微生物學快速現場評價在重癥肺炎中的應用價值

楊幸樂 夏婷婷 左春磊 史家欣

1錦州醫科大學（遼寧錦州 121000）；徐州醫科大學附屬連云港醫院2呼吸與危重癥醫學科，3檢驗科（江蘇連云港 222006）

重癥肺炎是重癥監護病房內的一種常見急危重癥，多見于免疫功能低下的患者，臨床上常表現為病情重、進展迅速、治療難度大、預后差等特征，嚴重威脅人類健康［1］。盡管目前在病因調查和抗微生物治療方面已取得較大進展，但重癥肺炎仍然是全世界感染死亡的主要原因之一［2］。有調查研究［3］表明，在沒有可靠的致病微生物證據的情況下，僅接受經驗性治療的患者病死率高達30% ～50%，及時有效的靶向抗菌藥物治療是提高重癥肺炎患者生存率的有效手段。微生物學快速現場評估（M-ROSE）是指利用現場制片、染色手段并在較短時間內獲取微生物學證據的一項檢測技術［4-5］。有研究［6-7］證明M-ROSE 對肺部感染患者具有較高的診斷價值，但對于M-ROSE 在重癥肺炎中的應用價值尚未明確。本研究通過觀察M-ROSE 對重癥肺炎患者入院后臨床癥狀、血炎癥指標水平、機械通氣時間、住ICU 時間及病死率的影響，評價M-ROSE 在重癥肺炎中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料隨機選取2021 年2 月至2023 年2 月在連云港市第一人民醫院住院的60 例重癥肺炎患者，其中M-ROSE組30例、對照組30例。MROSE 組患者利用M-ROSE 檢測結果選取抗菌治療方案，而對照組則依據指南選擇經驗性抗菌治療方案。本研究已獲得連云港市第一人民醫院倫理委員會審批（倫理審查意見號：KY-20211027001）。

1.1.1 入組標準年齡≥18 歲；入院后初診為重癥肺炎尚未使用抗菌藥物治療；符合2007 年美國感染疾病學會/美國胸科學會關于重癥肺炎診斷標準的住院患者［8］。重癥肺炎主要標準：患者需行有創機械通氣治療；膿毒性休克需血管收縮劑治療。次要標準：呼吸頻率＞ 30 次/min；氧合指數（PaO2/FiO2）＜ 250；多肺葉浸潤；意識障礙／定向障礙；氮質血癥（BUN ＞ 20 mg/dL）；由感染引起的白細胞減少（WBC ＜ 4.0 × 109/L）；血小板減少（血小板 ＜ 100 × 109/L）；低體溫（T ＜ 36 ℃）；低血壓，需要進行積極的液體復蘇治療。符合1項主要標準或3項次要標準可診斷為重癥肺炎。

1.1.2 排除標準合并有肺纖維化、免疫性疾病、長期使用激素的患者；自身免疫性疾病患者；先天性免疫缺陷、獲得性免疫缺陷患者；晚期腫瘤患者。

1.2 方法

1.2.1 資料收集收集入組患者臨床、實驗室及相關影像學資料，包括患者基礎信息、既往史、血清炎癥指標（細胞因子、WBC、CRP）、發熱時長、機械通氣時間、住ICU 時長、28 d 病死率。住院后首次診斷重癥肺炎日期即為觀察起始日期，每天對患者治療效果進行評價，肺炎已控制且生命體征平穩者予轉出ICU。所有入組患者均由本人或委托人簽署知情同意書（版本號：V1.2021.01.27）。

1.2.2 氣道分泌物及肺泡灌洗液收集對于意識清醒，有自主排痰能力的入組患者，囑咐患者主動咳痰，收集深部痰標本；對于無自主排痰能力和有創機械通氣者予吸痰器吸引深部痰液，并予以送檢下一步檢測；接受電子支氣管鏡檢查行支氣管肺泡灌洗者，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），留取部分BALF 送檢驗科行病原學檢測，其余BALF行M-ROSE 檢測。

