哮喘寧顆粒干預心理應激哮喘大鼠應激狀態及肺通氣功能作用機制研究

李長安,崔紅生,班承鈞

(1.北京中醫藥大學東直門醫院,北京 100700;2.北京中醫藥大學第三附屬醫院,北京 100029)

支氣管哮喘是由多種炎性細胞引起的慢性氣道炎癥性疾病,其患病率、病死率與心理應激、情志等密切相關[1]。精神障礙,尤其是焦慮和抑郁,在哮喘患者中普遍存在,并與哮喘控制不佳、藥物依從性差、生活質量差相關[2-3]。對于伴有焦慮或抑郁癥的哮喘患者,現無有效的藥物和非藥物治療方法,認知行為治療、身心療法、放松療法和生物反饋療法在臨床均未取得滿意療效。

情志與哮喘關系密切,情志不遂可促使哮喘的發生、發展;而哮喘得不到有效控制則易引起心理疾病;兩者互為因果,形成惡性循環,促進疾病進展。肝主疏泄功能在機體心理應激中起著決定性的作用。武維屏等[4]認為,氣郁、氣逆是哮喘發病之中心環節,氣郁不解,氣逆不降,哮喘難平。因此,調肝理肺、理氣降逆為治療哮喘重要法則,哮喘寧顆粒組方嚴謹,調肝與理肺并行,臨床療效顯著,在防治心理因素所誘發的哮喘方面具有極大的優勢。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:SPF級雄性SD大鼠,鼠齡4～5周,體重(120±10)g,動物許可證號:SCXK(京)2020-0001,購自維通利華實驗動物技術有限公司。室溫(22±1)℃,空氣濕度40%～50%,予常規飼料及飲用水,實驗環境安靜舒適;本研究經北京中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會審核通過,倫理批號:BUCM-4-2020122303-4150。

1.1.2 實驗試劑與儀器:卵蛋白(批號A5503-5G,Sigma公司);氫氧化鋁佐劑(批號PI77161,Thermo scientific公司);戊巴比妥鈉(批號57-33-0,Sigma公司)。自制60 cm×60 cm×40 cm玻璃霧化箱(北京有機玻璃廠);可調式多孔束縛筒(型號JNT-GQ5,冀諾泰公司);空氣壓縮霧化吸入器(型號NE-C900,歐姆龍);動物肺功能檢測儀(AniRes動物肺功能分析系統,北京中醫藥大學科研實驗中心提供)。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物制備:①哮喘寧顆粒(京藥制字Z20053078,規格12 g/袋),藥物組成:柴胡、黃芩、清半夏、白芍、葶藶子、前胡各10 g,地龍、鉤藤、全瓜蔞、丹參各15 g,炙麻黃、防風各6 g,由北京中醫藥大學東直門醫院制劑室生產。用法:1袋/次,2次/d,口服。②吸入用布地奈德混懸液(批準文號H20140474,規格1 mg/2 ml),2 mg/次,2次/d,霧化吸入。要求所有實驗用藥皆用同一批號藥物。參考《藥理實驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算》[5]計算出大鼠哮喘寧顆粒用藥劑量為2.18 g/(kg·d),普米克令舒用藥劑量為363.11 μg/(kg·d)。

1.2.2 動物分組與給藥:將32只大鼠適應性喂養3 d后,采用隨機數字表法將大鼠分為正常組、應激哮喘組、普米克令舒組及哮喘寧組,每組8只。參考文獻制備[6-8]心理應激哮喘大鼠模型;為避免各組大鼠因給藥途徑不同所引起的軀體應激反應的差異,故從實驗第15天開始每組大鼠每日激發前2 h采取灌胃和霧化吸入方式給藥。①應激哮喘組:于實驗第1天大鼠腹腔注射含卵蛋白、氫氧化鋁佐劑的混合液1 ml致敏。2周后每日霧化吸入1%OVA(流量2 ml/min)20 min激發哮喘,連續14 d。從實驗第1天開始將大鼠置入束縛筒內束縛制動1次,要求動物無身體的擠壓和疼痛感,能從仰臥位轉為俯臥位,但頭尾不能翻轉,束縛期間禁食禁水。每日開始時間及束縛制動的持續時間不同,第1天為2 h,其后每次增加10 min,連續28 d。實驗第15天開始每日激發前2 h均予0.9%氯化鈉溶液灌胃和霧化吸入。②普米克令舒組:在心理應激哮喘大鼠模型的基礎上,從實驗第15天開始每日激發前2 h給予普米克令舒363.11 μg/kg霧化吸入,1次/d,30 min/次,連續14 d;同時每日給予0.9%氯化鈉溶液灌胃。③哮喘寧組:在心理應激哮喘大鼠模型的基礎上,從實驗第15天開始每日激發前2 h給予哮喘寧顆粒2.18 g/kg灌胃,1次/d,連續14 d。④正常組:致敏和激發均以0.9%氯化鈉溶液代替,但不做束縛刺激。每日激發前2 h均予0.9%氯化鈉溶液灌胃和霧化吸入。

