蝙蝠葛蘇林堿調控Akt/mTOR信號通路對膠質瘤細胞增殖及自噬的影響*

殷海棠，文志鵬，楊繼紅，李明，李琴，趙青青，肖堅

（1.貴州醫科大學 藥學院，貴州 貴陽 550025； 貴州醫科大學附屬醫院2.藥學部，3.GCP中心，4.臨床醫學研究中心，貴州 貴陽 550004；5.中南大學湘雅醫院 藥學部，湖南 長沙 410008）

膠質瘤是一種常見的成人中樞神經系統原發性惡性腦瘤，具有侵襲性強、病死率高、預后差等特點，患者生存期僅有12～15 個月，5 年生存期約為5.5%[1]。膠質瘤治療方式主要包括手術、放射治療和化學藥物治療[2]。替莫唑胺（Temozolomide, TMZ）是臨床治療膠質瘤的一線藥物，不良反應大，選擇性差，療效不理想[3]。因此，探尋新的抗膠質瘤藥物對改善患者預后有一定意義。

自噬是在一系列信號通路調控下細胞利用溶酶體降解自身細胞質蛋白和受損細胞器的生物學過程[4]。自噬過程一般包括自噬小泡成核、內膜擴張、自噬小體形成、自噬小體與溶酶體融合、底物降解5 個階段。近年來研究表明，自噬對多種腫瘤發生、發展有重要調控作用，抑制自噬可以阻礙包括膠質瘤在內多種腫瘤的發生[5]。因此，以自噬為靶點探索新的膠質瘤治療分子機制，可能為膠質瘤治療提供新的方向。蝙蝠葛蘇林堿（Daurisoline, DAS）是從中藥蝙蝠葛根莖中提取的四氫異喹啉類天然生物堿[6]。DAS 具有豐富的藥理作用，被用于癲癇[7]、心血管[8]、腫瘤[9]等疾病的研究與治療。近年來研究發現，DAS 具有良好的抗腫瘤活性，但其在膠質瘤中的作用尚未明確。本研究旨在探索DAS 抗膠質瘤的作用及其潛在分子生物學機制，為闡明DAS抗膠質瘤的藥理作用提供基礎與理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人腦膠質瘤細胞系U251 和U87（中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所）。DAS（上海藍木化工有限公司），CCK-8 試劑（北京蘭杰柯科技有限公司），胎牛血清（美國Thermo Fisher Scientific 公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）、4%多聚甲醛、結晶紫染色液、RIPA Lysis Buffer RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、Edu 試劑盒、BeyoECL Plus（超敏ECL 化學發光液）（上海碧云天生物技術有限公司），細胞凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司），Bax、Bcl-2、p-Akt（Ser473）、p-mTOR（Ser448）、Akt、mTOR、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）標記的山羊抗鼠IgG 及HRP 標記的山羊抗兔IgG（武漢三鷹生物技術有限公司），LC3B、SQSTM1/P62 抗體（美國CST 公司）。

酶標儀、5% 二氧化碳培養箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司），倒置熒光顯微鏡（德國ZEISS公司），透射電子顯微鏡（日本JEOL 公司），流式細胞儀（美國Beckman 公司），電泳儀（美國Bio-Rad 公司），細胞培養超凈臺（新加坡Esco 公司），化學發光成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 復蘇U251 和U87 細胞，置于T25培養瓶中，加入含10% 胎牛血清的高糖培養基（dulbecco's modified eagle medium, DMEM），移入37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養。待細胞匯合度達80%～90%按1∶3 傳代或冷凍保存。取培養3 代后細胞進行后續實驗。

1.2.2 細胞活力測定 將細胞以1×103個/孔的密度接種于96 孔板中，設置對照組、2.5 μmol/L DAS 組、5.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L TMZ 組。每組設置3 個復孔，培養72 h 后，用含10 μL CCK-8 的100 μL DMEM 替換原培養基，37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養1 h，使用酶標儀在450 nm 處測光密度（optical density, OD）值。

1.2.3 Edu 實驗 將細胞以1×105個/孔的密度接種于6 孔板中，用不同濃度的DAS 處理72 h 后棄掉培養液，PBS 洗滌3 次，4%多聚甲醛固定15 min，0.3% Trition X-100 孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）洗滌3 次，按試劑盒說明書進行操作，加入Hoechst 33342 溶液避光孵育10 min，倒置熒光顯微鏡拍照，用Image J 軟件計算陽性細胞。

1.2.4 克隆實驗 將細胞以1×103個/孔的密度接種于6 孔板中，設置3 組：對照組、5.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L DAS 組。在37 ℃、5%二氧化碳培養箱中持續培養2 周，4%（v/v）多聚甲醛固定細胞20 min，0.1%（w/v）結晶紫染色10 min，PBS 洗滌3 次，對6 孔板進行拍照，用Image J 軟件計算各組的克隆形成數。

