植物源抗真菌肽原材料的篩選及桂皮抗菌肽提取工藝的優(yōu)化

王虹霽，趙展展，李夢圓，張超文，王敬儀，韓玉竹，2

1. 西南大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2. 西南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)中心，重慶 榮昌 402460

糧食作物的霉菌污染以及由其引發(fā)的腐敗變質(zhì), 為糧食的儲存、 生產(chǎn)和銷售帶來了極大的困擾[1]． 據(jù)美國農(nóng)業(yè)部估計, 世界上25%的糧食作物在生長或貯藏期間會受到霉菌污染, 造成巨額的經(jīng)濟(jì)損失[2]; 且霉變的糧食含有多種毒素, 對畜禽的養(yǎng)殖產(chǎn)生了巨大危害[3-4]． 目前市場上用于防霉的制劑主要為化學(xué)藥劑, 常用的有丙酸及丙酸鹽類、 甲酸、 乙酸及乙酸鹽類等[5]． 近年來, 化學(xué)制劑在飼料加工及后續(xù)生產(chǎn)鏈中引發(fā)的安全問題日益受到食品加工等行業(yè)的關(guān)注, 特別是藥物在畜產(chǎn)品中的殘留和藥物對人體的危害等問題, 由此引發(fā)了人們對更安全、 更健康的食品防霉劑應(yīng)用的思考[6]．

植物中含有許多具有活性的抗菌物質(zhì), 包括為我們所熟知的黃酮類、 有機(jī)酸類、 生物堿類、 甾體皂苷類等, 不同的抗菌物質(zhì)對細(xì)菌、 真菌具有不同的抗菌效果和作用機(jī)制[7]． 目前對植物源抗菌物的研究主要集中在藥用植物中, 對具體化學(xué)物質(zhì)功能的研究主要集中在醫(yī)藥方面, 但應(yīng)用還存在諸多限制[8]． 作為廣泛存在于動植物體內(nèi)的小肽類物質(zhì), 部分抗菌肽以穩(wěn)定的特性展現(xiàn)出更好的殺菌效果[9, 10]． 相對于傳統(tǒng)的抗生素而言, 植物源抗菌肽(AMPs)具有廣譜、 高效的抗細(xì)菌、 抗真菌活性, 且不易產(chǎn)生耐藥性． 此外, 抗菌肽使用時綠色無污染, 可廣泛用于食物保存[11]、 植物病害防治[12-13]等方面, 具有廣闊的應(yīng)用前景． 桂皮指樟科植物的皮, 含有多種抗炎癥、 抗腫瘤、 抗血栓以及抗菌的活性成分, 比如桂皮醛、 香豆素和異硫氰酸酯等[14]． 目前對于桂皮中揮發(fā)性物質(zhì)的關(guān)注較多, 而桂皮中抗菌肽的研究還未有報道． 硫酸銨沉淀法可破壞蛋白質(zhì)表面的疏水結(jié)構(gòu), 使蛋白質(zhì)沉淀且不會破壞其活性, 該方法可從植物浸提液中有效提取抗菌肽, 因此, 此技術(shù)的優(yōu)化對桂皮抗菌肽的提取得率和活性具有重要意義．

目前國內(nèi)外關(guān)于植物源抗菌肽的研究主要集中在中藥材方面[15-16], 其分布及抑菌效果差異分析研究較少． 本文將探究AMPs在53種價廉易得、 有潛在抑菌特性的植物材料中的分布情況, 以糧食和油料作物中常見腐敗菌黑曲霉和黃曲霉為指示菌, 根據(jù)抗菌肽的抑菌圈大小, 對不同植物中提取的抗菌肽的抗菌效果和含量進(jìn)行分析, 篩選出抑菌效果較好的植物源． 在前期實驗的基礎(chǔ)上, 對具有抗菌肽開發(fā)潛力的桂皮的抗菌肽提取工藝進(jìn)行優(yōu)化, 以期為進(jìn)一步在食品安全中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)借鑒． 研究植物源抗菌肽的分布和提取工藝, 可以擴(kuò)大糧食作物生物防霉劑、 飼料安全添加劑的來源, 同時為AMPs的研究提供一定的實驗方法及理論參考．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硫酸銨, 重慶北碚化學(xué)試劑廠; PBS, PDA培養(yǎng)基, 上海博微生物科技有限公司; 黃曲霉和黑曲霉, 西南大學(xué)牧草微生物實驗室．