1.2.3 各組大鼠宏觀表征比較:包括大鼠體重、飲食量及呼吸頻率變化等。

1.2.4 各組大鼠行為學變化比較:包括蔗糖水偏嗜實驗、懸尾實驗、曠野實驗等。①蔗糖水偏嗜實驗:實驗前,訓練實驗大鼠適應含糖飲水。每籠同時并排放置2個飲水瓶,第1個24 h內,每瓶均裝有1%蔗糖水;隨后的24 h,1瓶裝1%蔗糖水,另1瓶裝純凈水。經過24 h禁水禁食后,開始進行蔗糖水偏嗜實驗:即同時給予每只大鼠事先定量好的兩瓶水,1瓶為1%蔗糖水,1瓶為純凈水,水瓶左、右隨機放置,1 h后取走并稱重。糖水偏好程度=糖水消耗量/總液體消耗量×100%。②懸尾實驗:操作者握住大鼠的尾根部1/3處,將大鼠頭部向下,固定在懸尾實驗架上,由兩位實驗人員進行操作和記錄,每只大鼠觀察3 min,主要觀察大鼠不動時間和掙扎次數。不動時間指大鼠處于完全放松靜止不動狀態的累積時間。掙扎次數指大鼠由倒掛向上翻轉的總次數。③曠野實驗:用open-field test法進行測試。自制敞箱,底面為80 cm×80 cm正方形,劃分為25等格,箱高40 cm。以大鼠穿越底面塊數(四爪均進入的方格方可計數)為水平運動得分,以直立次數(雙足離開底面至放下為1次活動)為垂直運動得分。保持環境安靜,調節合適光線,每次測試前清潔敞箱,去除異味。分別在造模前、取材前1 d由兩位評定者評定大鼠在3 min內的運動情況。

1.2.5 各組大鼠肺通氣功能比較:大鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,從環狀軟骨下第2～3個U形透明軟骨間切一橫形切口,進行氣管切開插管,連接動物肺功能儀,并將大鼠放入密封體描箱中進行肺通氣功能測定。觀察大鼠呼氣峰流速(PEF)、呼氣中期峰流速(FEF25%～75%)、用力呼氣時間(FET)、FEV0.3/FVC、平均吸氣氣道阻力(Ri)、平均呼氣氣道阻力(Re)等指標。

1.2.6 各組大鼠肺組織病理學觀察:從肺門至肺邊緣處橫切,取2～3 cm肺標本,進行石蠟包埋和切片,然后進行HE染色,觀察支氣管和肺組織病理形態。

2 結 果

2.1 各組大鼠宏觀表征比較

2.1.1 各組大鼠體重比較:見表1。干預第14、21、28天,應激哮喘組大鼠體重明顯低于正常組(均P<0.05);與應激哮喘組比較,哮喘寧組大鼠干預第28天體重增加明顯(P<0.05);與普米克令舒組比較,哮喘寧組大鼠干預第28天體重輕度增加,差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠體重比較(g)

2.1.2 各組大鼠飲食量比較:見表2。干預第14天,應激哮喘組大鼠飲食量低于正常組(P<0.05);與應激哮喘組相比較,哮喘寧組干預第21、28天飲食量明顯增加(均P<0.05)。

表2 各組大鼠飲食量比較(g)

