枯草芽孢桿菌在蛋雞養殖中的應用及展望

文│蘇權* 顧舒舒 呂宗德 陳婷（江蘇省南京市畜牧獸醫站）

抗生素在防控動物疫病、促進生產方面具有巨大作用，但我國在2020年逐步禁止在蛋雞生產中使用抗生素。因此，尋找高效的替抗產品對促進蛋雞養殖產業具有至關重要的作用。枯草芽孢桿菌具有提高營養消化率，改善腸道健康，增強腸道屏障完整性，調節免疫功能等優點，是一種很有潛力的替抗產品。此外，基于孢子表面展示技術，使枯草芽孢桿菌在構建新型蛋雞疫苗方面具有廣闊的應用前景。筆者主要介紹現階段枯草芽孢桿菌在蛋雞生產中的應用及基于表面展示技術的前景應用。

一、枯草芽孢桿菌概述

1.枯草芽孢桿菌簡介。枯草芽孢桿菌是一種需氧、無莢膜、周生鞭毛的革蘭氏陽性菌。該菌廣泛分布于植物周圍，在土壤、腐敗的有機物中大量存在，在極端逆境中會生成內生芽孢，芽孢大小為0.6～0.9微米×1～1.5微米，形成的芽孢大體位于細菌的中心部位，芽孢形成后菌體大小沒有明顯變化。該菌菌落表面呈不透明的粗糙狀，顏色渾濁發白或偏黃色；接種在液體培養基里菌落呈皺襞樣。枯草芽孢桿菌生長速度快，對營養需求不高，且能高效利用蛋白質和糖類；其分泌的枯草菌素、短桿菌肽、制霉菌素等沒有任何毒性，且在抑制病原菌方面具有重要作用，被認為是最安全的有效替抗物之一。

在2007年，歐洲食品安全局通過評估認定枯草芽孢桿菌對畜禽養殖安全有效，作為飼料添加劑使用可以提高營養消化率、改善腸道健康、促進動物免疫細胞生長發育及提升機體免疫水平。當下，我國已禁止大部分促生長抗生素的使用，作為有益菌，枯草芽孢桿菌在綠色替抗方面具有不可多得的潛力。

2.芽孢簡介。芽孢是一種圓形或類圓形的休眠體，由4層結構組成，從內到外依次是核芯、皮層、芽孢殼和孢子外壁；芽孢殼由70多種蛋白組成，是芽孢強大抗逆性的關鍵。芽孢具有特殊結構，使其芽孢外殼蛋白無需經歷穿膜過程就能正確組裝到位，因其這一特性使得枯草芽孢桿菌在表面展示系統應用上具有巨大的優勢。

二、枯草芽孢桿菌在蛋雞生產中的應用

枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑使用可以促進蛋雞免疫球蛋白的分泌，并活化體內免疫細胞，以此增強蛋雞免疫力；進入腸道后能定植于腸道黏膜，使腸道形成低氧環境，促使厭氧菌的形成，提高胃腸消化能力；此外，該菌還能產生諸如脂肪酶、淀粉酶、有機酸等有益物質促進鈣和維生素的吸收，從而促進蛋雞生長。

在提高蛋品質方面，2015年牛淑玲團隊通過在海蘭褐商品蛋雞的基礎日糧中添加500毫克/千克的枯草芽孢桿菌制劑發現，飼喂添加劑的蛋雞生產性能得到顯著提升，與對照組相比，雞蛋重量提高2.62%，破蛋率降低11.69%，料蛋比也有顯著降低。同樣在2022年，賀軍團隊在給海蘭褐飼喂不同量的枯草芽孢桿菌添加劑后發現，試驗組較對照組在蛋殼顏色、蛋黃相對重、蛋殼強度等指標上有顯著提升，飼喂量為400毫克/千克時效果最好。

在調節腸道平衡方面，陳欣團隊發現，枯草芽孢桿菌組蛋雞回腸中過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶的活性顯著升高，盲腸中的乙酸、正戊酸、異戊酸的含量，以及盲腸的總抗氧能力得到顯著提升。此外還發現，在蛋雞基礎日糧中添加1000毫克/千克的枯草芽孢桿菌后，該菌可以調節腸道平衡，防止蛋雞腹瀉；且長期飼喂（超過28天）可以顯著降低了雞白痢的發生率。

在增強抗病能力方面，飼喂枯草芽孢桿菌的蛋雞腸道腸絨毛更高，隱窩深度更淺，空腸的絨毛高度與隱窩深度的比值也更高；在血清學指標上，免疫球蛋白IgA和IgM濃度更高。枯草芽孢桿菌還能促進機體炎性因子I11β、I16、I18，增強蛋雞的先天免疫。此外，有研究表明，枯草芽孢桿菌作為佐劑同禽流感疫苗H9N2同時接種可以顯著增強蛋雞對該病毒的特異性抗體和T細胞免疫應答。

三、枯草芽孢桿菌表面展示技術

1.表面展示技術。表面展示技術指通過基因編輯技術將外源目的蛋白整合進噬菌體或細胞自身的結構蛋白中，使目的蛋白能展示在噬菌體或細胞表面，并保持相對獨立的空間和具有生物活性的技術。最早的表面展示系統是通過噬菌體構建的，史密斯團隊在1958年將外源基因整合到絲狀噬菌體外殼蛋白M13基因上，并使得外源基因成功表達免疫原性，給構建克隆抗原提供了一種新的思路。

此后，研究人員嘗試將目的基因重組到不同的細菌或細胞上，建立了酵母表面展示系統、細菌表面展示系統和孢子表面展示系統。其中孢子表面展示系統雖然發展最晚，但因枯草芽孢桿菌出色的穩定性和環境友好性，使其表面展示系統廣泛應用于食品工業、環境凈化、藥物生產及疫苗制造領域。