經(jīng)查閱資料, 梳理出了21個科共53種價廉易得、 耐儲存、 可能會含有植物源抗菌肽的原材料(表1)． 除了部分材料直接從西南大學(xué)牧草基地獲得, 其余植物材料均購于京東商場．

表1 植物材料

1.2 儀器和設(shè)備

漩渦振蕩器, IKA廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司; 定時恒溫磁力攪拌器, 上海滬西分析儀器廠; THZ-C型空氣恒溫振動器, 江蘇太倉市實驗設(shè)備廠; LRH生化培養(yǎng)箱, 上海一恒科學(xué)儀器有限公司; 牛津杯, 北京先驅(qū)威峰技術(shù)開發(fā)公司; 冷凍干燥機(jī), 松源華興有限公司．

1.3 實驗方法

1.3.1 抗菌肽的提取

將所選材料在65 ℃下烘干至恒質(zhì)量后, 用半自動粉碎機(jī)粉碎后過20目篩, 并用儲物袋保存． 采用硫酸銨沉淀法提取植物源抗菌物[17-18], 使用PBS緩沖液(pH值為7.6, 0.02 mol/L) 200 mL進(jìn)行浸提． 加50 g磨碎的樣品, 4 ℃中浸泡12 h, 攪拌勻漿, 紗布過濾后, 在4 ℃, 2 000 r/min離心20 min． 上清液中緩慢添加硫酸銨, 使其飽和度達(dá)到80%, 磁力攪拌30 min后于4 ℃靜置4 h, 之后在4 ℃, 10 000 r/min離心20 min, 沉淀即為抗菌肽粗提物． 將沉淀冷凍干燥后, 放入干燥器備用． 使用時, 向每種粗提物中加25 mL無菌水, 混勻制成抗菌肽溶液, 經(jīng)10 KDa超濾管超濾后, 供抑菌實驗檢測用．

1.3.2 優(yōu)化提取工藝

按照篩選實驗選擇優(yōu)化材料和指示菌, 分別從浸提液種類、 料液比、 浸提時間和硫酸銨飽和度等方面進(jìn)行優(yōu)化． 采用單因素實驗法, 每個處理均設(shè)6個重復(fù)．

1.3.2.1 浸提液種類對抗菌粗提物的影響

浸提時分別使用Tris-HCl緩沖液(pH值為7.6, 0.02 mol/L), PBS緩沖液(pH值為7.6, 0.02 mol/L)、 EDTA緩沖液(10 mmol/L Na2HPO4, 15 mmol/L NaH2PO4, 100 mmol/L KCl, 1.5% EDTA), 丙酮以及無菌水． 3種鹽溶液浸提性質(zhì)較為溫和, 丙酮具有良好溶劑效果且揮發(fā)性較強(qiáng)．

1.3.2.2 料液比對抗菌粗提物的影響

基于前一實驗條件, 設(shè)置料液比分別為1∶3, 1∶5, 1∶7, 1∶9．

1.3.2.3 浸提時間對抗菌粗提物的影響

基于前一實驗條件, 設(shè)置浸提時長分別為4 h, 8 h, 12 h, 16 h, 24 h, 36 h, 48 h．

1.3.2.4 硫酸銨飽和度對抗菌粗提物的影響

基于前一實驗條件, 設(shè)置硫酸銨飽和度分別為50%, 60%, 70%, 80%, 90%．

1.3.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化

經(jīng)過單因素實驗數(shù)據(jù)對比, 選取料液比、 浸提時間、 硫酸銨飽和度為自變量, 抑菌圈直徑為響應(yīng)值, 采用Box-Behnken設(shè)計方法, 設(shè)計3因素3水平的Box-Behnken中心組合實驗(表2), 并對實驗結(jié)果進(jìn)行驗證．