2.1.3 各組大鼠呼吸頻率比較:見表3。在干預第21、28天,應激哮喘組、哮喘寧組、普米克令舒組大鼠激發前、后呼吸頻率明顯高于正常組(均P<0.05);與應激哮喘組比較,哮喘寧組、普米克令舒組激發前呼吸頻率無明顯變化(均P>0.05),激發后呼吸頻率明顯減少(均P<0.05)。

表3 各組大鼠呼吸頻率比較(次/min)

2.2 各組大鼠行為學比較

2.2.1 各組大鼠蔗糖水偏嗜實驗比較:見表4。在干預第7、22、28天,應激哮喘組大鼠糖水消耗量及糖水偏好程度明顯低于正常組(均P<0.05);與應激哮喘組大鼠相比,干預第22、28天,哮喘寧組、普米克令舒組大鼠糖水消耗量及糖水偏好程度明顯增高(均P<0.05);干預第28天,哮喘寧組大鼠糖水偏嗜程度高于普米克令舒組(P<0.05)。

表4 各組大鼠蔗糖水偏嗜實驗比較

2.2.2 各組大鼠懸尾實驗比較:見表5。在干預第28天,應激哮喘組大鼠翻動次數明顯低于正常組(P<0.05),應激哮喘組、哮喘寧組、普米克令舒組大鼠靜止時間明顯高于正常組(均P<0.05);與應激哮喘組比較,哮喘寧組大鼠翻動次數明顯增加,靜止時間明顯增加(均P<0.05)。

表5 各組大鼠懸尾實驗比較

2.2.3 各組大鼠曠野實驗比較:見表6。在干預第28天,應激哮喘組和普米克令舒組大鼠水平運動、垂直運動得分明顯低于正常組(均P<0.05)。與應激哮喘組比較,哮喘寧組小鼠垂直運動得分明顯增加(P<0.05)。

表6 各組大鼠曠野實驗比較(分)

2.3 各組大鼠肺通氣功能指標比較 見表7。干預第28天,應激哮喘組FEF25%～75%、FEV0.3/FVC明顯低于正常組,FET、Ri明顯高于正常組(均P<0.05);與應激哮喘組比較,哮喘寧組及普米克令舒組大鼠Ri、Re減低(均P<0.05);PEF、FEF25%～75%、FEV0.3/FVC輕度增高,FET輕度減低,但差異無統計學意義(均P>0.05)。

表7 各組大鼠肺通氣功能指標比較

2.4 各組大鼠肺組織病理學表現 見圖1。正常組大鼠支氣管被覆單層柱狀上皮,管腔內未見黏液及脫落上皮細胞,管周未見炎細胞浸潤,支氣管上皮及管壁平滑肌組織未見增生;肺泡間隔未見增寬,無或有少數淋巴細胞浸潤。應激哮喘組大鼠可見支氣管黏膜上皮杯狀細胞增多,管腔內有分泌物,管壁平滑肌增生,管周淋巴細胞呈散在及灶片狀浸潤,肺泡間隔增寬,有淋巴細胞為主的炎細胞浸潤,靠近胸膜處肺泡明顯擴張,肺泡間隔變窄斷裂,擴張的肺泡融合形成較大的含氣囊腔,呈肺氣腫改變,肺泡壁毛細血管受壓。普米克令舒組大鼠支氣管黏膜上皮少見杯狀細胞,上皮輕度增生,腔內未見明顯分泌物,管壁平滑肌稍增生,管周有散在淋巴細胞浸潤,肺泡壁有淋巴細胞為主的炎細胞浸潤,病變程度和咳喘寧組類似。哮喘寧組大鼠支氣管黏膜上皮杯狀細胞較應激哮喘組減少,腔內未見明顯分泌物,支氣管管壁平滑肌增生,管周有散在淋巴細胞浸潤,肺泡間隔增寬,有淋巴細胞為主的炎細胞浸潤。

圖1 各組大鼠肺組織病理學表現(HE染色,×100)

