基于指紋圖譜和網絡藥理學的筋骨痛消液質量標志物預測*

王艷平，陳 菲，王小龍，黃 麗，王鵬飛，田 杰△

（1.寧夏回族自治區中醫醫院暨中醫研究院，寧夏 銀川 750021； 2.寧夏回族自治區中藥制劑創新工程技術研究中心，寧夏 銀川 750021）

筋骨痛消液由續斷、乳香、生桃仁、紅花、大黃、杏仁、天葵子、龍血竭、山楂、薄荷、冰片11味中藥材組方，具有活血化瘀通絡、祛寒散結止痛功效。適用于血瘀證，氣滯血瘀，肝、腎不足引起的各種脊柱退行性疾病，以及肩周炎、膝骨性關節炎等各部位骨性關節炎，臨床療效顯著。筋骨痛消液由多藥味組方，其藥味配伍關系和成分較復雜，檢測其中任何一種成分均不能代表其整體藥效，中藥復方制劑的復雜性導致中藥質量控制指標與其有效性關聯度低，且專屬性差。劉昌孝院士于2016 年首次提出質量標志物（Q-Marker）概念，旨在更好地控制中藥材和中成藥產品的質量［1］。中藥指紋圖譜作為綜合、可量化的色譜鑒定手段，能較客觀地反映全方位的物質基礎和化學成分群的整體信息，較好地體現成分的復雜性和相關性，廣泛用于整體評價藥材和制劑的質量［2-3］。網絡藥理學是基于大數據的分析平臺，通過篩選中藥材中有效化合物成分，結合相關數據庫中疾病的相關信息，篩選出藥物作用于疾病的靶點及機制網絡，行挖掘藥物作用及機制的相關數據，能直觀反映藥物與疾病的關聯程度［4-5］，揭示成分-靶點-通路網絡拓撲學關系圖可直觀反映藥物發揮藥效的特點。本研究中應用中藥指紋圖譜并結合網絡藥理學的方法，對筋骨痛消液進行質量控制，并預測筋骨痛消液中潛在的Q-Marker，為后期深入研究其作用機制和質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 Infinity 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），配有G1311B 型四元泵，G4212B 型二極管陣列（DAD）檢測器，G1316A 型柱溫箱；Quintix224 -1CN 型電子分析天平（賽多利斯科學儀器< 北京> 有限公司，精度為萬分之一）；DV215CD 型電子分析天平（美國Ohaus 公司，精度為萬分之一）；KQ-500DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

11 - 羰基-β- 乙酰乳香酸對照品（批號為111760 - 201502，純度≥99.3%），川續斷皂苷Ⅵ對照品（批號為111685-201707，純度≥90.9%），苦杏仁苷對照品（批號為110820-201808，純度≥88.2%），羥基紅花黃色素A 對照品（批號為111637-201609，純度≥91.9%），大黃酸對照品（批號為110757 - 201607，純度≥99.3%），龍血素B 對照品（批號為111558 -201407，純度≥99.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；筋骨痛消液（中試樣品，寧夏回族自治區中醫醫院暨中醫研究院制劑室提供，批號分別為20211230，20211231，20211232，20220101，20220102，20220103，20220104，20220105，20220206，20220207，20220208，20220309，20220310，20220311，20220312，20220313，20220414，編號為S1-S17）；乙腈、甲醇均為色譜純，購于美國Thermo Scientific 公司）；磷酸（色譜純，上海易恩化學技術有限公司）；甲酸（色譜純，天津市大茂化學試劑廠）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：WondaSilTMC18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時8%A～11%A，10～30 min時11%A～15%A，30～70 min 時15%A～42%A，70～100 min 時42%A～57%A，100～110 min 時57%A～85%A，110～125 min 時85%A～90%A，125～130 min 時90%A～8%A；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；記錄時間：130 min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

分別取各對照品適量，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）使溶解，加甲醇定容，搖勻，作為對照品貯備液。取對照品貯備液適量，制成質量濃度分別為11-羰基-β-乙酰乳香酸0.118 mg/mL、川續斷皂苷Ⅵ0.331 mg/mL、苦杏仁苷0.396 mg/mL、羥基紅花黃色素A 0.153 mg/mL、大黃酸對照品0.785 mg/ mL、龍血素B 0.153 mg/ mL的混合對照品溶液。

精密量取中試樣品10 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）30 min，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

參照峰選擇：龍血竭中主要有效成分為龍血素B，其含量較高，化學性質、峰面積穩定，峰形較佳，分離度較好，保留時間適中，故選擇龍血素B為參照峰，以計算其余峰的相對峰面積和相對保留時間。