表2 響應(yīng)面實驗因素水平

1.3.3 分析方法

篩選實驗和優(yōu)化實驗均采用牛津杯雙層瓊脂平板擴(kuò)散抑菌圈法測定提取物的抑菌效果, 用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑． 篩選實驗以黃曲霉和黑曲霉為指示菌, 優(yōu)化實驗以黃曲霉為指示菌． 將保存的純種霉菌活化, 28 ℃培養(yǎng)7 d, 加入滅菌水后刮取孢子, 配制成濃度為1×106個/mL的孢子懸浮液． 吸取10 mL孢子懸浮液至裝有冷卻到45 ℃的200 mL PDA培養(yǎng)基的無菌瓶中, 充分混勻孢子液和培養(yǎng)基, 然后倒20 mL至培養(yǎng)皿(直徑為90 mm)中, 制成含菌平板． 在滅菌的牛津杯里加入100 μL抗菌粗提物水解液, 做好標(biāo)記, 密封好后在4 ℃的冰箱中浸潤12 h, 以促使抗菌物有效浸入培養(yǎng)基內(nèi), 而后轉(zhuǎn)置28 ℃恒溫培養(yǎng), 48 h后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑, 設(shè)空白加無菌水為對照, 每個處理重復(fù)測6次, 結(jié)果取平均值．

2 結(jié)果與分析

2.1 植物源抗菌肽(AMPs)原材料的篩選

本實驗對21個科共53種材料進(jìn)行AMPs的提取, 并對其抑菌效果進(jìn)行比較, 結(jié)果表明, 在53種實驗材料中共有40種表現(xiàn)出抑菌活性, 占比為75.47%(表3)． 不同植物之間, 籽實、 根、 根莖、 鱗莖及塊莖含抗菌肽的比例為86.11%, 明顯高于含抗菌肽比例為50%的花蕾、 花序、 葉片及莖葉． 相同植物不同部位之間, 如拉巴豆、 黑麥草、 玉米的籽實都表現(xiàn)出抑菌效果, 而莖葉無抑菌效果．

表3 53種植物源抗菌肽的抑菌圈大小

在40種有抗菌效果的材料中, 同時抑制黃曲霉和黑曲霉的抑菌圈直徑達(dá)到15 mm以上的材料共有12種, 其中大蒜(3)、 辣椒籽(38)、 丁香(49)和桂皮(53)的抑菌效果尤為突出, 抑制黃曲霉和黑曲霉的直徑均在25 mm以上, 大蒜對兩種菌的抑菌圈直徑均達(dá)到了41 mm, 其次為丁香、 桂皮、 辣椒籽． 只對黑曲霉的抑菌圈達(dá)到15 mm及其以上的材料共有9種, 只對黃曲霉的抑菌圈達(dá)到15 mm及其以上的材料共有4種．

結(jié)合抗菌肽研究現(xiàn)狀, 同時考慮實驗效果、 取材的方便性和價格等多種因素, 最終選擇桂皮為材料, 對其抗菌肽的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化．

2.2 浸提液種類對抗菌肽提取效果的影響

浸提液不僅影響抗菌肽提取的數(shù)量和效率, 而且關(guān)系到提取成本的高低, 對實驗研究和批次生產(chǎn)都起著重要的作用． 由圖1可知, 5種浸提液均能提出抗菌肽, 但浸提液丙酮和PBS的浸提物抑菌效果顯著高于其余3種浸提液(p<0.05), PBS浸提的抑菌圈最大, 直徑達(dá)到了27.41 mm． 無菌水的浸提物抑菌效果顯著低于其余4種浸提液(p<0.05), 抑菌圈直徑只有23.41 mm, 表明浸提液的種類對于浸提物抑菌效果的影響顯著． 雖然PBS和丙酮的浸提物抑菌效果之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05), 但與丙酮相比, PBS價格更低廉且無毒, 所以優(yōu)化實驗中選擇PBS作為浸提液．

