcb基因表達量的分析

圖5-A的半定量RT-PCR結果表明，隨著模板量的逐漸減少，S01、S03中內參基因的量均無顯著差異，但S03中Lhcb基因的量表現為降低趨勢，當cDNA含量稀釋200倍時，S01樣品中仍能見較亮的Lhcb擴增條帶，而S03樣品中已基本看不見擴增條帶。圖5-B的RT-qPCR結果也表明，S03花葉樣品中的Lhcb基因表達量明顯下調，S01樣品中的Lhcb基因表達量是S03的40倍左右（圖5-B）。以TEF2為內參基因，通過半定量RT-PCR、RT-qPCR檢測油桃無癥狀（圖5-C）和花葉葉片（圖5-D的Lhcb基因表達量差異，獲得一致結果。由試驗結果可以推測，S03樣品中花葉癥狀的出現與Lhcb基因表達量的下調密切相關。

3 討論與結論

在光合作用和植物抗逆的過程中，捕光葉綠素a/b結合蛋白都發揮著重要作用。本研究以我國山毛桃、油桃為供試樣品進行Lhcb的全基因克隆，獲得了不同桃品種和不同癥狀樣品的Lhcb全基因序列，預測其編碼PS Ⅱ-LHCⅡ，Type1。序列分析結果表明，與NCBI中提交的桃品種Stark Earlilo的Lhcb基因相比，獲得的3條Lhcb全基因的序列均在1 593 nt非編碼區多出了10 bp堿基的插入，說明我國不同桃品種的Lhcb基因序列與NCBI中提交的桃品種存在差異，但獲得的目的基因編碼的Lhcb蛋白是高度保守的。經過對NCBI中不同物種的Lhcb基因序列進行比對，發現只在杏中可以比對到插入的這10個堿基，而有研究發現，早在1992年，馬鋒旺等就已進行桃與杏的雜交試驗，發現多數雜交組合有一定的親和性^［21］。在我國目前的果園中，果樹混種的現象十分普遍，難以避免桃杏之間的雜交，筆者推測，本研究中目的基因組DNA多出10個堿基可能與品種起源有關。

在模式植物擬南芥中，Lhcb1基因編碼PSⅡ-LHC Ⅱ（Type1蛋白），包含5條Lhcb1亞型基因（lhcb1.1、lhcb1.2、lhcb1.3、lhcb1.4、lhcb1.5）^［4］。對本研究獲得的目的基因編碼的蛋白質進行理化性質分析發現，李屬植物的Lhcb蛋白大多為親水蛋白，而擬南芥Lhcb1中的5個蛋白大多為疏水蛋白。由于擬南芥Lhcb1基因編碼的蛋白質中含有1段高度疏水序列即“通用LHC基序”（ELINGRLAMLGFLGFLVPELIT），而此序列并未在李屬植物中比對到，因此推測李屬植物和擬南芥Lhcb1蛋白的疏水性可能由氨基酸非保守域序列的差別造成^［22］。在擬南芥中，LHCⅡ蛋白中的幾個三聚體組件可以在特定位置同時與PSⅡ核心復合體結合，根據它們與PSⅡ二聚體核心（C2）的相對位置及與PSⅡ-LHCⅡ相互作用的強度，創造了4個不同的LHCⅡ類別：強（S）、中（M）、松散（L）和裸露（N），其中較為常見的是S-LHCⅡ、M-LHCⅡ，S-LHCⅡ是lhcb1.3的產物，M-LHCⅡ為lhcb1.4的產物^［22-23］，而桃Lhcb蛋白整體的三維結構與S-LHCⅡ、M-LHCⅡ的三維結構相似，這是捕光葉綠素a/b結合蛋白的典型空間結構，表明LHCⅡ蛋白在進化上比較保守。

在田間條件下，桃花葉癥狀普遍發生，通常由缺素或病毒侵染引發。有研究表明，Lhcb基因普遍參與光能的捕獲與傳遞、葉片發育及各種脅迫應答，如干旱脅迫、鹽脅迫、激素信號及病原脅迫^［24-25］。筆者用半定量RT-PCR、RT-qPCR技術對不同表型油桃樣品進行Lhcb基因表達的差異分析，結果表明，花葉癥狀的油桃樣品PSⅡ-LHCⅡ，1型Lhcb基因的表達量顯著下調。筆者通過對無癥狀及花葉油桃樣品進行病毒檢測，均檢測到桃潛隱花葉類病毒（PLMVd）^［26］，這是一種由335～351 nt 組成的環狀RNA分子^［27］，用不同的PLMVd序列分離物侵染桃樹后會有不同表型，被侵染的植株一般表現為不同癥狀的花葉、白化、延遲發芽等，有些表現為無癥狀的潛隱性侵染^［28］。筆者也發現了由PLMVd侵染引發的花葉癥狀的報道^［29］，與本研究樣品的花葉表型一致。此外，在本研究中，油桃無癥狀及花葉葉片樣品采集于相同管理條件和栽培環境的田間溫室，由此可以初步推測，花葉癥狀的產生可能與PLMVd侵染導致PSⅡ-LHCⅡ 1型Lhcb基因表達量下調有關，進一步的研究正在進行中。Lhcb蛋白為光合作用中的重要功能蛋白，其生理功能復雜，占光合膜中近50%的色素和約1/3的蛋白質。Lhcb在植物生長發育中發揮著重要作用，因此對其研究也逐漸增多^［30］。LHC蛋白作為自然界最豐富的膜蛋白之一，目前關于Lhc基因的測序分析在一些模式植物中已較完善，在毛竹、金銀花、橡膠樹、景天、李屬植物等物種中，有少數LHC蛋白相關的基因被克隆測序，但對桃Lhcb基因的研究未見報道。此外，已有報道顯示，植物Lhcb基因的表達與非生物協迫有關，但對其與植物病原侵染的關系研究較少。因此，本研究對桃不同品種和不同病害癥狀的Lhcb基因的克隆與表達分析不僅有助于豐富Lhcb基因的序列信息，而且可為木本李屬植物栽培及病害防治等提供重要的參考依據。

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