1.2.3 標本染色

1.2.3.1 革蘭氏染色對收集到的痰液和BALF進行現場快速涂片，對于痰液豐富者，予0.1%DTT進行祛痰處理，再吸取20 μL 標本進行涂片，自內向外劃直徑為1 cm 的同心圓薄層，將標本至于酒精燈上加熱固定。（1）滴加80 μL 結晶紫進行初染，時間1 min；（2）流水沖洗后，滴加80 μL 碘液進行媒染，時間1 min；（3）流水沖洗后滴加95%乙醇進行脫色，時間20 s ；（4）無需沖洗，直接滴加80 μL 沙黃復染，時間1 min；（5）染好的涂片用細小流水沖洗，盡量減少沉渣沉積，避免流水直接沖洗玻片，將洗凈的涂片片尾朝上，待涂片自然晾干后鏡檢，滴加香柏油在油鏡下觀察。若視野中出現紫色球（桿）狀細菌，則為革蘭陽性球（桿）菌；若視野中出現紅色球（桿）菌，則為革蘭陰性菌球（桿）菌。

1.2.3.2 抗酸染色取標本混懸液20 μL，在潔凈的載玻片上由內向外均勻涂抹直徑為1 cm 的同心圓薄層，將標本至于酒精燈上加熱固定；（1）滴加石碳酸復紅初染（3 min，弱火）；（2）水洗后，3%鹽酸乙醇脫色（20 s，2 次）；（3）水洗后，亞甲藍復染（1 min），染好的涂片用細小流水沖洗，盡量減少沉渣沉積，避免流水直接沖洗玻片，將洗凈的涂片片尾朝上，待涂片自然晾干后鏡檢。若視野中出現紅色細長，略彎曲的桿菌，則為結核桿菌。

1.2.3.3 真菌涂片鏡檢接種環取標本混懸液，涂抹于潔凈載玻片上，滴加10%的氫氧化鉀溶液處理后在低倍鏡和高倍鏡下觀察有無孢子或菌絲，注意操作過程盡可能在無菌環境終完成，以此減少假陽性的發生率。若真菌涂片見孢子或菌絲，可進一步完成墨汁染色，判斷是否為隱球菌感染。

1.2.4 抗菌治療方案的選擇M-ROSE 組患者的初始抗菌藥物治療方案根據鏡檢結果，結合《抗菌藥物臨床應用指南（第三版）》選擇相應的抗感染治療方案。對照組患者根據《中國成人醫院獲得性肺炎與呼吸機相關性肺炎診斷和治療指南（2018 年版）》、《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南（2016 年版）》指南結合臨床選擇經驗性抗感染治療方案［9-10］。

1.2.5 血清細胞因子的測定抽取所有受試者在診斷后的第1、7 天清晨空腹靜脈血3 mL，以3 000 r/min，4 ℃離心15 min，分離血清，應用流式熒光法（CBA）檢測血清中細胞因子IL-6、IL-10 的水平，操作過程嚴格按說明書進行。

1.2.6 臨床觀察指標及療效判定標準對兩組患者病程第1、7 天炎癥指標（WBC、CRP）進行觀察比較，并比較兩組患者發熱消失時長、機械通氣時間、住ICU 時長及28 d 病死率的差異。

1.3 統計學方法利用SPSS 19.0 軟件進行數據處理，非正態計量資料數據以中位數和四分位數（Q1/Q3）表示；正態計量資料數據以均數±標準差表示，兩組間均數的比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料以例表示，采用χ2檢驗。P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般資料兩組患者性別、年齡、臨床癥狀（發熱、呼吸困難）、慢性病史、吸煙史、APACHEⅡ評分，差異無統計學意義（P＞ 0.05），有可比性。見表1。

表1 兩組患者一般資料Tab.1 Comparison of general data of patients between the two groups

2.2 M-ROSE 結果30 例患者的M-ROSE 評估結果顯示，革蘭陽性菌為5 例（16.67%，涂片結果如圖1A），革蘭陰性菌為11 例（36.67%，涂片結果如圖1B），結核1 例（3.70%，涂片結果如圖1C）；真菌3 例（10%，涂片結果如圖1D）；混合感染10 例（33.33%）。

