基于網絡藥理學和分子對接技術的金卷升板膠囊治療血小板減少癥作用機制探討*

楊 琳，于 靜，楊繼章，劉愛霞，張彥景，劉 琰，王玲嬌△

（1.河北醫科大學第一醫院，河北 石家莊 050031； 2.清華大學附屬北京清華長庚醫院·清華大學臨床醫學院臨床藥物試驗中心，北京 100084； 3.河北省邯鄲市第四醫院，河北 邯鄲 056200）

金卷升板膠囊是依據河北醫科大學第一醫院協定處方制成的院內制劑，擬申報注冊，主治原發性免疫性血小板減少癥。由黃芩、茜草、白術、紫草、地錦草、卷柏、山藥、大黃、金銀花等10味中藥材組方，具有清熱解毒、涼血止血、通經止血、升血小板等功效［1］。中藥復方的療效通過多種有效成分間的共同作用，通過多環節、多靶點、多步驟共同發揮作用，與血小板減少癥多因素的致病機制切合，故采用中藥治療血小板減少癥越來越受到重視。以往研究集中于金卷升板膠囊的臨床前研究［2-6］，本研究中基于網絡藥理學及分子對接技術探討其治療血小板減少癥的作用機制，為臨床研究提供理論基礎。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 活性成分與靶點收集

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP），https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php/）檢索金卷升板膠囊中黃芩、茜草、白術、紫草、地錦草、卷柏、山藥、大黃、金銀花的化學成分，篩選條件為口服生物利用度（OB）≥30%且藥物相似性（DL）≥0.18。利用TCMSP數據庫獲得金卷升板膠囊中每個成分對應的靶蛋白，導入UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/），獲取每個靶蛋白所對應的靶基因，合并去重。采用Cytoscape 3.9.1軟件，構建成分-靶點網絡，即為金卷升板膠囊的潛在作用靶點。

1.2 成分-靶點網絡構建

以Thrombopenia 為關鍵詞，在GeneCards 數據庫（https：// www.genecards.org/）中檢索及篩選靶點基因，得到血小板減少癥的疾病靶點，利用Venny 2.1 平臺與金卷升板膠囊的潛在作用靶點取交集，獲得金卷升板膠囊治療血小板減少癥的共有靶點，保留對靶點集具有調控作用的化學成分，作為金卷升板膠囊治療血小板減少癥的活性成分。將活性成分和共有靶點導入Cytoscape 3.9.1 軟件，構建金卷升板膠囊治療血小板減少癥的成分-靶點網絡。

1.3 基因本體論（GO）功能分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將共有靶點導入Metascape數據庫（https：//metascape.org/ gp/ index.html#/ main/ step1），對靶點的GO 功能及KEGG 通路進行富集分析。以P< 0.05 為篩選條件，獲得金卷升板膠囊治療血小板減少癥的GO 與KEGG富集分析結果。

1.4 蛋白-蛋白相互作（PPI）網絡構建

將共有靶點上傳至String 數據庫（https：// string -db.org/），選擇物種為人類，設置confidence > 0.7，獲得靶點間的互作關系，得到金卷升板膠囊治療血小板減少癥的PPI網絡，并確定金卷升板膠囊治療血小板減少癥的前30個核心靶點。

1.5 關鍵靶點的分子對接驗證

通過分子對接技術分析金卷升板膠囊關鍵成分與關鍵靶點的相互作用。選擇網絡中篩選出的重要化合物和核心靶點進行后續的分子對接分析。通過UniProt數據庫查找所選基因對應的蛋白質。對應蛋白的三維結構通過RCSB PDB 數據庫（https：// www.rcsb.org/）進行下載，配體分子的結構通過PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）進行下載，并借助ChemDrew 3D 軟件進行能量最小化處理和輸出三維結構［7］。利用Autodock Vina 軟件對蛋白質進行脫水、加氫、電荷計算等。設置小分子配體結合的活性口袋位點為受體蛋白對接位點。利用Autodock Vina 軟件將所選受體蛋白與金卷升板膠囊活性成分的小分子配體進行分子對接，并用PyMOL 2.5.0軟件進行可視化分析。

2 結果

2.1 活性成分及靶點

對TCMSP 數據庫中金卷升板膠囊所有化學成分及其相關靶點進行檢索，按OB ≥30%和DL ≥0.18 的標準篩選，共獲得化學成分94個；化學成分對應的藥物作用靶點經去重后獲得236個潛在作用靶點。詳見圖1。