精密度試驗：取同批樣品適量，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄色譜圖，以峰27（龍血素B）作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.13%（n= 6），相對峰面積的RSD均小于2.32%（n= 6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同批樣品6 份，按2.2 項下方法分別制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以峰27（龍血素B）作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.19%（n= 6），相對峰面積的RSD均小于2.62%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同批樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，24，36，48 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以27 號峰（龍血素B）作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.79%（n=7），相對峰面積的RSD均小于2.60%（n=7），表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.4 指紋圖譜建立

指紋圖譜建立：取17 批（編號為S1-S17）樣品，適量依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，將所得圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012A 版），選擇供試品溶液（編號為S6 號）圖譜為參照圖譜，采用平均數法，時間窗設為0.1，進行全峰匹配，得到17 批樣品的高效液相色譜疊加指紋圖譜。詳見圖1。

圖1 17批筋骨痛消液高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of 17 batches of Jingu Tongxiao Tincture

相似度分析：將17批（編號為S1-S17）樣品的指紋圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012A版），計算相似度。結果相似度分別為0.988，0.995，0.995，0.997，0.998，0.998，0.997，0.989，0.996，0.999，0.995，0.998，0.981，0.993，0.987，0.989，0.992，均大于0.980，表明各批次樣品的相似度良好，共有成分基本一致，制劑質量穩定、均一。

共有峰指認及歸屬：按2.2項下方法制備混合對照品溶液和供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。經Mark峰匹配后，共標定29個共有峰（圖2），通過對比供試品溶液色譜峰和混合對照品溶液色譜峰的保留時間及DAD 光譜圖（圖3 至圖4），對供試品溶液色譜圖中的共有峰進行歸屬，確認6 個指紋峰。其中，2號峰為苦杏仁苷，5號峰為羥基紅花黃色素A，18號峰為川續斷皂苷Ⅵ，24 號峰為大黃酸，27 號峰為龍血素B，29號峰為11-羰基-β-乙酰乳香酸。

圖2 17批筋骨痛消液高效液相色譜圖共有模式Fig.2 Common patterns of HPLC chromatograms of 17 batches of Jingu Tongxiao Tincture

2.苦杏仁苷 5.羥基紅花黃色素A 18.川續斷皂苷Ⅵ 24.大黃酸 27.龍血素B 29.11 - 羥基- β-乙酰乳香酸圖3 混合對照品溶液高效液相色譜圖2.Amygdalin 5.Hydroxysafflor yellow A 18.Asperosaponin Ⅵ 24.Rhein 27.Loureirin B 29.Acetyl - 11 - keto - β - boswellic acidFig.3 HPLC chromatogram of the mixed reference solution

A，C，E，G，I，K.對照品溶液（苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A、川續斷皂苷Ⅵ、大黃酸、龍血素B、11 - 羰基- β - 乙酰乳香酸）B，D，F，H，J，L.供試品溶液（苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A、川續斷皂苷Ⅵ、大黃酸、龍血素B、11 - 羰基- β - 乙酰乳香酸）圖4 共有峰DAD光譜圖A.C，E，G，I，K.Reference solution（amygdalin，hydroxysafflor yellow A，asperosaponin Ⅵ，rhein，loureirin B，acetyl - 11 - keto - β - boswellic acid）B.D，F，H，J，L.Test solution（amygdalin，hydroxysafflor yellow A，asperosaponin Ⅵ，rhein，loureirin B，acetyl - 11 - keto - β - boswellic acid）Fig.4 DAD spectrograms of common peaks

2.5 網絡藥理學預測分析

2.5.1 基于可測性和可溯性的候選化合物的活性成分靶點收集

11-羰基-β-乙酰乳香酸能活血、行氣、生肌、解毒、消腫、止痛，具有良好的抗炎鎮痛效果［6-7］；川續斷皂苷Ⅵ可明顯減輕骨關節炎軟骨損傷及骨關節炎軟骨的炎性反應，作用機制可能與上調miR-19a 的表達進而激活人性別決定區Y 框蛋白（SOX9）mRNA 及蛋白、抑制核因子κB（NF-κB）mRNA 及蛋白有關，且能誘導小鼠骨髓間充質干細胞定向分化為成骨細胞［8-9］；羥基紅花黃色素A可促進人骨髓間充質干細胞的成骨分化，有利于壞死股骨頭骨組織的修復，對激素性股骨頭缺血性壞死有較好的治療效果，還具有一定鎮痛作用［10-13］；大黃酸能抑制骨關節炎滑膜中炎性細胞的增生，減少軟骨Ⅱ型膠原蛋白細胞的丟失，抑制和延緩軟骨細胞凋亡，并能激活骨骼肌組織中相關通路，顯著延長肥胖小鼠的力竭運動距離和時間，增加其抗疲勞性，改善運動耐力［14-16］；苦杏仁苷能有效抑制關節炎模型大鼠外周血中炎性因子及滑膜蛋白的表達，干擾對關節滑膜的損傷，起到抗炎鎮痛和保護軟骨作用［17-18］。結合筋骨痛消液的組方及功能主治，上述成分均可得到指認和測定，且具有可溯性，通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）、PubChem、Swiss Target Predict等，共得到苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A、川續斷皂苷Ⅵ、大黃酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸5個候選化合物相關的146個作用靶點。龍血竭為方中佐藥，其主要成分龍血素B未納入候選化合物。

