祛濕化痰方聯合針刺治療脾虛痰濕型多囊卵巢綜合征療效研究

滕 婧,楊 柳

(1.湖北省中醫院,湖北 武漢 430061;2.湖北中醫藥大學附屬醫院,湖北 武漢 430061;3.湖北省中醫藥研究院,湖北 武漢 430074)

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種比較常見的女性生殖系統功能異常性疾病[1]。目前在全世界生育期女性中的發病率為5%～20%[2]。PCOS臨床表現包括月經先后無定期、月經稀少或閉經、毛發增多、痤瘡、體重增加等癥狀,常伴發高血壓、糖尿病等基礎疾病[3]。研究提示,PCOS發病機制與炎癥反應存在關聯,腫瘤壞死因子等炎癥指標升高會影響性激素水平,甚至抑制排卵[4-5]。PCOS是導致不孕的常見原因,其中70%無排卵型不孕均由該病引起,對年輕女性的生活及心理狀態造成了極大的影響[6]。目前西醫多采用促排卵、抗雄激素等藥物治療,能快速改善上述癥狀,但長時間使用有較多不良反應[7]。《多囊卵巢綜合征相關不孕治療及生育保護共識》[8]認為針刺療法具有調月經、促排卵作用,可用于治療PCOS,然而單獨使用療效有限。中醫認為痰濕是引起PCOS的重要原因[9],本科室據此擬定祛濕化痰方聯合針刺治療PCOS。微小RNA是體內的一種小分子RNA,其中血清miR-223、miR-181a能調節炎癥反應,在肺炎、膿毒血癥等多種炎癥性疾病中發揮重要作用[10-11],但二者與PCOS的關系尚未報道。因此,本研究擬探討祛濕化痰方聯合針刺治療脾虛痰濕型PCOS的療效,通過多因素Logistic回歸和ROC曲線分析miR-223、miR-181a對PCOS治療后能否妊娠的預測價值,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2021年12月于湖北省中醫院就診的90例PCOS患者,隨機分為對照組和觀察組,每組45例。對照組平均年齡(29.12±4.18)歲,平均體重指數(23.75±5.31)kg/m2,平均病程(3.37±0.52)年。觀察組平均年齡(29.43±4.56)歲,平均體重指數(23.96±5.13)kg/m2,平均病程(3.48±0.56)年。兩組年齡、體重指數、病程比較差異無統計學意義(均P>0.05)。所有患者均在知情的情況下參加本研究,并簽署知情同意書。本研究已通過醫院倫理委員會審批,批準號:HBZY2019-C19-01。西醫診斷標準參照《多囊卵巢綜合征中國診療指南》[12]制訂:①月經稀發、閉經或不規則子宮出血;②存在高雄激素血癥;③超聲監測無排卵出現,卵巢見多囊樣形態,雙側卵巢內卵泡數超過12個或卵巢體積超過10 ml。符合①項及②③中任何一項,即可診斷。中醫癥候標準參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[13]中不孕脾虛痰濕證的診斷標準:①月經量少、稀發或閉經;②食欲不振,腹脹、腹瀉,大便黏膩;③帶下量多色白,質黏;④體態肥胖、乏力、疲倦;⑤舌淡胖,邊有齒痕,苔白膩,脈滑。具有①項及②③④⑤其中兩項,即可診斷。病例納入標準:符合上述西醫診斷及中醫證型辨證標準;年齡20～40歲;已婚,有正常性生活且未避孕,1年內未妊娠;6個月內無生育要求。排除標準:嚴重心、肝、腎等臟器功能不全;合并自身免疫性疾病;合并嚴重的細菌、真菌感染;對本研究藥物過敏;合并傳染病或精神類疾病;合并其他嚴重的生殖系統疾病;入組前3個月使用糖皮質激素或性激素類藥物。

1.2 治療方法

1.2.1 對照組:口服炔雌醇環丙孕酮片(達英-35,批號J20140114)口服,每日1次,每次1片。自月經周期第1天開始口服,共服用21 d,后停藥7 d,再開始下一周期;無月經周期者任意選擇一天開始口服,共服用21 d。治療3個月經周期。