1.2.5 細胞凋亡 將細胞計數后按2×105個/孔接種于6 孔板中。設置3 組：對照組、5.0 μmol/L DAS組、10.0 μmol/L DAS 組。培養72 h 后，用不含EDTA的胰酶消化細胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，將沉淀用500 μL loading buffer 重懸，加入5 μL 膜聯蛋白Annevin V-FITC 和5 μL 碘化丙啶（propidium iodide, PI），暗室染色10 min，流式細胞儀檢測，通過FlowJo 分析細胞凋亡。

1.2.6 透射電鏡觀察自噬囊泡的形成 將細胞用3%戊二醛和1%四氧化鋨酸固定，丙酮脫水，812 環氧樹脂包埋，制片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色15 min 后，用透射電子顯微鏡觀察細胞自噬囊泡的形成情況。

1.2.7 Western blotting 檢測細胞相關蛋白表達 用含蛋白酶抑制劑（苯甲基磺酰氟，PMSF）的RIPA 裂解液裂解細胞，收集上清液。使用BCA 蛋白測定試劑測定蛋白濃度。SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）以1∶4（v/v）的比例加入蛋白上清樣品，100 ℃金屬浴10 min。將蛋白質加入到SDS-PAGE 凝膠泳道電泳，蛋白印跡轉移至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別用一抗GAPDH（1∶5 000）、Bcl-2（1∶2 000）、Bax（1∶5 000）、p62（1∶1 000）、LC3B（1∶1 000）、Akt（1∶5 000）、p-Akt（1∶1 000）、mTOR（1∶5 000）和pmTOR（1∶2 000）在4 ℃條件下過夜孵育條帶，洗滌3 次，加入相應二抗（1∶5 000）常溫下孵育1 h，滴加ECL 化學發光液，用化學發光成像系統觀察印跡條帶，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法

數據分析采用Graph Pad Prism 8.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DAS抑制膠質瘤細胞活力

對照組、2.5 μmol/L DAS 組、5.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L DAS 組U251 和U87 細胞活力比較，經方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）。5.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L DAS 組U251 和U87 細胞活力均低對照組、2.5 μmol/L DAS 組。因此以5.0 和10.0 μmol/L DAS 作為后續研究濃度，對比DAS、TMZ對U251 和U87 細胞活力影響。見表1。

表1 4組U251和U87細胞活力比較 （%，±s）

表1 4組U251和U87細胞活力比較 （%，±s）

注 ： ?與對照組、2.5 μmol/L DAS組比較，P ＜0.05。

U87細胞100.00±0.00 85.11±3.61 60.65±4.57?34.51±5.61?151.300 0.000組別對照組2.5 μmol/L DAS組5.0 μmol/L DAS組10.0 μmol/L DAS組F 值P 值U251細胞100.00±0.00 79.06±3.67 56.24±4.71?28.22±4.92?190.300 0.000

對照組、10.0 μmol/L TMZ 組、10.0 μmol/L DAS組U251 細胞活力分別為（100.00±0.00）%、（89.19±1.98）%、（28.22±4.92）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=336.100，P=0.000）；10.0 μmol/L DAS 組細胞活力低于10.0 μmol/L TMZ 組（P＜0.05）。對照組、10.0 μmol/L TMZ 組、10.0 μmol/L DAS 組U87 細胞活力分別為（100.00±0.00）% 、（92.37±2.12）% 、（34.51±5.61）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=1397.000，P=0.000）；10.0 μmol/L DAS 組細胞活力低于10.0 μmol/L TMZ 組（P＜0.05）。DAS 在膠質瘤細胞U251 和U87 的IC50 分別為5.11 μmol/L 和6.35 μmol/L。見圖1。

圖1 DAS在膠質瘤細胞U251和U87中的IC50

2.2 DAS抑制膠質瘤細胞增殖

對照組、5.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L DAS 組U251 和U87 細胞Edu 陽性率比較，經方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，不同濃度DAS 組細胞Edu 陽性率降低（P＜0.05），且組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05），表明呈濃度依賴性。見表2 和圖2。

圖2 不同濃度DAS對細胞增殖的影響

表2 3組U251和U87細胞增殖情況比較 （±s）

表2 3組U251和U87細胞增殖情況比較 （±s）

注 ： ①與對照組比較，P ＜0.05； ②與5.0 μmol/L DAS組比較，P ＜0.05。

組別Edu陽性率/%U251細胞71.33±1.52 43.43±1.46①30.76±0.68①②784.800 0.000 U87細胞29.66±1.52 17.80±0.72①10.53±0.50①②270.200 0.000對照組5.0 μmol/L DAS組10.0 μmol/L DAS組F 值P 值克隆形成數/個U251細胞494.66±32.24 176.00±10.81①84.33±9.29①②319.000 0.000 U87細胞623.00±42.03 412.66±36.07①235.66±15.30①②102.500 0.000