圖1 金卷升板膠囊的成分-靶點網絡Fig.1 Component - target network of Jinjuan Shengban Capsules

2.2 藥物活性成分-疾病靶點網絡的構建

通過GeneCards 數據庫收集到血小板減少癥相關靶點4 356 個，利用Venny 2.1 平臺將金卷升板膠囊成分的潛在作用靶點與血小板減少癥疾病靶點取交集，共獲得159個共有靶點，詳見圖2。將金卷升板膠囊的化學成分與共有靶點相對應，獲得88個對靶點具有潛在作用的活性成分，導入Cytoscape 3.9.1軟件中構建成分-靶點網絡（圖3）。對活性成分進行拓撲分析，度值排名前3 位的分別為槲皮素（度值226）、山柰酚（度值72）和β-谷甾醇（度值64）。

圖2 藥物活性成分-疾病靶點維恩圖Fig.2 Venn diagram of active ingredients - disease targets

2.3 PPI 網絡

將金卷升板膠囊的抗血小板減少癥靶點數據導入String 數據庫，構建基因靶點的PPI 網絡（圖4）。節點度值越高，表明靶點間的相關性越好。選擇度值排名前30的靶點作為核心靶點，詳見圖5。

圖4 金卷升板膠囊治療血小板減少癥基因靶點的PPI網絡Fig.4 PPI network of gene targets of Jinjuan Shengban Capsules in the treatment of thrombopenia

圖5 金卷升板膠囊治療血小板減少癥度值排名前30的核心靶點Fig.5 Top 30 key targets of Jinjuan Shengban Capsules in the treatment of thrombocytopenia in terms of degree values

2.4 GO 功能富集分析

利用Metascape數據庫對159個共有靶點進行GO功能富集分析，以P<0.05為篩選條件，并根據其P值的順序列出前20條結果（圖6）。結果顯示，金卷升板膠囊治療血小板減少癥與對無機物質的反應、對外源性刺激的反應、對激素的反應、對脂多糖的反應、對細胞遷移的正調節等過程有關。

圖6 金卷升板膠囊治療血小板減少癥的GO功能富集分析結果Fig.6 GO enrichment analysis results of Jinjuan Shengban Capsules in the treatment of thrombopenia

2.5 KEGG 通路富集分析

利用Metascape數據庫對159個共有靶點進行KEGG通路富集分析，以P<0.05為篩選條件，并根據其P值的順序列出前20 條（圖7 至圖9）。結果顯示，金卷升板膠囊治療血小板減少癥主要涉及癌癥通路、糖尿病并發癥中的晚期糖基化終末產物-晚期糖基化終末產物的多配體受體（AGE-RAGE）信號通路、脂質和動脈粥樣硬化信號通路等。

圖7 金卷升板膠囊治療血小板減少癥的KEGG通路富集分析結果Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis results of Jinjuan Shengban Capsules in the treatment of thrombocytopenia

注：紅色的節點代表金卷升板膠囊治療血小板減少相關的靶點。圖9同。圖8 KEGG通路富集分析中癌癥通路Note：the red nodes refers to the targets related to Jinjuan Shengban Capsules in the treatment of thrombocytopenia（for Fig.8 - 9）.Fig.8 Cancer pathway in KEGG pathway enrichment analysis

圖9 KEGG通路富集分析中脂質和動脈粥樣硬化信號通路Fig.9 Lipids and atherosclerosis signaling pathways in KEGG pathway enrichment analysis

2.6 活性化合物和關鍵蛋白的分子對接驗證

選擇槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇3個重要化合物，以及度值排前3 位的靶點TP53，AKT1，JUN 作為核心靶點進行分子對接分析。分子對接結果表明，槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇與TP53，AKT1，JUN 的最小結合能均小于-5.0 kcal/mol，結合力良好。詳見圖10至圖11。

圖10 藥物活性成分與核心靶點分子對接結果熱圖Fig.10 Heat map of molecular docking results of active ingredients and key targets

A1.TP53 - 槲皮素 A2.TP53 - 山柰酚 A3.TP53 - β - 谷甾醇 B1.AKT1 - 槲皮素 B2.AKT1 - 山柰酚 B3.AKT1 - β - 谷甾醇 C1.JUN - 槲皮素 C2.JUN - 山柰酚 C3.JUN - β - 谷甾醇圖11 藥物活性成分與核心靶點分子對接構象圖A1.TP53 - quercetin A2.TP53 - kaempferol A3.TP53 - β - sitosterol B1.AKT1 - quercetin B2.AKT1 - kaempferol B3.AKT1 - β - sitosterol C1.JUN - quercetin C2.JUN - kaempferol C3.JUN - β - sitosterolFig.11 Conformational map of molecular docking of active ingredients and key targets