圖1 M-ROSE 涂片Fig.1 M-ROSE smear

2.3 血清IL-6、IL-10 水平變化應用CBA 法檢測入組患者第1、7 天血清中細胞因子IL-6、IL-10的表達，并計算IL-6/IL-10 比值。第1 天兩組IL-6、IL-10、IL-6/IL-10 水平無明顯差異（P＞ 0.05），治療7 d 后M-ROSE 組IL-6、IL-10、IL-6/IL-10 水平均較對照組顯著下降（P＜ 0.05）。見表2。

表2 兩組患者血清細胞因子水平的動態變化與比較Tab.2 Comparative analysis of serum cytokine levels and their dynamic changes between the two groups ±s

表2 兩組患者血清細胞因子水平的動態變化與比較Tab.2 Comparative analysis of serum cytokine levels and their dynamic changes between the two groups ±s

注：#中位數和四分位數

細胞因子IL-6（pg/mL）IL-10（pg/mL）IL-6/IL-10 P值0.143 0.001 0.849 0.011 0.249 0.001天數第1天第7天第1天第7天第1天第7天M-ROSE組119.04 ± 46.79 34.85（29.14，44.76）#1.89 ± 0.66 1.86 ± 0.55 66.94 ± 28.77 21.08 ± 4.63對照組139.38 ± 58.62 74.17（63.14，95.31）#1.92 ± 0.60 2.27 ± 0.65 75.86 ± 30.46 33.97 ± 6.07統計量值1.486 8.271 0.191 2.638 1.166 9.242

2.4 血清WBC和CRP水平變化入院時M-ROSE組和對照組患者血清WBC、CRP 水平比較差異無統計學意義（P＞ 0.05），見表3。治療1 周后兩組患者血清WBC、CRP 水平均較前下降，M-ROSE 組和對照組患者血清WBC、CRP 水平差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表3。

表3 兩組患者血清炎癥指標水平的變化與比較Tab.3 Dynamic alterations and comparative analysis of serum inflammatory biomarkers between the two groups ±s

表3 兩組患者血清炎癥指標水平的變化與比較Tab.3 Dynamic alterations and comparative analysis of serum inflammatory biomarkers between the two groups ±s

血炎癥指標WBC（× 109個/L）CRP （mg/L）天數第1天第7天第1天第7天M-ROSE組11.71 ± 2.50 8.86 ± 1.22 99.00 ± 43.74 74.93 ± 28.60對照組11.07 ± 1.93 9.58 ± 1.34 106.50 ± 39.09 93.05 ± 27.05統計量值1.118 2.182 0.701 2.521 P值0.268 0.033 0.486 0.014

2.5 患者發熱時間對照組患者發熱時間是（4.17 ± 1.70）d，M-ROSE 組是（2.87 ± 1.53）d，MROSE 組顯著少于對照組，兩組比較差異有統計學意義（t= 3.114，P= 0.003）。

2.6 機械通氣時間M-ROSE 組（n= 14）和對照組（n= 16）機械通氣時間分別是（4.21 ± 1.48）d 和（7.31 ± 2.72）d，M-ROSE 組機械通氣時間顯著低于對照組，兩組比較差異有統計學意義（t= 4.355，P＜ 0.05）。

2.7 住ICU 時長M-ROSE 組和對照組住ICU 時長分別是（11.77 ± 1.52）、（12.80 ± 1.75） d，M-ROSE組顯著低于對照組，兩組比較差異有統計學意義（t= 2.439，P= 0.018）。

2.8 28 d 病死率M-ROSE 組死亡2 例（6.67%），對照組死亡1 例（3.33%），兩組比較差異無統計學意義（χ2= 0.351，P= 0.554）。