2.枯草芽孢桿菌表面展示系統。2001年，研究人員通過基因編輯手段將破傷風毒素的459個氨基酸片段嵌入枯草芽孢桿菌的外殼蛋白CotB基因的C端，并順利在其孢子的表面表達出具有抗原性的目的片段，標志著第一個枯草芽孢桿菌表面展示系統（BSSD）的建立，為構建高效的抗原免疫模式提供了新的思路。

通常，我們將需要被插入目的基因的孢子外殼蛋白稱為錨定蛋白，而決定BSSD技術的成功關鍵就在于錨定蛋白，所以在選擇錨定蛋白上需要進行以下評估：一是要確保表達的目的蛋白能在孢子表面形成獨立的結構域；二是需要結構穩定，確保目的蛋白能穩定表達在孢子表面；三是需要錨定蛋白具備相對獨立性，防止目的蛋白插入后影響孢子的生理功能；四是錨定蛋白還需要具備一定的抵抗周圍環境蛋白酶的能力。近年來，雖然報道了很多錨定蛋白成功展現目的蛋白的例子，但考慮到在孢子表面的分布情況，現階段應用最多的還是CotB、CotC、CotG這3種錨定蛋白，其中CotB和CotC主要用于抗原的表達，而CotG主要應用于細胞轉化中對相關酶的定位。

在確定錨定蛋白后，還需通過合理的重組策略將目的蛋白插入錨定蛋白中，使其在孢子表面正確表達。根據最新的研究表明，CotB、CotC和CotG蛋白通常將目的蛋白插入其N末端或C末端；而CotZ和CgeA蛋白只能將目的蛋白插入C末端；而CotG、CotZ、CotX和OxdD蛋白可以將目的蛋白插入其C末端。

3.枯草芽孢桿菌表面展示技術在疫苗生產方面的前景。在第一個以枯草芽孢桿菌CotB蛋白構建的破傷風毒素重組孢子出現后，其他研究人員也順利在孢子上展示了破傷風毒素用作疫苗生產的外源蛋白，為枯草芽孢桿菌作為疫苗蛋白載體奠定了基礎；此外，因枯草芽孢桿菌形成的孢子對惡劣環境極具抗性，使其能順利地通過胃腸通道，到達指定位置，也為后續研究口服藥物或疫苗生產打開了新的思路。

在水產疫病防控方面，研究人員利用白斑綜合征病毒（WSSV）的VP28包膜蛋白構建了枯草芽孢桿菌重組孢子，再將這些孢子飼喂給南美白對蝦后發現其超氧化物歧化酶和酚氧化酶的活性顯著增加；用WSSV對其進行感染后發現，飼喂重組孢子的蝦死亡率大大降低。

在動物疫病防控方面，研究人員在枯草芽孢桿菌的孢子上表達甘油醛-3-磷酸脫氫酶（HcGAPDH）后給綿羊口服后用于治療捻轉血矛線蟲，治療后糞便中每克蟲卵減少84.1%；血液和腸液監測顯示，單核細胞顯著升高，血清中的特異性抗體IgG和腸黏液中特異性抗體slgA均顯著升高。此外，近期黃耀偉團隊將貓冠狀病毒（FCoV）刺突蛋白上的七肽重復序區2（HR2）表達在枯草芽孢桿菌的孢子外殼蛋白上后，讓小鼠服用后能產生強烈的細胞和體液免疫，并且能有效防止FCoV的感染。

在寄生蟲防控方面，將華支睪吸蟲的被膜蛋白重組進孢子桿菌的CotC蛋白上以構建重組孢子，在小鼠口服重組孢子兩周后，糞便中特異性的IgA顯著上升；給感染了華支睪吸蟲囊尾蚴的大鼠服用重組孢子后，可產生顯著的保護作用。類似的，研究人員還利用日本血吸蟲的谷胱甘肽S-轉移酶（GST）構建了重組孢子，在小鼠口服重組孢子后產生全身免疫反應；給藥33天后，糞便中特異性IgA和血清中的IgG均顯著上升。

綜上所述，枯草芽孢桿菌表面展示系統在新型疫苗蛋白載體及疫苗制造領域具有巨大潛力。

四、展望

枯草芽孢桿菌因其具有抗逆性強、無污染、融合蛋白無需穿膜等特點，在疫苗研發領域取得了巨大的進展，并應用于尿毒素、尿素酶A、尿素酶B、白細胞介素2等疫苗的研發。但當前還鮮見枯草芽孢桿菌表面展示技術在蛋雞上的應用，原因主要有展示效率過低和針對蛋雞的研究不足。

當前，諸如外殼蛋白CotB存在需要野生型CotB蛋白的輔助才能將重組的目的蛋白正確表達到孢子外殼上，其中涉及的蛋白互作機制尚未明確，導致展示系統效率低下。今后還需繼續探索適合充當錨定蛋白的外殼蛋白，并針對特定錨定蛋白優化重組策略、折疊方式和策略等，進而提高展示效率。

而我國雞蛋消費潛力巨大，蛋雞養殖量也逐年升高，但傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、傳染性法氏囊等疫病頻繁發生，表明該系統在蛋雞領域擁有巨大潛力。而黃耀偉團隊利用冠狀病毒特有的HR2構建的重組孢子能顯著提升對FCoV的抗性；雞傳染性支氣管炎（IBV）同樣為冠狀病毒，且能通過腸道感染，其HR2構建的重組孢子是否能提升蛋雞對IBV的抵抗力還需進行深入研究。

攻克這些問題對開發新型靶向藥物、特異性的疫苗或作為替抗產品都有重要意義。