2.5.2 疾病靶點數據集建立

以“osteoarthritis”為關鍵詞，檢索OMIM，TTD，Gene-Cards 數據庫自建庫起至2022 年5 月9 日的相關信息，去重后共獲得疾病靶點1 512 個。利用Venny 2.1 在線作圖工具平臺，輸入146 個藥物靶點、1 512 個疾病靶點，繪制維恩圖，取交集后獲得藥物- 疾病共有靶點50個，詳見圖5。

圖5 5種化合物-骨關節炎靶點維恩圖Fig.5 Venn diagram of five compound - osteoarthritis targets

2.5.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡構建

利用STRING 數據庫（https：// string - db.org/）構建PPI 網絡，導入篩選的50 個共有靶點，選擇物種為“Homosapiens”，最低相互作用閾值為0.4，詳見圖6。將得到的數據用.tsv格式導入Cystoscap 3.8.2軟件中，通過NetworkAnalyzer 工具進行拓撲分析，根據度值大小排序，選取度值大于平均分的基因作為核心靶點進行排序，使用R 4.0.5 軟件繪制條形圖，詳見圖7。結果顯示，筋骨痛消液治療骨關節炎的核心靶點包有白蛋白（ALB）、JUN、酪氨酸激酶（SRC 蛋白）、環加氧酶2（PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等有關。

圖6 筋骨消痛液治療骨關節炎的PPI網絡Fig.6 PPI network of Jingu Tongxiao Tincture in the treatment of osteoarthritis

圖7 基于PPI拓撲分析的核心靶點排序Fig.7 Sorting of key targets based on PPI topology analysis

2.5.4 基因本體論（GO）功能富集分析

利用David 數據庫對上述獲得的共有靶點進行GO功能富集分析，包括生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF），各篩選前10 條重要通路，并使用R 語言對富集結果進行可視化，選取每部分P值排名前10 的通路繪制氣泡圖，詳見圖8。結果顯示，交集基因富集至197條BP、35條CC、64條MF相關的過程中。其中，BP包括蛋白質水解（proteolysis）、膠原分解代謝過程（collagen catabolic process）、MAPK 活性負調控（negative regulation of MAP kinase activity）等；CC 包括細胞外區（extracellular region）、細胞外間隙（extracellular space）、ficolin-1-rich顆粒腔（ficolin-1-rich granule lumen）等；MF 包括絲氨酸型內肽酶活性（serine - type endopeptidase activity）、酶結合（enzyme binding）、MAPK 活性（MAP kinase activity）等。

圖8 筋骨痛消液治療骨關節炎的GO富集分析P值排名前10的通路氣泡圖Fig.8 Bubble chart of the pathway with the top 10 P - value ranking in GO enrichment analysis for Jingu Tongxiao Tincture in the treatment of osteoarthritis

2.5.5 京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

利用David 數據庫進行KEGG 通路富集分析，設置P<0.01，選取P值排名前20 的通路繪制KEGG 通路富集的氣泡圖（圖9），各通路富集靶點見表1。將50 個共有靶點經David 數據庫KEGG 通路富集分析后，共得到90 條KEGG 通路。- log10（P- value）代表富集的顯著性，顏色越紅，顯著性越高。結果顯示，筋骨痛消液治療骨關節炎與脂質和動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、松弛素（Relaxin signaling pathway）、白細胞介素17（IL - 17 signaling pathway）、破骨細胞分化（Osteoclast differentiation）、凋亡（Apoptosis）、C 型凝集素受體信號通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、Th17 細胞分化（Th17 cell differentiation）等信號通路相關。

表1 KEGG通路富集分析筋骨痛消液治療骨關節炎P值排名前20的通路富集靶點Tab.1 Target genes of the pathway with the top 20 P - value ranking in KEGG pathway enrichment analysis for Jingu Tongxiao Tincture in the treatment of osteoarthritis