小寫字母不同表示p<0.05, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖1 不同浸提液對桂皮抗菌肽提取效果的影響

2.3 料液比對抗菌肽提取效果的影響

料液比會影響抗菌肽的提取效率和效果, 影響所獲得的蛋白沉淀物的數(shù)量, 與整個實驗的操作效率和復(fù)雜程度有關(guān), 恰當(dāng)?shù)牧弦罕瓤山档统杀? 提高提取方法的可操作性． 由圖2可知, 料液比為1∶5和1∶7的抑菌效果顯著高于其余兩組(p<0.05), 料液比為1∶3的抑菌效果最差, 料液比1∶5之后抑菌效果發(fā)生回落． 雖然料液比為1∶5和1∶7的抑菌效果之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05), 但料液比為1∶5的抑菌效果更好, 因此后續(xù)優(yōu)化實驗選用料液比為1∶5．

小寫字母不同表示p<0.05, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖2 不同料液比對桂皮抗菌肽提取效果的影響

2.4 浸提時間對抗菌肽提取效果的影響

合適的浸提時間才能保證抗菌肽從原材料中充分釋放． 由圖3可知, 浸提36 h和48 h的抑菌效果顯著高于其余5個處理(p<0.05), 4 h, 8 h, 12 h, 16 h, 24 h的抑菌效果間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)． 浸提36 h和浸提48 h二者的抑菌效果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05), 為了提高浸提效率, 在后續(xù)優(yōu)化實驗中浸提時間選用36 h．

小寫字母不同表示p<0.05, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖3 不同浸提時間對桂皮抗菌肽提取效果的影響

2.5 硫酸銨飽和度對抗菌肽提取效果的影響

由圖4可知, 不同飽和度的硫酸銨對桂皮抗菌肽的抑菌效果影響明顯． 飽和度為80%和90%的抑菌效果顯著高于其余3個處理(p<0.05), 飽和度為50%和60%之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05), 效果低于其余3個處理． 飽和度為80%和90%之間的抑菌效果差異無統(tǒng)計學(xué)意義, 但考慮成本和降低物耗以及環(huán)境污染, 認(rèn)為80%的硫酸銨飽和度更適合于植物源抗菌肽的提取．

小寫字母不同表示p<0.05, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖4 不同飽和度對桂皮抗菌肽提取效果的影響

2.6 桂皮抗菌肽提取響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.6.1 響應(yīng)面回歸模型建立及結(jié)果分析

響應(yīng)面實驗設(shè)計和結(jié)果如表4, 獲得桂皮抗菌肽的抑菌圈直徑(Y)對料液比(A)、 浸提時間(B)、 硫酸銨飽和度(C)的多元回歸方程:

表4 中心組合實驗設(shè)計及結(jié)果

Y=33.74+0.92A+1.97B+0.46C+0.29AB+0.23AC+0.032BC-2.41A2-3.16B2-1.43C2

通過Design Expert 8.0.6.1軟件分析(圖5), 桂皮抗菌肽最佳提取條件為料液比1∶5.11 g/mL, 浸提時間39.29 h, 硫酸銨飽和度81.74%, 在此條件下抗菌肽的抑菌圈直徑為34.20 mm．

圖5 各因素互作對桂皮抗菌肽抑菌圈直徑的影響

2.6.2 回歸模型驗證

根據(jù)響應(yīng)面的最優(yōu)條件進(jìn)行驗證, 重復(fù)6次, 桂皮抗菌肽的抑菌圈直徑平均值為33.74 mm, 與預(yù)測值擬合率為98.65%, 優(yōu)化模型可靠． 優(yōu)化后抗菌肽活性比優(yōu)化前(27.79 mm)提高了21.41%, 表明此優(yōu)化方案合理, 可提高桂皮抗菌肽的獲得率．