對照組、5.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L DAS 組U251 和U87 細胞克隆形成數比較，經方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，不同濃度DAS 組細胞克隆形成數減少（P＜0.05），且組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05），表明呈濃度依賴性。見表2 和圖2。

2.3 DAS促進膠質瘤細胞凋亡

對照組、5.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L DAS 組U251 和U87 細胞凋亡率比較，經方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，不同濃度DAS 組細胞凋亡率升高（P＜0.05），且組間兩兩比較差異均有統計學意義（（P＜0.05），表明呈濃度依賴性。見表3 和圖3。

圖3 不同濃度DAS對細胞凋亡的影響

表3 3組U251和U87細胞凋亡率比較 （%，±s）

表3 3組U251和U87細胞凋亡率比較 （%，±s）

注 ： ①與對照組比較，P ＜0.05； ②與5.0 μmol/L DAS 組比較，P ＜0.05。

U87細胞2.46±0.87 6.39±0.60①11.63±2.2①②30.620 0.000組別對照組5.0 μmol/L DAS組10.0 μmol/L DAS組F 值P 值U251細胞2.18±0.17 6.68±0.71①12.51±1.74①②67.390 0.000

對照組、5.0 μmol/L DAS 組和10.0 μmol/L DAS組U251 和U87 細胞Bax、Bcl-2 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，不同濃度DAS 組Bax 蛋白相對表達量升高（P＜0.05），而Bcl-2 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。見表4 和圖4。

圖4 3組U251和U87細胞Bax、Bcl-2蛋白的表達

表4 3組U251和U87細胞Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較 （±s）

表4 3組U251和U87細胞Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較 （±s）

注 ： ①與對照組比較，P ＜0.05； ②與5.0 μmol/LDAS 組比較，P ＜0.05。

組別U251細胞U87細胞對照組5.0 μmol/L DAS組10.0 μmol/L DAS組F 值P 值Bcl-2蛋白0.38±0.03 0.28±0.04①0.10±0.00①②56.460 0.000 Bax蛋白0.66±0.03 0.77±0.04①0.90±0.02①②27.350 0.001 Bcl-2蛋白0.52±0.04 0.42±0.03①0.32±0.01①②29.190 0.000 Bax蛋白0.52±0.01 0.64±0.02①0.82±0.07①②29.700 0.000

2.4 DAS對膠質瘤細胞自噬的影響

對照組、5.0 μmol/L DAS 組、10.0 μmol/L DAS 組U251 和U87 細胞p62、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，不同濃度DAS 組p62、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見表5 和圖5。

圖5 3組U251和U87細胞LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白的表達

表5 3組U251和U87細胞LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白相對表達量比較 （±s）

表5 3組U251和U87細胞LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白相對表達量比較 （±s）

注 ： ①與對照組比較，P ＜0.05； ②與5.0 μmol/L DAS組比較，P ＜0.05。

組別U251細胞U87細胞對照組5.0 μmol/L DAS組10.0 μmol/L DAS組F 值P 值p62蛋白0.26±0.02 0.39±0.01①0.49±0.02①②71.260 0.000 LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白0.11±0.00 1.15±0.01①1.36±0.05①②1 104.000 0.000 p62蛋白0.28±0.06 0.64±0.11①0.95±0.14①②27.120 0.000 LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白0.10±0.00 0.50±0.03①0.68±0.08①②80.900 0.000

對照組、10.0 μmol/L DAS 組自噬囊泡分別為（2±1）和（40±8）個，經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.758，P=0.037），10.0 μmol/L 組自噬囊泡數高于對照組（P＜0.05）。見圖6。

圖6 DAS對U251細胞自噬囊泡影響（醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色）

2.5 DAS調控AKT/mTOR細胞信號通路

對照組、5.0 μmol/L DAS組、10.0 μmol/L DAS組U251和U87 細胞p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，不同濃度DAS 組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見圖7和表6。

圖7 3組U251和U87細胞p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的表達

表6 3組U251和U87細胞p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白相對表達量比較 （±s）

表6 3組U251和U87細胞p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白相對表達量比較 （±s）

注 ： ①與對照組比較，P ＜0.05； ②與5.0 μmol/LDAS組比較，P ＜0.05。

組別U251細胞U87細胞對照組5.0 μmol/L DAS組10.0 μmol/L DAS組F 值P 值p-mTOR/mTOR 0.41±0.03 0.66±0.04①0.90±0.06①②76.280 0.000 p-Akt/Akt 0.47±0.03 0.86±0.01①1.15±0.03①②413.900 0.000 p-mTOR/mTOR 0.71±0.06 0.95±0.05①1.25±0.12①②30.290 0.000 p-Akt/Akt 0.57±0.07 0.91±0.00①1.21±0.05①②112.400 0.000