2.5.6 成分-靶點-通路網絡構建及Q-Marker 分析

將筋骨痛消液中5個化合物、對應的核心靶點和通路導入Cystoscap 3.8.2 軟件，構建成分- 靶點- 通路網絡（圖10）。結果顯示，11-羰基-β-乙酰乳香酸（度值25）、川續斷皂苷Ⅵ（度值21）、羥基紅花黃色素A（度值19）、大黃酸（度值19）、苦杏仁苷（度值21）與各靶點連接度較高，表明上述5種成分可能為筋骨痛消液主要活性成分潛在的Q -Marker。ALB（度值38）、JUN（度值28）、SRC（度值27）、雌激素受體1（ESR1，度值24）、PTGS2（度值21）、膜聯蛋白A5（ANXA5，度值19）、MAPK14（度值18）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG，度值18）、MAPK8（度值17）、一氧化氮合酶（NOS3，度值17）等核心靶點，通過作用于脂質和動脈粥樣硬化、松弛素、IL - 17、破骨細胞分化、細胞凋亡、C 型凝集素受體、Th17 細胞分化、MAPK、Toll 樣受體、T 淋巴細胞受體、轉化生長因子-β（TGF-β）、NOD 樣受體等信號通路，共同影響膝骨關節炎及骨質疏松的發生與發展。

圖10 筋骨痛消液治療骨關節炎的成分-靶點-通路網絡Fig.10 Component - target - pathway network of Jingu Tongxiao Tincture in the treatment of osteoarthritis

3 討論

本研究中分別考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液及乙腈-0.1%甲酸水溶液4 種不同流動相下色譜峰的分離情況。結果發現，甲醇- 水、乙腈- 0.1%甲酸水溶液作為流動相時指紋圖譜色譜峰的峰形較差，分離度不好；乙腈- 0.1 %磷酸水溶液作為流動相時色譜峰分離效果較乙腈- 水好，且基線較平穩，故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫。分別于210，220，230，240，250，260，270 nm 波長處進行測定，發現210 nm 和220 nm 波長處指紋圖譜的色譜峰多，但220 nm 波長處出峰更穩定，分離度好，基線平穩，故選擇檢測波長為220 nm。考察了柱溫（25，30，35 ℃），流速（0.8，1.0，1.2 mL/min），以及不同類型色譜柱［WondaSilTMC18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），Luna?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent Eclipse-Plus C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）］對色譜行為的影響。最終確定2.1項下色譜條件。

通過建立筋骨痛消液指紋圖譜色譜條件，對17 批筋骨痛消液高效液相色譜指紋圖譜相似度進行評價，共標定了29 個共有峰，并對6 個峰的成分進行指認和歸屬，并運用網絡藥理學預測了11-羰基-β-乙酰乳香酸、川續斷皂苷Ⅵ、羥基紅花黃色素A、大黃酸、苦杏仁苷5 個Q-Marker。本研究中利用網絡藥理學的方法闡述了筋骨痛消液治療骨關節炎的潛在作用機制。PPI網絡結果顯示，不同靶點間存在密切的相互作用，更易產生級聯效應。上述靶點對應于筋骨痛消液中的多個組成部分，這一點充分體現了中藥多靶點、多組分的特點。通過度值篩選發現，ALB，JUN，SRC，ESR1，PTGS2，ANXA5，MAPK14，PPARG，MAPK8，NOS3 等具有較高度值，位于靶點間相互作用網絡的核心位置，可能是骨關節炎的易感基因。指紋圖譜作為質量控制的手段，還需結合多指標成分的含量測定、出膏率、大類成分含量測定等方法對經典名方的質量進行全方位控制。

綜上所述，本研究中建立的筋骨痛消液高效液相色譜指紋圖譜對制劑的整體質量進行把控，為全面控制其質量提供了科學依據；結合網絡藥理學研究結果，筋骨痛消液能作用于軟骨細胞、滑膜細胞等與骨關節炎的發生、發展密切相關的細胞；同時，筋骨痛消液具有多靶點、多通道的特點，對骨性關節炎有較好的治療作用；其中，11 - 羰基-β- 乙酰乳香酸、川續斷皂苷Ⅵ、羥基紅花黃色素A、大黃酸、苦杏仁苷5 個成分均具有傳遞性和溯源性，初步預測可作為筋骨痛消液的潛在Q - Marker。未來研究中需開展基礎研究進行驗證，進一步明確筋骨痛消液Q - Marker 的準確性。