3 討論與結(jié)論

植物源抗菌肽被認(rèn)為是一種有希望的、 綠色安全的生物防霉劑, 在食品、 醫(yī)藥、 畜牧方面有巨大的發(fā)展?jié)撃埽?本研究選擇的53種實驗材料中, 含有抗菌肽的植物占被測總數(shù)的75.47%, 而Srinivasan等[19]研究了50種藥用植物, 其中有抗菌活性的植物占72%． 本研究優(yōu)先選擇了利用廣泛、 具有消炎作用的植物材料, 這些植物材料可能含有抑制霉菌的抗菌肽, 因此比例接近． 相同植物材料之間, 種子和莖葉的抗菌肽含量不同, 例如麥迪黑麥草、 拉巴豆、 玉米種子中均能提取出抗菌肽, 而莖葉粗提物則無抗菌活性, 因此推測抗菌肽主要分布在籽實及根莖部位, 53種植物材料中籽實及根莖所含抗菌肽的比例高達(dá)86.11%也可以證明此結(jié)論． 根據(jù)抑菌圈的大小, 篩選出大蒜、 丁香、 桂皮、 辣椒籽對黑曲霉和黃曲霉抑菌效果最好． 此外黃芪、 甘草、 豆粕、 麥麩、 黑豆、 木香、 白芨、 金銀花、 黃芩、 洋蔥、 飼用甜高粱等多種植物提取的抗菌肽都有較好的抑制霉菌的作用． 目前除了辣椒籽、 黑豆等少數(shù)材料[17,20]研究過抗菌肽的抑菌活性, 其余材料的抑菌研究主要集中于黃酮類[21]、 有機(jī)酸[22]、 內(nèi)生菌[23]等方面, 鮮有關(guān)于其抗菌肽的相關(guān)研究． 另外, 本研究還首次發(fā)現(xiàn)糯高粱、 皇竹草植物組織中含有抗菌物質(zhì)——抗菌肽, 且對黃曲霉或黑曲霉有較好的抑菌效果．

桂皮是天竺桂、 陰香、 細(xì)葉香桂或川桂等樹皮的通稱, 桂皮中的活性物質(zhì)——桂皮醛和桂皮醇也對多種細(xì)菌、 真菌有抑菌效果[14,24], 但目前還沒有關(guān)于桂皮抗菌肽的報道． 本實驗提取抗菌肽時, 首先對桂皮進(jìn)行了烘干處理, 在此過程中可去除桂皮中的桂皮醛和桂皮醇等揮發(fā)性抑菌物質(zhì)． PBS萃取和硫酸銨沉淀法是經(jīng)典也是目前廣泛采用的分離和提取抗菌肽的方法[25-26], 經(jīng)10 KDa超濾管超濾后, 可去掉具有抗菌效果的酶類等蛋白, 得到小分子量的抗菌肽． 采用此法得到的桂皮抗菌肽對黑曲霉和黃曲霉均具有較好的抑菌效果, 抑菌圈直徑分別為29.08 mm和27.79 mm, 經(jīng)提取工藝優(yōu)化后, 抑制黃曲霉的效果提升了21.41%, 達(dá)到33.74 mm, 結(jié)果可對下一步桂皮抗菌肽的結(jié)構(gòu)解析、 抑菌機(jī)理、 開發(fā)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考．

綜上, 植物源抗菌肽是一種綠色安全的生物資源, 廣泛分布于植物籽實及根莖部位． 合理利用植物源抗真菌肽, 可減少糧食作物的霉菌污染． 對這些AMPs資源的挖掘, 可為擴(kuò)大生物防霉劑和飼料添加劑來源提供思路．