1.2.2 觀察組:在對照組基礎上加用祛濕化痰方聯合針刺治療。祛濕化痰方組成:麩炒蒼術15 g,姜半夏、茯苓、丹參、皂角刺各12 g,黃芩、黃柏各10 g,陳皮9 g,甘草6 g。由醫院制劑室采用全自動煎藥機水煎、濃縮至每袋300 ml,每日2次,每次1袋,每月月經干凈開始服用。以1個月經周期為1個療程,共治療3個療程。針刺治療具體如下:取穴以子宮、歸來、中極、關元、足三里、三陰交為主穴,配穴包括血海、脾俞、豐隆;針具采用0.25 mm×40 mm華佗牌一次性無菌針灸針,針法嚴格按照無菌操作要求,采用平補平瀉法,進針至皮下一定深度,其中子宮、歸來、中極、關元穴的進針角度與水平面呈30°,深度小于1.2 cm,用基本手法得氣,以患者能忍受為限。捻針角度為180°～360°,頻率為90～120次/min,施針后留針30 min。每周治療3次,以1個月經周期為1個療程,共治療3個療程。

1.3 觀察指標 ①性激素水平:在月經來潮后第3天抽取空腹靜脈血5 ml,離心取血清。采用免疫分析儀檢測卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)、睪酮(Testosterone,T)水平。②卵巢體積:所有患者在治療前后,均于排卵日采用彩色多普勒超聲診斷儀經陰道檢查卵巢體積。③中醫癥候積分:記錄患者治療前后的食欲不振、腹脹、便溏、神疲乏力癥狀,將病情嚴重程度分為無、輕、中、重四級,對應分數依次為0、1、2、3分,分值越高提示病情越重。④炎癥因子水平:在月經來潮第3天抽取空腹靜脈血5 ml,離心取血清。采用酶聯免疫試劑盒檢測白介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6、TNF-α水平。準備酶標板,每孔分別滴加25 μl血清和標準品,37 ℃孵育15 min,再滴加100 μl酶底物,反應20 min,加入顯色液,避光15 min,最后滴加終止液。將酶標板放入酶標儀中,采用450 nm波長檢測溶液吸光度,計算IL-1β、IL-6、TNF-α水平。⑤血清miR-223、miR-181a水平:所有患者在治療前后,均于月經周期第3天抽取空腹靜脈血5 ml,離心10 min,提取上層血清。采用miRNA提取分離試劑盒提取血清中miRNA,采用miRNA的cDNA反轉錄試劑盒將miRNA反轉錄為cDNA。根據miRNA熒光定量檢測試劑盒說明書配制反轉錄體系,將配制好的體系放入的實時熒光定量PCR儀進行擴增。反應程序為:95 ℃加熱1 min,進行40個循環,每個循環包括95 ℃變性30 s,58 ℃退火40 s,72 ℃延伸30 s;最后72 ℃加熱5 min充分反應。引物由上海生物工程公司合成,序列如下。miR-223正向:5’-ACTGTCGACTAAAGTCGGTGAC-3’,反向:5’-GCGTACTACAGCGTAGATG-3’;miR-181a正向:5’-GACGACTCTAGAAGTCGGTC-AG-3’,反向:5’-CAGCCCTACTGAAGGCTAC-3’;內參采用U6基因,正向:5’-GACTGATGCTCTGGCCGA-3’,反向:5’-GTCGGGTCGAAGCATGG-3’。采用2-ΔΔCt法計算miR-223、miR-181a的表達量。⑥妊娠率:治療結束后每3個月隨訪1次,共隨訪1年,記錄患者治療后1年內妊娠情況,計算每組妊娠率。

2 結 果

2.1 兩組治療前后性激素水平比較 見表1。治療前,兩組FSH、LH、T水平相比差異無統計學意義(均P>0.05)。治療后,兩組FSH、LH、T水平低于治療前,且觀察組FSH、LH、T水平低于對照組(均P<0.05)。

表1 兩組治療前后性激素水平比較

2.2 兩組治療前后卵巢體積比較 見表2。治療前,兩組患者卵巢體積相比差異無統計學意義(P>0.05)。治療后,兩組卵巢體積小于治療前,且觀察組卵巢體積小于對照組(均P<0.05)。

表2 兩組治療前后卵巢體積比較(cm3)