3 討論

膠質瘤是發生率和病死率均排在首位的中樞神經系統惡性腫瘤，目前的治療方式雖能提高患者生存率，但總體效果不佳。因此，尋找高效、低毒的新型抗膠質瘤化合物是目前膠質瘤研究領域的熱點。本研究發現，DAS 通過激活Akt/mTOR 信號通路抑制自噬，進而抑制膠質瘤細胞增殖并誘導其凋亡。

DAS 是防己科蝙蝠葛屬藤本植物蝙蝠葛的干燥根莖，即中藥北豆根的成分之一。近年來隨著DAS抗腫瘤的研究不斷深入，WANG 等[10]發現DAS 可以通過靶向MEK1/2 激酶抑制食管鱗狀細胞癌的生長。HUANG 等[11]發現DAS 介導HAKAI 蛋白穩定性，抑制膀胱癌的血管生成和上皮間質轉化。ZHANG等[12]研究表明，DAS可以使RhoA/ROCK2介導的Akt和ERK-p38 MAPK 信號通路失活，抑制肝癌血管生成。但DAS 在膠質瘤中的作用和機制不甚明確。本研究發現隨著DAS 濃度升高，膠質瘤細胞增殖受抑制，凋亡率升高，同時促凋亡蛋白Bax 表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，表明DAS 有潛在的抑制膠質瘤作用。

近年來研究發現，凋亡與自噬相互調控、相互影響，抑制自噬會促進細胞凋亡[13-14]。細胞內正常水平的自噬對清除細胞中聚集蛋白與受損細胞器至關重要，自噬功能缺陷會導致受損蛋白與細胞器在細胞內過度積累，后者會產生細胞毒性導致細胞凋亡[15]。同時，自噬也是清除胞質內受損線粒體的主要途徑[16]。抑制自噬導致受損線粒體在胞質內堆積與ROS 水平上升，促發細胞發生氧化應激，誘導細胞凋亡[17]。ZHANG 等[18]研究表明，異甘草素通過p38/MAPK 軸抑制自噬，促進胰腺癌細胞死亡。重樓皂甙Ⅱ通過mTOR 途徑抑制自噬，誘導肺癌細胞凋亡[19]。自噬不僅在維持細胞生長發育中扮演重要角色，同時在腫瘤的生長和轉移中發揮至關重要的調控作用[20-21]。LC3 是自噬的標志性蛋白，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉變或LC3-Ⅱ表達增加都被認為是自噬激活的標志[22]。本研究發現，DAS 干預后膠質瘤細胞LC3-Ⅱ表達升高。自噬降解底物蛋白p62 能與LC3結合選擇性地進入自噬體，通過溶酶體介導的自噬途徑被降解[23]。本研究檢測p62 蛋白表達發現，DAS處理后膠質瘤細胞p62 蛋白表達升高，表明DAS 抑制膠質瘤細胞自噬。同時，透射電鏡結果發現DAS組膠質瘤細胞自噬囊泡增加，進一步證實DAS 抑制自噬囊泡晚期的降解過程。綜上所述，本研究提示DAS 可能通過抑制自噬，誘導細胞凋亡。

Akt/mTOR 信號通路在心血管疾病[24]、氧化應激[25]、腫瘤等[26]多種疾病中發揮重要的自噬調節作用。當該通路以磷酸化形式激活時，會抑制自噬的發生[27]。有研究表明，三七皂苷R1 通過激活Akt/mTOR 信號通路，調控缺血心肌脂質代謝[28]。蛋白激酶N2 通過抗氧化應激和激活mTOR，降低過氧化氫誘導的PC12 細胞損傷和凋亡[29]。m6A 脫甲基酶ALKBH5 介導的DDIT4-AS1 通過激活mTOR，維持胰腺癌細胞干性，降低化療敏感性[30]。以上研究均表明Akt/mTOR 信號通路在自噬中扮演重要角色。同樣本研究發現DAS 干預后，膠質瘤細胞p-Akt 和pmTOR 蛋白表達顯著升高，提示DAS 抑制自噬的分子機制可能與Akt/mTOR 信號通路有關。

綜上所述，本研究證實了DAS 對膠質瘤的抗腫瘤作用。DAS 抑制膠質瘤細胞活力和增殖，并促進其凋亡，其機制可能與DAS 上調Akt/mTOR 信號通路，抑制自噬有關。但本研究僅在細胞水平驗證DAS 對膠質瘤細胞的作用，在動物模型中是否存在同樣的作用和機制，有待進一步深入研究。