3 討 論

哮喘是典型的心身疾病,其發生、發展與情志因素關系密切;全球哮喘防治創議(GINA)指出焦慮及抑郁為哮喘重要并發癥,對哮喘控制至關重要。因此,改善哮喘患者焦慮、抑郁水平對于哮喘控制有著重要意義。既往研究表明,慢性心理應激可以較好地模擬情志異常的綜合病理過程,慢性心理應激可明顯加重哮喘氣道炎癥[9-10],但尚無有效藥物或非藥物治療措施可顯著改善氣道炎癥,減少心理應激哮喘發作[11]。

中醫理論認為,“肝主疏泄”功能在機體心理應激反應中起著決定性的作用。肝的疏泄功能正常,則氣機調暢,氣血調和,心情舒暢,情志和合。反之,若情志失和則肝郁而不達,氣血失調,臟腑功能紊亂而產生各種心身疾患[12]。故《素問·舉痛論》曰:“百病生于氣也”,《丹溪心法》曰:“氣血沖和,萬病不生,一有怫郁,諸病生焉”。肝肺生理相關,病理相因,支氣管哮喘從肝論治既符合中醫傳統理論,又具有現代醫學科學基礎,是治療哮喘的重要治法之一[13]。基于肝主疏泄、肝肺相關理論,武維屏認為肝失疏泄,氣機郁滯,肝肺失和為哮喘發作的中心環節,提出調肝理肺法治療支氣管哮喘,并在長期臨床實踐過程中對其內涵及療效機制做了全面闡釋和系統研究[14-15]。哮喘寧顆粒是調肝理肺法的代表方藥,臨床療效較好。既往臨床研究表明[16],哮喘寧治療支氣管哮喘的控顯率和總有效率分別為63.33%和90.00%。

本研究結果顯示哮喘寧顆粒可明顯緩解應激哮喘組大鼠呼吸氣促及應激狀態;哮喘寧組大鼠體重及飲食明顯增加。曠野實驗、懸尾實驗及蔗糖水偏嗜實驗是臨床研究中評價心理應激的常用行為指標[17]。高宗等[18]通過曠野實驗水平運動得分、糖水消耗量等得出半夏厚樸湯對卒中后抑郁大鼠有改善作用;與此相似,本研究結果提示哮喘寧組大鼠水平運動、垂直運動、蔗糖水偏嗜、掙扎次數均明顯增加,懸尾實驗不動時間明顯降低;且隨著用藥時間的延長,一般在治療3周后大鼠應激水平可明顯改善;提示哮喘寧顆粒可改善模型大鼠心理應激,減輕焦慮、抑郁,隨著治療時間延長,效果可能更加明顯。

哮喘為慢性氣道炎癥性疾病,哮喘發作時氣道分泌物增加、氣道痙攣,反復發作則氣道平滑肌增生,均會導致氣道阻力增大,喘憋明顯。研究認為,中藥方劑可通過抑制炎性通路,減輕炎癥細胞在肺組織中的浸潤與聚集,從而控制哮喘大鼠氣道炎性反應,達到治療支氣管哮喘的目的[19-20]。應激也可導致氣道阻力增加,炎性分泌物增多,氣道反應性增高,加重哮喘癥狀[7]。因此緩解應激癥狀,改善氣道阻力,可緩解哮喘癥狀。本研究結果顯示,與應激哮喘組大鼠比較,哮喘寧組及普米克令舒組氣道阻力Re、Ri降低,Ri下降更明顯,提示哮喘寧顆粒及普米克令舒對氣道阻力,特別是中心氣道的阻力改善有較好的治療作用。哮喘寧組及普米克令舒組大鼠FEV0.3/FVC、FEF25%～75%、PEF相較于應激哮喘組輕度升高,提示哮喘寧顆粒及普米克令舒對于模型大鼠小氣道的改善作用偏弱。臨床研究顯示,中醫藥治療支氣管哮喘可顯著改善患者肺功能和通氣情況,并降低氣道炎癥[21];哮喘嚴重程度與肺通氣功能呈明顯負相關,與血清炎癥水平呈明顯正相關[22],這與本研究結果相似。本研究組織病理學觀察顯示,相較于應激哮喘組,哮喘寧組大鼠肺組織炎癥細胞浸潤明顯減少。

綜上所述,哮喘寧顆粒可緩解心理應激哮喘大鼠應激狀態,改善氣道平滑肌痙攣,降低氣道阻力,減輕氣道炎癥浸潤,改善肺通氣功能。