2.3 兩組治療前后中醫癥候積分比較 見表3。治療前,兩組食欲不振、腹脹、便溏、神疲乏力癥候積分相比差異無統計學意義(均P>0.05)。治療后,兩組患者食欲不振、腹脹、便溏、神疲乏力癥候積分低于治療前,且觀察組食欲不振、腹脹、便溏、神疲乏力積分低于對照組(均P<0.05)。

表3 兩組治療前后中醫癥候積分比較(分)

2.4 兩組治療前后IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 見表4。治療前,兩組IL-1β、IL-6、TNF-α水平相比差異無統計學意義(均P>0.05)。治療后,兩組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于治療前,且觀察組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于對照組(均P<0.05)。

表4 兩組治療前后IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較(ng/L)

2.5 兩組治療前后miR-223、miR-181a水平比較 見表5。治療前,兩組患者miR-223、miR-181a水平相比差異無統計學意義(均P>0.05)。治療后,兩組miR-223水平低于治療前,miR-181a水平高于治療前(均P<0.05);且觀察組miR-223水平低于對照組,miR-181a水平高于對照組(均P<0.05)。

表5 兩組治療前后miR-223、miR-181a水平比較

2.6 血清miR-223、miR-181a與炎癥因子的相關性分析 見表6。血清miR-223水平與IL-1β、IL-6、TNF-α水平呈正相關(P<0.01),血清miR-181a水平與IL-1β、IL-6、TNF-α水平呈負相關(P<0.01)。

表6 血清miR-223、miR-181a與炎癥因子的相關性分析

2.7 兩組患者妊娠率比較 1年后隨訪,觀察組21例妊娠,妊娠率為46.67%,對照組11例妊娠,妊娠率為24.44%。兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.8 治療后未妊娠的多因素Logistic回歸分析 見表7。以治療后1年內是否妊娠為因變量,以miR-223、miR-181a、IL-1β、IL-6、TNF-α為自變量進行多因素Logistic回歸分析,結果顯示,miR-223、IL-6為治療后1年內未妊娠的獨立危險因素(OR=2.184,3.180,P<0.01),miR-181a為治療后未妊娠的獨立保護因素(OR=0.268,P<0.01)。

表7 治療后未妊娠的多因素Logistic回歸分析

2.9 血清miR-223、miR-181a水平對治療后未妊娠的預測價值 見表8(圖1)。繪制血清miR-223、miR-181a水平預測治療后1年內未妊娠的受試者ROC,并計算AUC,結果顯示,miR-223、miR-181a及二者聯合預測的AUC分別為0.837、0.811、0.934,二者聯合預測優于各自單獨預測效能(Z=7.168、9.376,P<0.001)。

3 討 論

PCOS是導致女性不孕的一種常見疾病,目前認為發病機制與機體炎癥狀態存在密切關聯[14-15]。PCOS患者血清存在細胞因子如IL-1β、IL-6以及TNF-α等水平的異常表達,這使得卵巢功能和性激素水平紊亂,抑制卵泡進一步發育[16-17]。IL-6由184個氨基酸構成,由成纖維細胞、巨噬細胞、淋巴細胞生成并分泌至細胞外,進而遏制Tyr磷酸化,降低PIP3激酶活力,激活NF-κB通路,加劇炎癥反應[18]。IL-1β通過影響MCP-1等趨化因子,促進基質金屬蛋白酶基因表達,從而發揮促炎效應[19]。目前西醫常用的藥物如克羅米芬、達英-35等無法改善機體炎癥狀態,且有不良反應,影響其臨床療效[20]。

PCOS屬于中醫學“癥瘕”“不孕”范疇,中醫認為其病因包括先天腎精不足、脾主運化失調、肝失疏泄等,目前臨床上常見證型為脾虛痰濕證[21-22]。PCOS病機為脾主后天之本,脾臟運化功能虛弱,則食欲不振;飲食水谷入于脾胃,轉化水谷精微不足,易致腹脹、便溏;脾虛則后天之精不能布散四肢,則四肢乏力;精微不能上承入腦,則神疲倦怠;脾虛不能轉輸水液,則痰濕內生,濕阻下焦,累及胞宮,使其膏脂增加,同時脾虛致胞宮水谷精微減少,故而難以受孕[23-24]。因此,治療應以益氣健脾、祛濕化痰為原則[25]。本研究所使用的祛濕化痰方由蒼術、半夏、茯苓、丹參、皂角刺、黃芩、黃柏、陳皮、甘草等藥物組成。方中蒼術燥濕健脾,半夏降逆祛痰,茯苓健脾利濕,丹參活血調經,皂角刺行氣消腫,黃芩燥濕安胎,黃柏清熱燥濕,陳皮健脾燥濕化痰,甘草健脾益氣。諸藥合用,共奏健脾祛濕化痰、調經助孕之功效。本研究結果表明,觀察組治療后的中醫癥候積分低于對照組,提示祛濕化痰方聯合針刺能有效改善PCOS癥狀。