3 討論

重癥肺炎作為ICU 內常見的急危重癥，其治療難度大，病死率高，常有多種合并癥，極大增加了醫療保健負擔［1］。如何改善重癥肺炎預后一直是國內外研究的熱點之一［11］。盡早確定病原體并進行針對性治療是改善重癥肺炎患者預后的關鍵措施之一［12］。近年來隨著各類介入與微創技術的飛速發展，快速染色制片技術不斷提升，基于介入技術的M-ROSE 優勢愈發明顯，并逐漸成為現代介入呼吸病學和呼吸與危重癥醫學的核心技術之一［7，13-14］。既往有研究［6］將M-ROSE 應用于支氣管鏡下的肺部感染患者的病原學診斷中，通過回顧性分析評估M-ROSE 的診斷敏感性和特異性，初步證明了M-ROSE 在支氣管鏡下對肺部感染患者具有較高的診斷價值，有助于對感染患者進行病原學的初步評估，為下一步的臨床治療提供早期病原學依據，及早開始使用合適的抗菌藥物是減少重癥肺炎患者不良后果的關鍵因素［11］。

眾所周知，促炎反應與抗炎反應之間的平衡在重癥肺炎病程及轉歸中發揮著至關重要的作用。IL-6 作為促炎因子中的重要成員，在細胞間信號傳遞以及殺滅病原菌方面具有顯著意義，但其過度表達則會加重組織損傷導致不良預后［15］。而IL-10 是抑制炎癥反應、限制過度免疫反應的重要抗炎介質［16］。既往研究［17］表明，降鈣素原（PCT）在細菌感染引起的促炎癥反應刺激下水平會升高，是一種鑒別細菌與非細菌感染的有用指標，但在新冠肺炎中進行的一項研究發現PCT 反映全身炎癥反應水平的敏感性低于CRP，結果顯示無論在輕型組、普通組、重型組或危重組CRP 水平均高于對照組，而PCT 在輕型組和普通組中均與對照組無顯著異。因此，CRP 能更好地反映全身炎癥反應水平并對治療效果作出快速反應［18］。

本研究通過前瞻性研究本院60 例重癥肺炎患者，觀察兩組患者血液炎癥因子水平（如IL-6、IL-10、IL-6/IL-10）、WBC、CRP 以及發熱時長、機械通氣時間、住ICU 時長、28 d 病死率，評估M-ROSE在重癥感染患者中的應用價值。結果顯示，治療7 d 后M-ROSE 組IL-6、IL-10、IL-6/IL-10 水平均低于對照組（P＜ 0.05）。與對照組相比，M-ROSE組患者的血WBC、CRP 水平下降速度更快（P＜ 0.05），發熱癥狀持續時間更短（P＜ 0.05），機械通氣時間和住ICU 時長明顯縮短（P＜ 0.05）。由此可見，依據M-ROSE 檢測結果選擇抗菌方案可快速有效地改善癥狀，促進炎癥因子和炎癥指標水平下降，縮短機械通氣時間及住ICU 時間。這些指標的快速改善，得益于M-ROSE 快速提供了初始病原學信息從而盡早選擇了更有針對性的抗菌藥物。

既往有研究［19］表明，對痰液進行革蘭染色可優化醫院獲得性肺炎抗菌藥物的選擇，顯著降低肺炎患者病死率。而本研究結果顯示M-ROSE 組與對照組患者病死率無明顯差異（P＞0.05），究其原因可能在于本研究納入的樣本量較小、微生物學鑒別手段較少，未來需要進行多中心、大樣本的研究，并納入更多的微生物檢測手段（如真菌免疫熒光檢測法、快速病原核酸檢測等）及檢測標本（如胸水、氣管鏡活檢或針吸活檢標本），以此獲得進一步的結論。

M-ROSE 操作簡單，可行性強，有助于在病原學層面對重癥肺炎患者進行初步病原學評估，為重癥肺部感染患者的治療提供初步的病原學參考，對改善重癥肺炎預后具有潛在的臨床價值。由于過度、不適當使用抗菌藥物易導致抗菌藥物耐藥，盡早、合理使用抗菌藥物可極大減少抗菌藥物耐藥的發生［11，20］。下一步需要探索M-ROSE 指導的抗菌藥物治療與基于指南的經驗抗菌藥物治療的耐藥性是否存在差異。

【Author contributions】YANG Xingle， XIA Tingting and ZUO Chunlei performed the experiments and wrote the article. SHI Jiaxin revised the article. SHI Jiaxin designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.