3 討論

金卷升板膠囊方中，金銀花為君藥，具有涼血化瘀、解熱止血、調節免疫等功效；黃芩為臣藥，具有凝血排毒、調節免疫等功效；地錦草為佐藥，具有涼血散血、解毒止痢等功效。金卷升板膠囊能解毒散瘀、清熱涼血、止血通絡，主治各種血小板減少癥［8-10］。

本研究中采用網絡藥理學和分子對接技術探討了金卷升板膠囊治療血小板減少癥的有效活性成分、核心作用靶點與潛在作用機制。共獲得88 個金卷升板膠囊治療血小板減少癥的活性成分，其中度值排序前3 位的為槲皮素、山柰酚和β- 谷甾醇。梁明露［11］研究認為，槲皮素可能通過抑制磷脂酰肌醇- 3 - 激酶- 絲氨酸- 蘇氨酸蛋白激酶B - 糖原合成酶激酶3β（PI3K - AKT - GSK3β）、絲裂原激活蛋白激酶-細胞外信號調節激酶1 / 2（MAPK - ERK1 / 2）、脾酪氨酸激酶- 磷脂酶Cγ2（Syk - PLCγ2）通路，抑制血小板的聚集、釋放、黏附和擴展，從而發揮抗血小板作用。山柰酚具有抗炎、調節免疫等作用。β- 谷甾醇能調節免疫失衡，降低炎性因子水平［12］。為明確共有靶點間的相互作用，構建PPI 網絡，并對構建的網絡進行拓撲分析，篩選出了前30 個基因靶點。其中，AKT1在血小板激活通路中發揮重要作用，可對血小板活化產生影響［13］。JUN 是異二聚體轉錄因子AP - 1 的主要組成部分，也是細胞增殖和凋亡的關鍵驅動因素。各種生長因子、細胞因子和應激刺激c - JUN 的激活，進而調節生物過程。任曉梅等［14］研究發現，JUN基因對血小板減少癥的病情進展具有預測能力，可能通過調節腫瘤壞死因子（TNF）信號通路而發揮生物學作用。黃偉等［15］研究認為，TP53 可能是治療血小板減少癥的關鍵基因。因此，選擇這3 個基因作為關鍵靶點與活性成分進行分子對接。

通過GO 功能富集分析發現，金卷升板膠囊對血小板減少癥的治療作用與對無機物質的反應、對外源性刺激的反應、對激素的反應、對脂多糖的反應、對細胞遷移的正調節等過程有關。通過KEGG 通路富集分析發現，金卷升板膠囊治療血小板減少癥的靶點顯著富集于癌癥通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、脂質和動脈粥樣硬化信號通路，顯示金卷升板膠囊通過以上多個通路來發揮治療血小板減少癥的作用。其中，抗癌通路中的PI3K/ AKT 信號通路可抑制細胞增殖和促進細胞凋亡，進一步推測其通過此通路來調控B 淋巴細胞和T 淋巴細胞的增殖、凋亡、分化，促進T淋巴細胞亞群數量與功能的平衡，影響相關細胞因子白細胞介素2、白細胞介素10、轉化生長因子-β1的分泌，以減少抗血小板自身抗體的產生。研究顯示，PI3KAKT 通路通過調節血小板自噬能力而發揮血小板保護作用［16］。前列腺素可能通過調節PI3K/AKT磷酸化來抑制血小板的活化和聚集，從而改善血小板減少癥患者出現的前列腺素水平升高和血小板活化聚集度降低［17］。AGE-RAGE 信號通路與血管損傷和炎性反應有關，該信號通路中的炎性因子TNF 和白細胞介素18與血管損傷有關。而炎性因子可被認為是血小板減少癥中血小板活化和免疫失衡的誘導劑［18-19］。分子對接結果表明，金卷升板膠囊中槲皮素、山柰酚和β- 谷甾醇與TP53，AKT1，JUN 這3 個靶蛋白的親和力較強，可認為其構象穩定，并具有結合活性，但其結果的可靠性還需深入研究，并佐以生物實驗回證。

本研究中初步探討了金卷升板膠囊治療血小板減少癥的作用機制，并為其臨床研究提供了理論依據。但存在一定局限性，研究使用的數據庫內容及軟件功能還不全面，有待補充及完善。利用計算機模擬分子間的相互結合來驗證藥物活性成分作用的可靠性也需與動物實驗或細胞實驗結合來作進一步驗證。

綜上所述，金卷升板膠囊可能是通過槲皮素、山柰酚、β- 谷甾醇等關鍵活性成分，作用于TP53，AKT1，JUN 等潛在核心靶點，調控癌癥通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、脂質和動脈粥樣硬化信號通路等，從而發揮治療血小板減少癥的作用。