針刺治療PCOS能發揮調月經、促排卵的作用[26]。本研究取穴以子宮、歸來、中極、關元、足三里、三陰交為主穴,以血海、脾俞、豐隆為配穴。其中子宮清熱利濕溫腎,歸來益氣調經,中極滋腎調經,關元補氣利尿,足三里健脾化痰,三陰交益氣健脾補腎,血海調經統血,脾俞健脾化濕,豐隆化痰開竅?，F代研究發現,針刺可以抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,減少卵泡閉鎖,促進卵泡發育成熟[27]。針刺可減少血清IL-6和內脂素含量,恢復受高雄激素影響的卵巢形態及功能[28]。鐘毅征等[29]發現,針刺能上調卵巢組織lncRNA MEG3表達,降低AKT水平,從而抑制炎癥反應,恢復性激素水平及卵巢功能。本研究結果表明,觀察組治療后FSH、LH、T、卵巢體積低于對照組。上述結果提示,祛濕化痰方聯合針刺能有效改善性激素水平,恢復子宮及卵巢生理功能。

PCOS相關的炎癥反應由多種細胞因子參與調節,包括IL-1、IL-6和TNF-α。IL-1β是一種由Th2細胞產生的炎性細胞因子,在促進組胺生成和引發遲發型變態反應方面起到重要作用。IL-6由單核細胞和內皮細胞產生,反映了PCOS的嚴重程度。TNF-α是一種小分子蛋白質,由巨噬細胞分泌,在特異性免疫應答和炎癥反應中起關鍵作用。研究發現,治療后患者IL-1β、IL-6和TNF-α水平有所下降,而治療組的下降幅度明顯高于對照組。提示祛濕化痰方聯合針刺可能通過降低IL-1β、IL-6和TNF-α水平抑制炎癥反應。

miRNA是一種長度22 nt的小分子核酸,具有影響基因表達轉錄、調節多種生理過程的作用[30]。miR-223在機體的血液、肝臟、腸道等多種組織器官中均有表達,其基因來源于X染色體,長度為22 nt,位于莖環結構的3’處,啟動區域在多個物種間具有高度保守性[31]。韓超等[32]發現,膿毒癥患者外周血miR-223水平升高,且miR-223水平與血清PCT、CRP水平呈正相關,miR-223能較好診斷早期膿毒癥,評估炎癥反應程度。郭云波等[33]研究表明,老年重癥肺炎患者血清miR-223表達上升,與TNF-α水平呈正相關。miR-181a屬于保守的miRNA家族,其可通過3’非編碼區與特定基因序列結合,調節多種細胞功能[34]。研究表明,miR-181a通過抑制PIAS1,降低IL-6、TNF-α等細胞因子水平,從而阻斷胰腺腺泡細胞凋亡,改善胰腺炎癥狀[35]。張瑜等[36]發現,急性胰腺炎患者血清miR-181a低表達,輕、中、重癥三組患者miR-181a水平逐漸降低,且水平與IL-6呈負相關。本研究結果表明,miR-223與IL-1β、IL-6、TNF-α水平呈正相關,miR-181a與IL-1β、IL-6、TNF-α水平呈正相關,觀察組治療后的miR-223水平低于對照組,miR-181a水平高于對照組,提示祛濕化痰方聯合針刺可能是通過降低miR-223水平、升高miR-181a水平,從而抑制下游炎癥反應。

綜上所述,祛濕化痰方聯合針刺能調節PCOS患者性激素水平,恢復子宮內膜及卵巢功能,提高中醫癥候積分,抑制炎癥反應,降低血清miR-223水平,升高miR-181a水平,miR-223、miR-181a均是PCOS治療后1年內未妊娠的獨立影響因素,二者對治療后未妊娠有較好的預測價值。